专利名称：预测重型肝炎病情基因甲基化状态检测方法及试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及医学领域，是一种重型肝炎相关基因谷胱甘肽S-转移酶M3启动子甲 基化状态信息及其应用。具体涉及检测与重型肝炎相关的基因谷胱甘肽S-转移酶M3启动 子甲基化状态的方法和试剂盒。
背景技术：
慢加急性重型肝炎(ACLF)指已确诊或未经诊断的慢性肝炎患者病情急性发作， 表现为以黄疸和凝血障碍为主的肝损伤，4周内并发腹水和(或)肝性脑病。西方国家重 症肝炎以药物、乙醇等中毒所致的急性肝衰竭为主，而我国的重症肝炎则多由肝炎病毒，尤 其是乙型肝炎病毒(HBV)所致(约占70%)。我国是HBV感染高发区，乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)携带者约有9300万例，其中约2000万例为慢性乙型肝炎患者。化学和生物毒物、 乙醇、药物、HBV耐药变异、免疫抑制剂、合并感染、Wilson病、自身免疫性肝病和妊娠等因 素可导致慢性HBV感染者急性发病，表现为慢加急性肝功能衰竭，称为慢加急性重型乙型 病毒性肝炎(ACHBLF)。当前，乙型肝炎的抗病毒治疗已取得长足的进展，但重型乙型肝炎的 发病率及病死率仍居高不下。该疾病病情凶险，发展迅猛，临床上缺乏确定病情、判断疗效 和预后的评估体系，至今没有有效的治疗方法和干预手段，绝大部分患者预后不佳，严重威 胁患者的生命。因此，揭示乙型肝炎重症化的机制，建立有效的针对性综合评估体系和防治 手段尤为重要。乙型肝炎重症化是多基因、多因素所致，其发病机制十分复杂，目前认为，重症乙 型肝炎发生和发展由宿主(如生物遗传特征、细胞凋亡和坏死、免疫损伤机制等)和病毒 (如病毒复制、病毒变异、病毒基因型等)两方面相互作用所影响。有研究表明，慢性HBV感 染的重症化过程中表观遗传易感性发挥作用，表观遗传学漂移可以导致患者对疾病的易感 和转归不同，个体特征差异明显。脱氧核糖核酸(DNA)甲基化是表观遗传的重要机制之一， 它指在DNA甲基转移酶(DNMT)的作用下，将一个甲基添加在DNA分子中的碱基胞嘧啶上， 形成5甲基胞嘧啶。甲基化主要发生在CpG序列上，其中，C代表胞嘧啶，P代表磷酸酯键， G代表鸟嘌呤。CpG岛大小约500-1000bp，GC含量超过55 %，56%的编码基因位于转录起 始区的重复序列含有CpG岛。CpG岛的甲基化与基因转录活性密切相关，DNA甲基化导致 基因沉默，相反，非甲基化一般与基因活化相关联。最近有研究发现，HBV进入机体后可以 诱导宿主DNMT活性增加，DNMT催化病毒DNA启动子甲基化，发挥抑制病毒的作用。另一方 面，病毒基因被甲基化的同时，活性增加的DNMT同时对宿主的某些基因进行选择性甲基化 修饰，导致人体某些基因启动子CpG岛被甲基化修饰，基因表达水平降低。重型肝炎患者氧化应激可以加重肝脏损伤。另有研究表明慢性乙型病毒性肝炎、 慢性丙型病毒性肝炎、肝硬化、酒精性肝病患者生物抗氧化能力减弱，氧化损伤加重，与患 者肝损伤程度相关。谷胱甘肽S-转移酶(GST)是重要的II相代谢酶，主要催化谷胱甘肽和 亲电性物质之间的反应，即促进谷胱甘肽与毒性代谢产物结合，消除细胞内自由基，减轻氧 化损伤。GST超家族主要分为α、μ、Ji、θ共4个亚家族，分别为GSTA、GSTM、GSTP、GSTT。亚家族各成员参与不同化学物质的代谢，但彼此间底物有部分重叠，其中GSTM的作用尤为 突出。研究表明，GSTM表达缺失是原发性肝癌、药物诱导的肝损伤、酒精性肝硬化、非酒精 性脂肪肝、丙型肝炎慢性化的危险因素。GSTM3是GSTM亚家族的重要成员之一，其表达水平 与基因启动子甲基化水平负相关。GSTM3启动子高甲基化可以使GSTM3表达下调，可能导 致机体抗氧化能力降低，氧化损伤加重，肝功能受损。