专利名称：一种提高植物产量的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高植物产量的方法。
背景技术：
随着人口的不断增加，耕地的逐渐减少，如何提高作物产量已经成为一个世界性的、汲待解决的重大问题。植物器官大小直接关系到植物的产量。器官大小不仅受环境因素影响，而且受内源基因的调控。所以，研究植物体如何实现自身对器官大小的控制已经成为提高作物产量的重要策略之一。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种提高植物产量的方法。本发明所提供的提高植物产量的方法，包括如下步骤向出发植物中导入SEQ IDNO 1所示蛋白质的编码基因，得到与所述出发植物相比产量提高的目的转基因植物。上述提高植物产量的方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入的；所述重组表达载体是向出发载体PMDC32中(具体可以是载体上的重组位点间)插入所述编码基因得到的。上述提高植物产量的方法中，所述SEQ ID NO :1所示蛋白质的编码基因如SEQ IDNO 2 所示。上述提高植物产量的方法中，所述出发植物为双子叶植物。上述提高植物产量的方法中，所述双子叶植物为拟南芥(Arabidopsis thaliana)0上述提高植物产量的方法中，所述产量为植物的单株种子重量。本发明的另一个目的是提供一种改善植物的与产量相关表型的方法。本发明所提供的改善植物的与产量相关表型的方法，包括如下步骤向出发植物中导入SEQ ID NO :1所示蛋白质的编码基因，得到与所述出发植物相比与产量相关表型得到改善的目的转基因植物。上述改善植物的与产量相关表型的方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入的；所述重组表达载体是向出发载体PMDC32中(具体可以是载体上的重组位点间)插入所述编码基因得到的。上述改善植物的与产量相关表型的方法中，所述与产量相关表型得到改善为如下 1)-6)中至少一种1)与出发植物相比，叶片数目增加；2)与出发植物相比，叶片的面积增加；3)与出发植物相比，花瓣的大小变大；4)与出发植物相比，角果长度增加；5)与出发植物相比，每个角果里的种子数目增加；
6)与出发植物相比，种子重量增加；7)与出发植物相比，种子长度增加。上述改善植物的与产量相关表型的方法中，所述SEQ ID NO 1所示蛋白质的编码基因如SEQ ID NO :2所示；上述改善植物的与产量相关表型的方法中，所述叶片数目为基生叶的数目和/或茎生叶的数目；上述改善植物的与产量相关表型的方法中，所述花瓣的大小变大为如下中的至少一种花瓣的长度变长、花瓣的宽度变宽和花瓣的面积变大；上述改善植物的与产量相关表型的方法中，所述出发植物为双子叶植物；所述双子叶植物为拟南芥(Arabidopsis thaliana)。SEQ ID NO 2所示基因在提高植物产量中的应用也属于本发明的保护范围。SEQ ID NO 1所示蛋白质在提高植物产量中的应用也属于本发明的保护范围。实验证明，本发明方法通过过表达STONl能够促进植物生长，形成较多的叶片、较大的花瓣和较长的角果，并且能够增加种子重量和单株产量。本发明在农作物高产育种中具有极大的生产应用潜力。
图1为转基因植株表型与野生型植株表型分析。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pCR8/Gff/T0P0 TA 克隆载体购自 invitrogen，产品目录号为 K2500-20。一、STONl编码基因的获得1、提取总RNA及反转录在液氮中研碎新鲜的拟南芥(Arabidopsis thaliana)花序，以植物RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取总RNA，用分光光度计(Eppendorf公司，德国)检测样品浓度。取5μ g总RNA，用反转录试剂盒(Invitrogen，美国)进行反转录，以得到cDNA。2、STONl编码序列的获得以步骤1得到的cDNA为模板，用引物对STCMlCDS-F/STCMlCDS-R进行PCR扩增。ST0N1CDS-F :5，-ATGTCTGCTCCTTCTGGCGGT ；ST0N1CDS-R :5，-TTAGAAAGCTAAACAACAAGG。