专利名称：一种抑制耐药基因盒整合的siRNA序列的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及SiRNA双链序列，具体为一种抑制耐药基因盒整合的SiRNA序列。
背景技术：
整合子是细菌基因组中的可移动遗传物质，具有特异重组位点，可将许多耐药基因盒(resistance gene cassette)整合在一起，从而形成多重耐药。基因盒是一种可动遗传因子(mobile genetic element)，目前发现了超过60种基因盒，它们均为抗菌耐药基因盒。一个整合子可捕获一个或多个耐药基因盒。基因盒在整合酶的催化下，可以被整合到整合子的启动子下游的attl位点上。整合酶在整合子中起重要作用，整合酶可以催化耐药基因盒的整合和剔除，使得耐药基因盒在不同的整合子中进行重新的组合。一个基因盒可以含有一个或者多个耐药基因。同时，一个整合子内可以含有多个耐药基因盒，所以一个整合子的结构可以介导多种耐药性。由于整合子结构存在于多种细菌中，特别是致病菌和临床菌株，整合酶使得不同耐药基因在同种细菌和不同细菌中传播从而逐渐增强了细菌的耐药性并且利于细菌向耐药的方向进化。在位于整合子5'保守区域的启动子的作用下，整合子中的耐药基因盒得以表达。在启动子的作用下，耐药基因基因盒的表达不仅依赖启动子的强弱，而且与距离启动子的远近有关。当基因盒直接位于5'保守末端时，表达水平最强，而下游的基因盒表达水平较弱，且同一个基因盒在同一个整合子不同位点表达水平均不同。在抗生素的选择压力下，由于整合子的整合作用，细菌能够捕获外来的耐药基因， 该系统在整合酶的催化下，将耐药基因盒整合到自身上，并加以表达。同时由于整合酶的催化整合作用及基因盒的可动性，使得耐药基因在畜禽与畜禽，畜禽与人类，人类与人类之间的病原菌上广泛的传播，这不仅为畜禽业的养殖带来巨大的损失，同时给人类的健康带来严重的威胁。一旦某些细菌对新抗生素产生抗性基因，这些抗性基因通过整合子的传递，就会形成对新抗生素的普遍抗性。这种方式获得的耐药性机率高，形成后也较稳定，是引起耐药性散播的主要原因。因此，对整合酶及耐药基因盒的表达调控因子进行研究，寻找沉默其基因表达的方法对控制和解决整合子引起的耐药问题具有重大意义。基因沉默主要发生在两种情况一种是转录水平上的基因沉(TGS)；另一种是转录后基因沉默(PTGQ。RNA干扰是指双链RNA(dsRNA)在细胞内特异性地诱导与之同源互补的mRNA的降解，使相应基因的表达关闭，从而引发基因转录后水平沉默的现象。虽然在不同的有机体内有着细节性的差别，RNAi的作用机制是高度保守的，通常包含两个阶段: 1)起始阶段内源性或外源性dsRNA被酶识别并切割成为片断大小在21-23nt的小干扰 RNA(siRNA) ；2)效应阶段siRNA与核酸酶复合物结合，形成RISC(RNA诱导沉默复合体)， 后者具有核酸内切酶活性，特异性的降解siRNA通过碱基互补原则识别的同源靶mRNA。整合子在细菌耐药基因的水平转移过程中起着相当重要的作用。RNAi是一种非常有用的基因敲除(gene knockout)方法，具有高特异性、高速性、高稳定性、高效性等优点。因此，采用 RNAi技术来沉默整合酶可以在一定程度上阻断细菌耐药基因的传播，防止细菌耐药性的继续发展。同时，通过RNAi技术干扰整合子中耐药基因的表达，从而减弱细菌的耐药性，这在临床治疗和新型药物的研究开发具有重要意义。RNAi的研究主要集中在真核生物基因功能调节及基因功能研究方面，此外，在医学领域用于基因治疗、抑制有害基因的表达、抗病毒治疗(HIV等)、肿瘤癌症的缓解和消除等方面。国内目前尚未见siRNA技术用于原核生物的报道。
发明内容
本发明就是为了解决如今日益严峻的整合子所导致的耐药性问题，利用RNA干扰技术而设计了一种siRNA序列，将其导入耐药菌菌株沉默和干扰整合子系统中整合酶基因对耐药基因盒的捕获及耐药基因的表达。整合酶整合效率检测方法对siRNA的干扰效率进行评估。最终达到通过siRNA控制和消除整合子引起的病原微生物耐药问题。达到降低整合子整合耐药基因盒的效率的目的。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种抑制耐药基因盒整合的siRNA序列，该序列为下述序列中的任意一条或一条以上siRNAl 靴序列 GCACATGCGTGTAAATCAT正义链(5‘ -3' )5' -GCACAUGCGUGUAAAUCAU dTdT-3‘反义链(3' -5' )3' -dTdT CGUGUACGCACAUUUAGUA-5‘