基于以上研究，本发明人首次提出了 GSTM3启动子的甲基化与重型肝炎有关。对GSTM3启动子的甲基化状态进行检测可以应用 于重症肝炎患者提示预后及指导治疗。 本发明采用的甲基化特异性聚合酶链反应(MSP-PCR)法是目前使用最广泛的DNA 甲基化检测方法，与其它甲基化检测方法相比，其优点是标本需要量；灵敏度高；实验时间 较短，操作相对简便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测重型肝炎相关基因谷胱甘肽S-转移酶 M3(GSTM3)启动子甲基化状态的试剂盒，以及简便可行的检测方法，其检测结果为重型肝炎 的临床诊治提供科学依据。本发明是这样实现的，本试剂盒内设有对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰的试 剂，针对人谷胱甘肽S-转移酶M3 (GSTiO)基因的启动子甲基化特异性和非甲基化特异性的 引物对，以及 2XTaq PCR MasterMix 酶。为了方便应用，本试剂盒内还可以设有提取外周血单个核细胞DNA的试剂，这样， 用一个试剂盒就可以做到由采血到重型肝炎相关基因GSTM3启动子甲基化状态检测的全 过程。为了便于质控，本试剂盒内还可以设有阳性对照和/或阴性对照。本试剂盒中所述的GSTM3启动子的甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物 对选自下组为
名称序列编号
GSTM3 M-上游引物CGTACG GTT TTG TGG AGT C1 M-下游引物TCCGAA CCT TCG AAA ACT AA2
U-上游引物TTGTGT ATG GTT TTG TGG AGT T3
U-下游引物CTTCCA AAC CTT CAA AAA CTA AA4本试剂盒中，所设有的启动子特异性引物对长度为15_40bp。本试剂盒中设有的对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰的试剂为亚硫酸氢盐，联苯 二酚和氢氧化钠。本发明所述的外周血单个核DNA提取试剂为磷酸盐缓冲液(PBS)，三羟甲基氨基 甲烷盐酸(Tris -Cl)，乙二胺四乙酸(EDTA)，胰核糖核酸(RNA)酶，十二烷基硫酸钠(SDS)， 蛋白酶K，三羟甲基氨基甲烷-饱和酚，乙酸铵，乙醇。
2XTaq PCR MasterMix酶中含有耐热聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷、氯化镁、反应 缓冲液、聚合酶链式反应(PCR)反应的增强剂、优化剂以及稳定剂酶。本发明所述的检测重型肝炎相关基因GSTM3启动子甲基化状态的方法为提取外 周血单个核细胞DNA，对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰；将修饰后的DNA与甲基化(M)特 异性和非甲基化(U)特异性引物、2XTaq PCR MasterMix酶、双蒸馏水进行混合，使其进行 聚合酶链式反应(PCR)，PCR后所扩增出的扩增产物长度为130-150bp，最后判断GSTM3启动 子甲基化状态，得出检测结果。综合患者谷丙转氨酶(ALT)、血清总胆红素(TBIL)、凝血酶 原活动度(PTA)、丙二醛(MDA)水平、终末期肝脏病模型(MELD)评分，提示存在GSTM3基因 启动子甲基化的重症肝炎患者，氧化损伤加重，肝功能受损严重，患者病情严重，预后不佳。本发明人经过广泛而深入的研究，通过对多例慢加急性肝衰竭(ACLF)、慢性乙型 病毒性肝炎(CHB)患者及正常人的外周血单个核细胞DNA多种基因启动子的甲基化状态 进行分析，并与患者的肝功能指标(ALT、TBIL、PTA)、氧化损伤指标(MDA)、疾病预后指标 (MELD评分)进行相关性分析，发现谷胱甘肽S-转移酶M3基因的启动子甲基化状态与重症 肝炎的发展存在密切关系，在此基础上完成了本发明，以辅助诊断、提示预后及指导治疗。