专利名称：一种具有高效转糖基β-半乳糖苷酶的新基因及应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种β -半乳糖苷酶的新基因及其重组酶和重组酶的应用。
背景技术：
低聚糖(oligosaccharides)又称寡糖，是指由2 10个单糖通过糖苷键连接而成的直链或支链的一类低度聚合糖，它是自然界存在的一类具有广谱化学结构和显著生物功能的有机化合物.低聚糖按其生理功能可分为普通低聚糖和功能性低聚糖，功能性低聚糖主要包括低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、甘露低聚糖等，具有良好的双岐杆菌活化效果、能改善便秘、降低血压血脂、增强机体免疫力等功能。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC3. 2. 1.23)，一方面，能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖；另一方面，在乳糖分子的半乳糖一侧连接1-8个半乳糖，合成低聚半乳糖 (galactooligosaccharide, G0S)。低聚半乳糖是目前各类功能性低聚糖品种中唯一源自动物乳汁中的低聚糖，具有良好的保健功能(1)广谱益生菌增值因子及与其相关的生理功能，例如促进有机酸生成使肠道PH下降抑制外源菌生长、生成大量短链脂肪酸、产生B族维生素等；(2)低甜度低热量，难被人体消化，食用后基本上不增加血糖血脂，但有润肠通便作用；(3)低龋齿性，不被引起龋齿的链球菌所利用；(4)改善脂质代谢，降低总血清胆固醇浓度，提高血清中高密度脂蛋白所占比例；(5)改善矿物元素的吸收利用，促进对钙的吸收，同时使肠道对钠的吸收有降低的倾向，而对钙的吸收有升高的倾向。因此，低聚半乳糖在食品、保健品及医药领域等方面具有广泛的应用潜力。目前，低聚半乳糖合成主要有以下几种方法(1)化学合成由于糖具有活性羟基，传统的化学合成方法因需要繁琐和高选择性的保护和去保护步骤以及保证产品具有立体化学性的困难性使该方法变得不切实际。(2)糖苷转移酶合成利用糖苷转移酶合成低聚半乳糖主要有两方面的问题，一是需要价格昂贵的底物(糖核苷)，二是糖苷转移酶来源有限、产量低、稳定性差；(3)糖苷合成酶作为糖苷水解酶的突变体合成低聚半乳糖，需要活化的氟代糖作为供体才能发生反应，价格昂贵，而天然的底物(如乳糖)无活性不能直接作为供体合成低聚乳糖。(4) β -D-半乳糖苷酶β -D-半乳糖苷酶广泛存在于动植物和微生物内，其催化的糖苷和低聚糖合成反应途径简单，不需要其它辅助因子，反应底物是价格便宜的乳糖，酶容易获得，性质稳定。但是，糖苷酶在合成反应过程中，转糖基新生成的糖苷和寡糖也可以重新被该酶作为底物水解，反应处于水解和合成的动态平衡状态，导致转糖基产物的产率仍然较低，并且还会产生许多不需要的位置同分异构体存在，给产品的分离纯化造成困难。为了打破这个平衡，利用酶反应热力学和动力学原理，加大底物的浓度，采用高浓度的有机溶剂或两相反应体系，降低水的浓度和活度，促使反应向糖苷合成的方向进行，可以提高糖苷产物的得率。与在水溶液中进行的酶催化反应相比，酶在非水相中进行催化反应有如下优越性①有利于疏水性底物的反应；②酶不溶于有机溶剂，容易回收再利用；③使反应热力学平衡从水分解反应转为其逆反应，防止依赖于水的副反应发生，如糖合成、肽合成、酯交换反应等；④能提高酶的稳定性，可扩大反应的适应范围；⑤可控制底物的专一性；⑥没有微生物污染。因此，获得能够耐有机溶剂中的β-D-半乳糖苷酶显得尤为重要。微生物作为 β -D-半乳糖苷酶合成的主要来源，从耐受有机溶剂的微生物中分离耐有机溶剂的酶是一种有效的方法，成为当前的研究热点。考虑到微生物分离培养存在明显的局限性，利用现有的技术，能被培养的微生物比例不足总数的1 %，大量未被培养或不能 被培养的微生物具有巨大的应用潜力。宏基因组方法是从未培养微生物中寻找新型功能基因和活性物质的一种重要手段，至今国内外学者已经通过该技术克隆到单加氧酶、几丁质酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶等新基因，因此该方法为发现半乳糖苷酶新基因提供了新思路。