siRNA2 靴序列 GCTGAAAGGTCTGGTCATA正义链(5' -3' )5' -GCUGAAAGGUCUG⑶CAUA dTdT-3‘反义链(3' -5' )3' -dTdT CGACUUUCCAGACCAGUAU-5‘上述序列中，最适宜的用于抑制耐药基因盒整合的siRNA序列为 siRNAl siRNAl 靶序列 GCACATGCGTGTAAATCAT正义链(5' -3' )5' -GCACAUGCGUGUAAAUCAU dTdT-3‘反义链(3‘ -5' )3' -dTdT CGUGUACGCACAUUUAGUA-5‘本发明所提供的抑制耐药基因盒整合的siRNA序列由靶序列、正义链和反义链组成，它的靶序列由19个核苷酸组成，正义链序列和反义链序列均由21个核苷酸组成，正义链序列的方向从左至右为5'端至3'端，反义链从左至右为3'端至5'端。自5'端的第 1至第19位均为核糖核苷酸，第20位至第21位的核苷酸均为脱氧核糖核苷酸。本发明是以已经检测的整合子介导的耐药病原菌株为基础，通过生物信息学的方法分析整合酶和耐药基因空间结构，设计相关小分子干扰RNA(SiRNA)干扰整合酶及耐药基因盒启动子至翻译起始位点部分，分别干扰整合酶基因和耐药基因的表达。在一定条件下将设计的siRNA导入耐药菌株沉默和干扰整合子中整合酶基因对耐药基因盒的捕获及耐药基因的表达。通过RT-PCR定量相关mRNA、细菌耐药性检测和整合酶整合效率检测等方法对siRNA的干扰效率进行评估。最终通过本发明所提供的siRNA双链序列可达到控制和消除整合子引起的细菌耐药问题。 本发明与现有技术相比具有如下优点和有益效果本发明针对整合酶I上的基因序列设计合成一组siRNA，筛选出二对(siRNAl和 siRNA2)。该序列能有效抑制耐药基因盒的整合，从而显著降低耐药性的传播。
图1 整合实验示意图 验证能否发生整合实验，上引物设计在R388的整合酶intl 1基因上游 (889bp-908bp)处，下引物设计在重组质粒pGC系列的耐药基因盒上游，因为引物设计在两个质粒上，如果成功发生整合，PCR扩增片段就会产生。图2:接合实验示意3 =RT-PCR得到不同样品mRNA表达量的差别的相对量1号样品是空白组，2号样品是经scramble RNA处理，3号样品是经siRNAl处理， 4号样品是经siRNA2处理。图4 =RT-PCR绝对定量的标准曲线。线A指的是整合了的R388，线B指的是总R388 的拷贝数曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1 SiRNA序列的设计流程如下本实验siRNA 设计以在线(http://jura. wi. mit. edu/bioc/siRNAext/home. php) 设计软件为工具，以第一类整合酶全基因(1014bp)为靶基因，在线设计了 2对siRNA。所选取的siRNA序列中的A、G、C、U表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。合成的两对siRNA如下siRNAl :si-intl (68-87)靴序列 GCACATGCGTGTAAATCAT正义链(5‘ -3' )5' -GCACAUGCGUGUAAAUCAU dTdT-3‘反义链(3‘ -5' )3' -dTdT CGUGUACGCACAUUUAGUA-5‘siRNA2 :si-intl (239-258)靴序列 GCTGAAAGGTCTGGTCATA正义链(5‘ -3' )5' -GCUGAAAGGUCUG⑶CAUA dTdT-3‘反义链(3‘ -5' )3' -dTdT CGACUUUCCAGACCAGUAU-5‘实施例2两对RT-PCR弓丨物设计用primer premier设计软件，根据引物设计原则，以整合酶I (HQ 323314. 1)为目的基因设计合成一对引物。引物int-U 5' -GGCTTCGTGATGCCTGCTT-3 ‘和引物int_D 5' -CCGTGGTTCTGGGTTTTTGC-3 ‘。这对引物设计在R388质粒中intll片段上，用于检测总整合子的拷贝数(即包括整合了耐药基因盒后的R388质粒以及未整合入耐药基因盒的 R388质粒)。同样，用primer premier设计软件，设计一对引物，上游引物IntIb 5 ‘ -ACGAACCCAGTTGACATAAG-3 ‘设计在 R388 质粒上 int11 片段上，下游引物 aadAc 5' -TCGATGACGCCAACTAC-3'设计在pGC质粒的addAl基因盒上。此对引物用于检测共整合子(即整合了耐药基因盒后的R388质粒)的拷贝数。实施例3质粒提取将重组质粒pl84-2 (PGC) addAl和R388与E. coli共培养得到含有pl84_2addA质 coli和含有pR388的E. coli。本实验中所用到的重组质粒R388和pl84_2addA，是