本发明人已证明，重型肝炎患者GSTM3启动子甲基化组终末期肝脏病模型评分高 于GSTM3启动子非甲基化组及慢性乙型肝炎患者组。这一结果提示GSTM3启动子区甲基化 可能通过加剧氧化应激加重肝脏的损伤。对于慢加急性重型肝炎(ACLF)及慢性乙型病毒 性肝炎(CHB)患者的外周血单个核细胞DNA的GSTM3启动子甲基化状态的分析有助于临床 医生鉴定慢乙肝患者中可能进展为慢加急性肝衰竭的患者，提示预后和指导治疗。
附图显示了谷胱甘肽S-转移酶M3(GSTM3)启动子甲基化特异性PCR反应扩增的结果。
具体实施例方式本试剂盒内设有对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰的试剂，针对人谷胱甘肽 S-转移酶M3 (GSTiO)基因启动子甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对，以及2XTaq PCR MasterMix 酶。为了方便使用和进行对比，本试剂盒内还可以设有外周血单个核细胞DNA提取试 剂、阳性对照和/或阴性对照。这样，不但可以只用一个试剂盒就完成做由采血到GSTM3基 因启动子甲基化状态检测的全过程，而且，还可以准确地进行质量控制，方便快捷的得出测 试结论。本发明所述的启动子的甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物对选自下组 为
名称序列编号GSTM3M-上游引物CGTACGGTTTTGTGGAGTC 1M-下游引物TCCGAACCTTCGAAAACTAA 2U-上游引物TTGTGTATGGTTTTGTGGAGT T 3U-下游引物CTTCCAAACCTTCAAAAACTA AA 4本试剂盒中，所设有的启动子特异性引物对长度为15_40bp。本发明所述的对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰的试剂为亚硫酸氢盐，联苯二 酚和氢氧化钠。本发明所述的外周血单个核DNA提取试剂为磷酸盐缓冲液(PBS)，三羟甲基氨基 甲烷盐酸(Tris -Cl)，乙二胺四乙酸(EDTA)，胰核糖核酸(RNA)酶，十二烷基硫酸钠(SDS)， 蛋白酶K，三羟甲基氨基甲烷-饱和酚，乙酸铵，乙醇。2XTaq PCR MasterMix酶中含有耐热聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷、氯化镁、 反应缓冲液、聚合酶链式反应(PCR)反应的增强剂、优化剂以及稳定剂酶，2XTaq PCR MasterMix酶为市场出售产品。本发明所述的检测GSTM3启动子甲基化状态的具体方法如下(其中，未注明具体 条件的实验方法按照常规的实验条件和方法，或按照制造厂商所建议的条件)DNA 的提取抽取慢加急性重型肝炎(ACLF)患者外周静脉血后，可以使用试剂盒中的提取DNA 的试剂按照下列步骤提取患者的DNA，也可以用其他方法提取DNA。(1)准备试剂磷酸盐缓冲液(PBS)，三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris · Cl)，乙二胺 四乙酸(EDTA)，胰核糖核酸(RNA)酶，十二烷基硫酸钠(SDS)，蛋白酶K，三羟甲基氨基甲 烷-饱和酚，乙酸铵，乙醇。(2) DNA 提取缓冲液的配制10mmol/L Tris 'C1,0. lmol/L EDTA, 20 μ g/ml 胰 RNA 酶，0. 