到目前为止，国内外尚未有利用宏基因组技术从海底泥中获得具有高效转糖基性能的β“半乳糖苷酶研究报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种半乳糖苷酶的新基因。本发明的第二个目的在于提供上述半乳糖苷酶的宏基因组学克隆方法。本发明的第三个目的在于提供含有上述半乳糖苷酶基因的表达载体。本发明的第四个目的在于提供利用上述表达载体构建的重组半乳糖苷酶及其制备方法。本发明的最后一个目的在于提供上述重组酯酶在将乳糖高效转化为低聚半乳糖混合物中的应用。本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的一种β-半乳糖苷酶，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明提供的上述新型β -半乳糖苷酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的一种半乳糖苷酶的宏基因组学克隆方法，提取海底泥的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切，连接到克隆载体P Δ LacZ上，电击转化大肠杆菌DH5 α高效感受态建立宏基因组文库，通过涂布含 X-gal的LB平板显色法快速筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。上述克隆载体P Δ LacZ是通过如下方法获得的用NdeI和SmaI双酶切pUC19质粒去除其中大约200bp的IacZ序列产生约2400bp无IacZ序列，胶回收并用Klenow大片段酶补平末端，用T4DNA连接酶连接并转化Ecoli DH5 α，涂布含氨苄青霉素的LB平板，挑取白斑菌落、摇菌并提取P Δ LacZ质粒。用BamHI单酶切P Δ LacZ质粒，并用碱性磷酸酶 (CIAP,TAKARA)去磷酸化制备载体，具体操作方法参照Alkaline Phosphatase (CIAP)说明书。本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的一种表达载体，所述的表达载体含有上述的半乳糖苷酶基因。本发明的第四个目的是通过如下技术方案来实现的一种重组半乳糖苷酶的制备方法，包括用上述表达载体转化表达宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组β-半乳糖苷酶。上述重组β-半乳糖苷酶的制备方法中，表达宿主细胞为大肠杆菌。上述重组β -半乳糖苷酶的制备方法，其具体过程为包括用BamHIdindIII双酶切获得目的基因并连接pET-32a(+)载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达。 所述的IPTG终浓度为0. 6-1. 8mM，诱导温度为18_37°C。本发明提供的重组半乳糖苷酶，包括用上述表达载体转化表达宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组β “半乳糖苷酶的方法和步骤。本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的本发明所述重组β-半乳糖苷酶在将乳糖高效转化为低聚半乳糖混合物中的应用。本发明的有益效果是①.本发明从海底泥样品构建好的宏基因组文库中得到一个新的β _半乳糖苷酶的DNA序列，通过基因工程技术对其功能研究，发现该序列在大肠杆菌中高效可溶表达，经蛋白纯化及SDS-PAGE电泳，得到一条单一的蛋白条带，减去融合蛋白，初步确定该β-半乳糖苷酶的分子量约为75KDa。②.本发明将SEQ ID NO. 1所示的DNA序列克隆到原核表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其酶学性质，结果如下(1)在大肠杆菌表达体系中，该重组蛋白具有高效可溶性表达；(2)以乳糖为底物，测得重组β-半乳糖苷酶M221的最适反应温度为55°C，升高或降低温度都会导致酶活性的减少。该酶在50°C、35°C、25°C时酶活分别为最高酶活性的 91%、55%、29%。在50°C以下，该乳糖酶的活性很稳定。但是，在65°C时，残留酶活性为 22%，在70°C条件，几乎完全失活。该酶的最适反应pH为8.0，在pH 6. 