从澳大利亚悉尼Macquarie大学购买。将含有R388质粒化转到E. Coli中形成供体菌，含有来源于食源性沙门氏菌的耐药基因盒pl84-2addA重组质粒分别化转到E. Coli DH5 α中形成受体菌，转化过程如图2所示。将含有pl84-2addA质粒的E. coli和含有pR388的E. coli过夜培养，然后各取 IOOul混合后，放入Iml LB中共培养，并开始添加siRNA，每过一个小时添加一次siRNA。培养8个小时之后。用由广州东盛生物科技有限公司的高纯度质粒小提试剂盒(货号m012) 提取质粒DNA。具体步骤如下(1)先用1. 5ml离心管收集l_5ml菌液。12000rpm离心lmin，弃上清。(2)加入 250ul溶液I/RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。(3)室温静置Hmin 后，加入250ul溶液II，轻柔地反复颠倒混勻5-6次。(4)再室温放置l-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。( 加入350ul溶液III，立即轻柔地反复颠倒混勻5-6 次。此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm室温离心lOmin，收集上清。将上清置于DNA纯化柱中，静置l_2min。12000rpm离心lmin，弃滤液。(6)加入500ul溶液PB，12000rpm离心lmin,弃滤液。(7)加入500ul溶液W, 12000rpm离心lmin,弃滤液。(8)加入500ul溶液W，12000rpm离心lmin，弃滤液。(9) 12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。将DNA纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加50-100ul溶液Eluent， 室温放置anin。12000rpm离心lmin，管底即为高纯度质粒DNA。实施例4相对定量RT-PCR确定siRNA具有抑制整合酶的作用，同时比较siRNAl和siRNA2 对整合酶的抑制效率。将含有pl84-2addA质粒的E. coli和含有pR388的E. coli过夜培养，然后各取 400ul混合后，将4支试管装有Iml LB,并分别向每支试管加入上述混合菌液200ul (各 IOOul)。开始向上述4支试管中分别添加水、scramble RNA、siRNAl、siRNA2，每过一个小时添加一次。共培养8个小时之后。提取质粒DNA。进行RT-PCR。RT-PCR 用的是 ABI 公司的 Power Sybr Green RNA-to-CTTMl-Step Kit 进行提取，反应体系Power Sybr Green RT-PCR Mix (2X)25. Oul, RT EnzymeMix (125 X )0. 4ul, lOumol/L 两个引物(Intlb 和 aadAc)各 2ul，模板 2ul，然后加灭菌超纯水使体积达到50ul。反应条件设置PCR反应条件，第一个循环为48°C，30min, 95°C，IOmin ；后40个循环为 95°C，15s ；60°C,lmin ；融解曲线，95°C变性 15s ；60°C退火 15s ；95°C，15s。点击运行， 进行PCR反应，反应结束，保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果。得到图3所示结果。结果显示scramble RNA，siRNAl，siRNA2以及空白组中整合酶mRNA表达量的差另|J。空白组 中的整合酶mRNA表达量最高，其次是scramble RNA, siRNA2对整合酶mRNA表达有一些抑制作用，从图2可以看出siRNAl对整合酶mRNA的表达有明显的抑制作用。与空白组相比，抑制效率高达近60%。因而选取siRNAl进行RT-PCR绝对定量实验，确定siRNAl 对整合效率的影响。实施例5RT-PCR绝对定量确定SiRNA对整合酶的抑制率。