50 μ 1 PCR 反应体系为5μ 1 KOD plus buffer,2 μ 1 MgS04、5y 1 dNTP 混合物、 0. 2μΜ 引物 STOmCDS-F 和 0. 2μΜ 引物 ST0mCDS-R、ly 1 的 KOD plus 聚合酶(Τ0Υ0Β0,日本)。PCR循环为94°C预变性2分钟；再94°C 15秒，55°C 30秒，68°C 1分钟，共32个循环； 最后68°C 10分钟。反应结束后加入0. 2μ 1 rTaq(宝生物(大连)有限公司)，72°C反应 30分钟加A。在1 %的琼脂糖凝胶中电泳PCR扩增产物，用凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收约750bp的片段，连接到pCR8/GW/T0P0 TA克隆载体，并测序验证(北京诺赛基因组研究中心有限公司)。测序表明，亚克隆(命名为T0P0ST0N1)在载体pCR8/GW/T0P0 TA中插入了 SEQ ID NO :2所示基因。该基因为STONl基因，⑶S全长756bp (SEQ ID NO :2)，编码一个251个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO :1)。二、重组植物表达载体35S: STONl的构建pMDC32载体购自hvitrogen，这是一个GATEWAY系统的植物表达载体。PMDC有一系列载体，是hvitrogen公司利用重组技术开发的一套Gateway载体，优点是不需要设计酶切接头，不需要酶切连接。LR enzyme mix 购自 Invitrogen01)小量提取测序正确的亚克隆(命名为T0P0ST0N1)和pMDC32的质粒DNA。2) LR 反应。体系T0P0ST0N1 50ng, pMDC32 150ng, LR enzyme mix 1 μ 1, TEbuffer (PH8. 0)补足到10 μ 1。室温反应2小时，加入1 μ 1蛋白酶K，37°C反应10分钟。 冰浴2分钟，热击转化DHlOB感受态细胞，提取质粒，进行I^stl酶切，电泳，被消化成一条约 Ilkb条带的为阳性克隆，被消化成两条2. 4kb和91Λ条带的为没有重组的克隆。获得正确的重组表达载体(命名为35S: :ST0N1)。将重组表达载体35S: STONl进行测序验证，结果在pMDC32的重组位点间插入的基因序列如SEQ ID NO 2所示。三、植物转化Silwet L-77 购自 LEHLE SEEDS，货号VIS_02。农杆菌GV3101 在文献“Li，Y.，Zheng, L.，Corke, F.，Smith, C.，and Bevan, Μ. W. (2008). Control of final seed and organ size by the DA lgene family in Arabidopsis thaiiana. Genes Dev22，1331-1336”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。1、重组农杆菌构建电击转化重组植物表达载体35S::ST0N1到农杆菌GV3101中，电击仪型号为 MicropuleHBio-RAD)，得到重组农杆菌。将重组农杆菌进行抗生素(Kan，Gen，Rif)平板抗性筛选培养，挑取阳性克隆。侵染农杆菌菌液制备将挑取的阳性克隆用5ml农杆菌培养基摇床培养过夜，再以1 100的体积比转接到农杆菌培养基中大摇至0D600为1.2-1.4。然后，14°C， 4000转离心10分钟收集菌体，用转化缓冲液重悬，得到侵染菌液。农杆菌培养基组成向YEP培养基中添加抗生素Kan、抗生素Gen和抗生素 Rif,得到农杆菌培养基。抗生素Kan、抗生素Gen、抗生素Rif和YEP培养基的比例为 50mg 40mg 12. 5mg 1ml。转化缓冲液组成将1/2MS培养基，蔗糖和silwet L-77混合，调PH至5. 7，得到转化缓冲液。蔗糖、silwet L-77和1/2MS培养基的配比为蔗糖=Silwet L-77 V2MS培养基=5mg 0. 04ml Iml0YEP培养基配制酵母提取物(0X0ID) 10g/L，大豆蛋白胨(北京双旋微生物生物培养基制品厂)10g/L, NaCl 5g/L，其余为水；调PH值到7. 