5-9.0的范围内活性比较稳定，仍保留大于70%的酶活。测定金属离子和生化试剂对酶活力影响时发现，当含稀释酶液的反应体系中分别含有 IOOmM EDTAUOmM MgCl2UOmM MnCl2UmM FeCl2UmMZnSO4 时，β -半乳糖苷酶Μ221的活性没有显著的改变；但是当含有ImM CuSO4时，酶活受到强烈的抑制，而Na+、K+和Ca2+在低浓度时(IOmM)则对酶活性有轻微的促进作用。③.本发明在研究重组β-半乳糖苷酶Μ221以乳糖为底物的转糖基反应时发现在含有30%乳糖溶液的反应体系中进行转糖基化反应12-24h，经薄层层析(TLC)扫描和 HPLC分析，低聚半乳糖产量为47. 8%。
图1为实施例1中重组β -半乳糖苷酶的SDS-PAGE电泳图；其中，M为标准蛋白分子量maker，1为重组蛋白粗提物，2为纯化的重组蛋白；图2为实施例2中的葡萄糖标准曲线；图3为实施例3中pH值对重组β -半乳糖苷酶降解乳糖时酶活性(■)和稳定性(·)的影响折线图；图4为实施例3中温度值对重组β -半乳糖苷酶降解乳糖时酶活性(■)和稳定性(·)的影响折线图；图5为实施例4中重组β -半乳糖苷酶Μ221以乳糖为底物的转糖基化反应生成低聚半乳糖的薄层层析(TLC)分析结果图，其中1为反应生成产物；2为葡萄糖、半乳糖和乳糖标准样品。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。实施例1宏基因组文库的建立和阳性克隆子的获得、基因克隆与表达1、总DNA的提取称取5g样品，样品为海洋底泥，加入13.5mL DNA提取缓冲液(0. 1M Tris, 0. IMEDTA-Na, 0. 1M Na3PO4,1. 5M NaCl，1 % CTAB，pH 值 8. 0)，剧烈振荡混勻，加入 300 μ L 溶菌酶(100mg/ml)，反复颠倒 5-6 次，37°C水浴 30min，加入 1. 5ml 20% SDS，65°C水浴 1h (期间每隔15min上下颠倒几次)，8000r/min离心5min，取上清液，用等体积氯仿抽提2次， 8000r/min离心lOmin，取上清，加入0. 6倍体积的异丙醇，室温放置2h，20000r/min离心 20min,弃上清，沉淀加5mL预冷的70%乙醇，20000r/min离心lOmin，收集DNA沉淀，风干， 用适量TE缓冲液溶解。2、试剂盒法纯化DNA 按照OMEGA胶回收试剂盒说明书进行。3、宏基因组电泳检测用琼脂糖凝胶电泳检测总DNA量和纯度。4、酶切总DNA 用限制性内切酶BamHI部分酶切总DNA，回收2_8kb的酶切片段，方法同试剂盒法纯化DNA。5、克隆载体PALacZ的构建用NdeI和SmaI进行双酶切pUC19质粒去除其中大约200bp的IacZ序列产生约2400bp无IacZ序列，胶回收并用Klenow大片段酶补平末端， 用T4DNA连接酶连接并转化Ecoli DH5 α，涂布含氨苄青霉素的LB平板，挑取白斑菌落、摇菌并提取P Δ LacZ质粒。用BamHI单酶切P Δ LacZ质粒，并用碱性磷酸酶(CIAP，TAKARA) 去磷酸化制备载体，具体操作方法参照Alkaline Phosphatase (CIAP)说明书。5、酶切片段及克隆载体的电泳检测方法同宏基因组电泳检测。6、酶切片段的链接将回收得到的酶切片段和上述构建好的克隆载体连接过夜， 按照OMEGA Micro Elute 丨CycIe-Pure Kit操作回收连接产物。7、连接产物的转化吸取3 μ L的连接产物加入到100 μ L的大肠杆菌DH5 α高效感受态中，2500V/cm(Eppdoff2510 电击仪)电击 1 次，46°C热激 6-lOmin，37°C，180_200rpm 摇床培养45-60min，吸取20-50 μ 涂布于含氨苄青霉素(100 μ g/ml)、IPTG(ImM)和 X-gal (24 μ g/ml)的LB琼脂平板，37°C培养过夜。由此构建了一个库容量达20000个转化子、多样性好的宏基因组文库。8、文库筛选和阳性克隆子的鉴定将涂布后的平板至于37°C培养72h，由于β-半乳糖苷酶氧化X-gal生成吲哚衍生物显蓝色，因而显蓝色的菌落即为阳性克隆子。通过筛选得到一株阳性克隆子。