5% SDS ；(3)TE 缓冲液的配制:10mmol/L Tris · Cl, lmol/L EDTA ；(4)将20ml血液以1300Xg离心力离心15分钟，弃上清，小心吸出淡黄色下层至 一新离心管中，1300Xg离心力离心15分钟，弃去上层血浆，用10-15ml DNA提取缓冲液悬 浮下层白细胞，37°C放置1小时；(5)加入20mg/ml蛋白酶K，使终浓度为100 μ g/ml,同时用玻璃棒轻轻搅拌，使溶 液粘稠；(6) 50°C放置3小时，期间不时轻轻摇勻反应液；(7)冷却至室温后，在反应液中加入等容积的三羟甲基氨基甲烷-饱和酚，上下颠 倒混勻10分钟；(8)室温5000 X g离心力离心15分钟，用吸管小心吸出上层水相，移至另一离心管中，重复步骤(7)、(8)；(9)沉淀DNA，上层水相中加入0. 2倍容积的lOmol/L乙酸铵和2倍容积的95%乙 醇，轻慢摇动混勻，即可见乳白色丝状DNA沉淀，2-8°C条件下5000 X g离心5分钟，弃上清 液；(10)室温放置5-15分钟晾干DNA，按每5 X 106个细胞DNA提取物加入ImlTE缓 冲液溶解DNA。获得样本外周血单个核细胞提取的DNA。重型肝炎相关基因GSTM3启动子甲基化状态的检测1、对DNA进行甲基化修饰(1)取样本外周血单个核细胞提取的DNA 2μ g，置于1. 5ml的EP管中，使用双蒸 水稀释至50 μ 1 ；(2)力卩5. 5 μ 1新鲜配制的3mol/L氢氧化钠，42°C水浴30分钟；(3)加30 μ 1浓度lOmmol/L的联苯二酚至上述水浴后混合液中；(4)配制3. 6mol/L亚硫酸氢钠，方法如下1. 88g亚硫酸氢钠使用双蒸水稀释，并 以3mol/L氢氧化钠滴定溶液至pH 5. 0，最终体积为5ml，加520 μ 1至上述水浴后溶液中；(5)EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混勻溶液，加200 μ 1石蜡油，防止水分蒸 发，限制氧化，50°C避光水浴16小时；(6)分光光度计法测DNA浓度和纯度，保存于_20°C。2、甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)检测GSTM3启动子甲基化状态分别用甲基化特异性或非甲基化特异性引物对，对处理过的DNA进行聚合酶链式 反应(PCR)，其中阴性对照是将体系中DNA底物替换为双蒸水，阳性对照是将体系中DNA底 物替换为阳性对照DNA (商品化DNA阳性对照)，浓度为10-20ng/y 1。反应体系如下表甲基化特异性PCR反应体系
试剂加入量
2XTaq PCR MasterMix12. 5μ 1
上游引物(10ymol/L)0. 5μ 1
下游引物(ΙΟμπιοΙ/L)0. 5μ 1
DNA 底物(10-20ng)1. 5μ 1
双蒸馏水10 μ 1
其中，上游引物和下游引物指的是启动子的甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物对，即前面所述的M-上游引物、M-下游引物；U-上游引物、U-下游引物。
反应条件如下加热至95°C，保温5分钟，共1个循环；加热至95°C，保温30秒，在
55-600C的温度下，退火45秒，720C 30秒，40个循环；72°C 10分钟1个循环；使甲基化特 异性聚合酶链式反应(MSP)后所扩增出的扩增产物长度为130-150bp，1. 5% 琼脂糖电 泳检测扩增产物，获取检测结果。实际检测举例检测样本包括一名健康人外周血单个核细胞DNA样本；一名慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者外周血单个核细胞DNA样本；一名慢加急性肝衰竭(ACLF)患者外周血单个核 细胞DNA样本；双蒸水；阳性对照DNA样本。MSP-PCR扩增后，得到扩增结果，图中，1_健康人非甲基化引物扩增条带⑶；2_慢 性乙型病毒性肝炎(CHB)患者非甲基化引物扩增条带(U) ；3-慢加急性肝衰竭(ACLF)患者 甲基化引物扩增条带(M) ；4-阳性对照组甲基化引物扩增条带(M) ；5-阳性对照组非甲基 化引物扩增条带(U)。