0。2、拟南芥转化利用浸泡花序的方法转化拟南芥Col-O野生型，以获得35S: :ST0N1转基因植株。具体操作如下1)、拟南芥生长条件拟南芥Col-O野生型种子以70%乙醇表面消毒1分钟，5%次氯酸钠溶液消毒10 分钟，无菌水洗涤5遍。4°C冰箱春化3天后，播种于1/2MS固体培养基上，置于培养间， 22°C、16小时光照/8小时黑暗条件下培养，7天后将幼苗移至培养介质(蛭石和草炭土的体积比为2 1混勻)中，培养至得到带有花序的拟南芥植株。2)、转基因植株的获得当拟南芥植株主枝长5-15cm时用步骤1中菌液进行侵染。将待转化的拟南芥花序浸泡在菌液中10秒钟，避光保湿24h后，再培养一个月左右收种，即为Tl代种子。拟南芥培养条件为16小时光照/8小时黑暗，强度为4000LUX，温度22°C，湿度60-80%。培养介质为按21体积混勻的蛭石和营养土。所得Tl代种子春化后播种在潮霉素抗性筛选培养基上筛选转基因植株，10天后移栽到培养介质中。用这种方法共筛选到78个转基因植株，多数具有较多的叶片、较大的花瓣、角果、种子等器官。整个过程中，拟南芥培养条件为16小时光照/8小时黑暗，强度为4000LUX，温度22°C，湿度60-80%。培养介质为按2 1体积混勻的蛭石和营养土。潮霉素抗性筛选培养基组成由葡萄糖、潮霉素(Hyg)和1/2MS固体培养基组成， 葡萄糖、潮霉素和1/2MS固体培养基的配比为IOg葡萄糖30mg卡那霉素1L 1/2MS固体培养基。同时以转入空载体pMDC32的拟南芥为空载体对照。3、转基因植株的鉴定(1)基因组DNA提取。剪取4-8cm2的转基因植株叶片和野生型Col-O的叶片，加入100 μ 1 REB (50mMTris-HCl (PH = 8. 0), 25mM EDTA, 250mM NaCl,0. 5% SDS，其余为水)后玻璃棒研碎，加入等体积的苯酚/氯仿，离心10分钟；取上清，加入2倍体积的无水乙醇；离心10分钟，弃上清，以70%乙醇洗沉淀，凉干后加入80 μ 1无菌水。以STCMl⑶S-F和STCMl⑶S-R 为引物，分别以野生型和转基因拟南芥的基因组DNA为模板进行PCR反应。结果显示，35S: :ST0m转基因拟南芥的PCR扩增产物有750bp的清晰条带，而野生型拟南芥无此条带，说明78棵转基因植株全部为阳性。空载体对照与野生型一致。选取表型显著的10株收种，为T2代种子。在T3代通过潮霉素抗性分离出纯合的转基因系，进行下一步的表型统计分析。4、表型统计分析相同条件下种植野生型、转空载体植株和转基因纯合系，统计花瓣、角果、种子、单株产量等指标，方法如下下述各图中，I为野生型，II为转基因株系。下述实验均设3次重复，结果取平均数。(1)统计基生叶和茎生叶的叶片数目。结果转基因株系的基生叶数目平均为13/ 株；野生型的基生叶数目平均为11. 4/株。转基因株系的茎生叶数目平均为3. 9/株；野生型的茎生叶数目平均为2. 8/株。如图IE所示，表明过表达植株具有较多的基生叶和茎生叶。
与野生型对照相比，转基因株系的叶片面积增加(图1B)。(2)取下主茎上第3-第7朵正在开放的小花，用镊子小心将花瓣剖下，展平，放在体式镜(LEICA S8AP0，德国)下观察并拍照(LEICA DFC420，德国)。用Image Jl. 41软件测量花瓣的长、宽、面积，利用EXCEL进行统计分析(图1D)。结果花瓣长度转基因株系平均为3. 7mm ；野生型平均为3. 3mm。花瓣宽度转基因株系平均为1. 2mm ；野生型平均为1. 1mm。花瓣面积转基因株系平均为2. 5mm2 ；野生型平均为2. 2mm2。表明过表达植株的花瓣长度增加12%，宽度增加8%，面积增加20%。说明拟南芥 STONl基因能够显著增加花瓣的大小(图1A)。(3)取主茎上第3-第7个即将成熟的角果，在体式镜下拍照，Image J软件测量大小，EXCEL统计分析(如图1C，IF和1G)。角果长度转基因株系平均长度为15. 5mm ；野生型平均长度为13. 9mm(图1F)。每个角果里的种子数目转基因株系为64粒；野生型平均为57粒(图1G)。结果表明过表达植株的角果长度增加11%，每个角果里的种子数目增加12%。(4)收获主茎上第3-第10个角果的种子，室温放置1个月后在体式镜下拍照， Image J软件测量种子大小，EXCEL统计分析。