从平板中将阳性克隆子挑出并接种至IOmL含氨苄青霉素 (100 μ g/ml)的LB液体培养基中，37°C,220r/min摇床培养过夜，取2mL菌体进行质粒提取，对插入片段测序，将测定的序列经过NCBI的BLASTn软件分析比较，发现该DNA由1995个碱基组成，其核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，该DNA编码的多肽，含664个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 3 所示，将其命名为M221。其中SEQ ID N0. 2为SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 3的对照图。
9、基因片段的克隆根据测序结果设计一对引物F1和F2，引物两端引入能插入 pET-32a(+)载体的HindIII和BamHI酶切位点，引物序列如下Fl 5' -CGCGGATCC ATG AAC TTC CCA CAT TTC CTT TAT GGC GGCF2 5' -CCCAAGCTT CTA GCC TCG ATC CAC TTG AAG GAT GGC AAC利用两条引物，以质粒P Δ LacZ-M221为模板进行PCR扩增反应，PCR体系如下
权利要求
1.一种β-半乳糖苷酶，其特征是它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种β-半乳糖苷酶，其特征是它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.权利要求1或2所述的β-半乳糖苷酶的宏基因组学克隆方法，其特征是提取海底泥的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切，连接到克隆载体P Δ LacZ上，电击转化大肠杆菌DH5 α高效感受态建立宏基因组文库，通过涂布含X-gal的LB平板显色法快速筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。
4.一种表达载体，其特征是所述的表达载体含有权利要求1或2所述的β -半乳糖苷酶基因。
5.一种重组半乳糖苷酶的制备方法，其特征是包括用权利要求4所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组β -半乳糖苷酶。
6.根据权利要求5所述的重组酯酶的制备方法，其特征是其中宿主细胞是大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的重组半乳糖苷酶的制备方法，其特征是其具体过程为 包括用权利要求4所述的表达载体的目的片段经BamHI、HindIII双酶切，与pET_32a(+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达。
8.根据权利要求7所述的重组β-半乳糖苷酶的制备方法，其特征是所述的IPTG终浓度为0. 6-1. 8mM，诱导温度为18-37°C。
9.一种重组半乳糖苷酶，其特征是包括用权利要求4所述的表达载体转化的宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组β -半乳糖苷酶的步骤的方法制备。
10.权利要求9所述的重组酯酶在将乳糖高效转化为低聚半乳糖混合物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种β-半乳糖苷酶，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。它的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还公开了含上述β-半乳糖苷酶基因的表达载体的构建，及重组酶及其在以乳糖为底物的转糖基反应合成低聚半乳糖中的应用。该新型重组β-半乳糖苷酶在大肠杆菌表达体系中具有高效的可溶性表达，且该重组β-半乳糖苷酶在含30％乳糖体系中转糖基反应合成低聚半乳糖产量为47.8％。
文档编号C12N9/38GK102154239SQ201110001568
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者刘孝龙, 刘玉焕, 王魁, 鲁毅 申请人:中山大学