在甲基化与非甲基化特异性引物条件下健康人和慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患 者一般可见非甲基化引物扩增条带(U)，上述两组未见甲基化引物扩增条带(M)。慢加急性 肝衰竭(ACLF)患者组可见明显甲基化引物扩增条带(M)。试验中阴性对照组应无任何引物 扩增条带出现，阳性对照组甲基化(M)与非甲基化⑶引物扩增条带均应出现，阳性对照与 阴性对照作为本发明的质量控制，若阳性对照与阴性对照未出现上述相应结果，则表示实 验过程或操作有误。
权利要求
1.预测重型肝炎病情基因甲基化状态检测试剂盒，其特征在于盒内设有对基因组 DNA进行亚硫酸氢盐修饰的试剂，针对人谷胱甘肽S-转移酶M3基因的启动子甲基化特异性 和非甲基化特异性的引物对，以及2XTaq PCR MasterMix酶。
2.根据权利要求1所述的预测重型肝炎病情基因甲基化状态检测的试剂盒，其特征在 于盒内还设有外周血单个核细胞DNA提取试剂。
3.根据权利要求1所述的预测重型肝炎病情基因甲基化状态检测试剂盒，其特征在 于盒内还设有阳性对照和/或阴性对照。
4.根据权利要求1所述的预测重型肝炎病情基因甲基化状态检测试剂盒，其特征在 于盒内启动子的甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物对选自下组为
5.根据权利要求1所述的预测重型肝炎病情基因甲基化状态检测试剂盒，其特征在 于所述盒内设有的启动子特异性引物对的长度为15-40bp。
6.根据权利要求1所述的预测重型肝炎病情基因甲基化状态检测试剂盒，其特征在 于盒内设有的对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰的试剂为亚硫酸氢盐，联苯二酚和氢氧 化钠。
7.根据权利要求2所述的预测重型肝炎病情基因甲基化状态检测试剂盒，其特征在 于所述的盒内的外周血单个核细胞DNA提取试剂为磷酸盐缓冲液(PBS)，三羟甲基氨基甲 烷盐酸(Tris <1)，乙二胺四乙酸(EDTA)，胰核糖核酸(RNA)酶，十二烷基硫酸钠(SDS)，蛋 白酶K，三羟甲基氨基甲烷-饱和酚，乙酸铵，乙醇。
8.预测重型肝炎病情基因甲基化状态检测方法，其特征在于亚硫酸氢盐修饰提取得 病人外周血单个核细胞DNA后，分别用谷胱甘肽S-转移酶Μ3甲基化(M)特异性和非甲基化 (U)特异性引物对进行甲基化特异性聚合酶链式反应，甲基化特异性聚合酶链式反应后所 扩增出的扩增产物长度为130-150bp，最后检测各基因启动子甲基化状态，得出检测结果。
全文摘要
本发明涉及预测重型肝炎病情基因甲基化状态检测方法及试剂盒，它设有对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰的试剂，针对人谷胱甘肽S-转移酶M3基因启动子的甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对，以及2×Taq PCRMasterMix，提取病人外周血单个核细胞DNA进行亚硫酸氢盐修饰后，分别用谷胱甘肽S-转移酶M3甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物对进行甲基化特异性聚合酶链式反应，根据扩增产物判断其甲基化状态，有助于临床医生判定重型肝炎患者的病情和指导治疗。
文档编号C12Q1/68GK102140535SQ201110001339
公开日2011年8月3日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者张建军, 戚丽, 王丽媛, 王凯, 范晓鹏, 范玉琛, 韩婕 申请人:山东大学齐鲁医院