精确数出500粒种子，在天平上测量种子重量(METTLER TOLEDO AL104，中国)，5次重复。结果表明野生型植株的种子长度主要集中在 0. 45-0. 5mm,而过表达植株主要集中在0. 5-0. 55mm。500粒种子重量转基因株系平均为9. 74mg ；野生型平均为9. 36mg。500粒种子重量增加5% (图1H)。图II的纵坐标是不同大小的种子所占的百分数。1为0. 50-0. 55mm, 2 为 0. 45-0. 50mm, 3 为 0. 40-0. 45mm。(5)收集单株种子，分别称量全株种子质量(即为单株产量)。单株产量结果表明，转基因株系野生型200.5mg。过表达植株的整株产量约增加21% (图1J)。转空载体拟南芥与野生型拟南芥结果一致。
权利要求
1.一种提高植物产量的方法，包括如下步骤向出发植物中导入SEQ ID N0:1所示蛋白质的编码基因，得到与所述出发植物相比产量提高的目的转基因植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述编码基因是通过重组表达载体导入的；所述重组表达载体是向出发载体PMDC32中插入所述编码基因得到的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述SEQID NO :1所示蛋白质的编码基因如SEQ ID NO 2所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述出发植物为双子叶植物。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述双子叶植物为拟南芥 (Arabidopsis thaliana)。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述产量为植物的单株种子重量。
7.一种改善植物的与产量相关表型的方法，包括如下步骤向出发植物中导入SEQ ID NO :1所示蛋白质的编码基因，得到与所述出发植物相比与产量相关表型得到改善的目的转基因植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述编码基因是通过重组表达载体导入的；所述重组表达载体是向出发载体PMDC32中插入所述编码基因得到的；所述与产量相关表型得到改善为如下1)-6)中至少一种.1)与出发植物相比，叶片数目增加；.2)与出发植物相比，叶片的面积增加；.3)与出发植物相比，花瓣的大小变大；.4)与出发植物相比，角果长度增加；.5)与出发植物相比，每个角果里的种子数目增加；.6)与出发植物相比，种子重量增加；.7)与出发植物相比，种子长度增加。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述SEQID NO :1所示蛋白质的编码基因如SEQ ID NO :2所示；所述叶片数目为基生叶的数目和/或茎生叶的数目；所述花瓣的大小变大为如下中的至少一种花瓣的长度变长、花瓣的宽度变宽和花瓣的面积变大；所述出发植物为双子叶植物；所述双子叶植物为拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
10.SEQ ID NO :2所示基因和/或SEQ ID NO :1所示蛋白质在提高植物产量中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种提高植物产量的方法。该提高植物产量的方法，是向出发植物中导入SEQ ID NO1所示蛋白质的编码基因，得到与所述出发植物相比产量提高的目的转基因植物。实验证明，本发明方法通过过表达STON1能够促进植物生长，形成较多的叶片、较大的花瓣和较长的角果，并且能够增加种子重量和单株产量。本发明在农作物高产育种中具有极大的生产应用潜力。
文档编号C12N15/63GK102586264SQ20111000145
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者刘亚菊, 李云海, 李胜军 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所