从siRNAl处理过的含有质粒的大肠杆菌，提取质粒。进行RT-PCR的绝对定量。首先进行标准曲线的制作。标准品的量是根据260nm的吸光度值并用DNA或 RNA的相对分子质量来转换成其拷贝数确定。RT-PCR用的是ABI公司的Power Sybr Green RNA-to-CTTMl-Step Kit 进行提取，反应体系Power Sybr Green RT-PCR Mix (2Χ) 25. Oul，RT Enzyme Mix (125X) 0. 4ul，lOumol/L 两个引物(int_U 和 int-D)各 2ul，模板2ul，然后加灭菌超纯水使体积达到50ul。反应条件设置PCR反应条件，第一个循环为48°C，30min, 95°C，IOmin ；后40个循环为 95°C，15s ；60°C,lmin ；融解曲线，95°C变性 15s ；60°C退火 15s ；95°C，15s。点击运行， 进行PCR反应。反应结束，保存文件。根据标准品的量与所得结果进行比较，绘制出标准曲线。如图4。然后RT-PCR绝对定量检测siRNAl整合率。同样，RT-PCR 用的是 ABI 公司的 PowerSybr Green RNA-to-CTTMl-St印Kit 进行提取，反应体系Power Sybr Green RT-PCR Mix (2 X) 25. Oul，RT Enzyme Mix (125 X) 0. 4ul，lOumol/L两个引物(Intlb和aadAc)各2ul，模板2ul，然后加灭菌超纯水使体积达到50ul。反应条件设置PCR反应条件，第一个循环为48°C，30min, 95°C，IOmin ；后40个循环为 95°C，15s ；60°C,lmin ；融解曲线，95°C变性 15s ；60°C退火 15s ；95°C，15s。点击运行， 进行PCR反应，反应结束，保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果。如果aadAl耐药基因盒未整合入R388中，引物IntIb和引物aadA。则无法扩增，反之则可以检测到扩增产物，因而可以通过绝对定量PCR得到拷贝数。荧光定量PCR绝对定量检测结果显示经过scramble siRNA处理样品的耐药基因盒整合效率为6.9X10_5，而用siRNAl处理过的样品的耐药基因盒整合效率为3.9X10_6。 说明siRNAl可以起到抑制耐药基因盒整合的作用。综上所述，本发明所述siRNAl序列可以有效抑制耐药基因盒的整合率，从而显著降低以整合子的方式进行的耐药性传播。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种抑制耐药基因盒整合的SiRNA序列，其特征在于，该序列为下述序列中的任意以一条或一条以上siRNAl 正义链(5‘ -3' )5' -GCACAUGCGUGUAAAUCAU dTdT-3‘ 反义链(3‘ -5' )3' -dTdT CGUGUACGCACAUUUAGUA-5‘ siRNA2 正义链(5‘ -3' )5' -GCUGAAAGGUCUG⑶CAUA dTdT-3‘ 反义链(3‘ -5' )3' -dTdT CGACUUUCCAGACCAGUAU-5‘。
2.根据权利要求1所述的抑制耐药基因盒整合的siRNA序列，其特征在于，该序列为 siRNAl 正义链(5‘ -3' )5' -GCACAUGCGUGUAAAUCAU dTdT-3‘ 反义链(3‘ -5' )3' -dTdT CGUGUACGCACAUUUAGUA-5‘。
全文摘要
本发明公开了一种抑制耐药基因盒整合的siRNA序列，该序列为siRNA1正义链(5′-3′)5′-GCACAUGCGUGUAAAUCAU dTdT-3′，反义链(3′-5′)3′-dTdT CGUGUACGCACAUUUAGUA-5′；siRNA2正义链(5′-3′)5′-GCUGAAAGGUCUGGUCAUA dTdT-3′，反义链(3′-5′)3′-dTdTCGACUUUCCAGACCAGUAU-5′。本发明所提供的siRNA双链序列可以抑制整合酶作用，整合酶的作用是催化耐药基因盒的捕获和整合，因此本发明所提供的siRNA双链序列能显著地降低整合酶整合效率。
文档编号C12N15/113GK102154291SQ201110006968
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者沈会平, 石磊, 阎鹤 申请人:华南理工大学