专利名称：包含突变fad3等位基因的芸苔属植物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及作物植物和作物部分,尤其是十字花科(Brassicaceae),特别是芸苔属(Brassica)种类，其具有改进的脂肪酸组成，更具体地在种子中具有降低的a -亚麻酸含量。本发明还涉及脂肪酸去饱和酶以及编码去饱和酶蛋白的核酸。更特别地，本发明涉及编码A-15脂肪酸去饱和酶蛋白的核酸以及其突变体，该核酸及其突变体影响植物种子油中的脂肪酸组成。本发明还提供了鉴定与植物种群种子中降低的a-亚麻酸含量相关联的分子标记的方法。
背景技术：
由于植物油在人类和动物饮食中以及多种工业用途中广泛使用，它们具有日益重要的经济价值。然而，这些油的脂肪酸组成对于许多这些用途通常不是最佳的。由于具有、特定脂肪酸组成的特种油对于营养目的和工业目的两者都是需要的，对于通过植物育种和/或通过新的植物生物技术分子工具在改变油的组成方面存在着相当大的兴趣。食用油的具体性能和健康属性在很大程度上取决于其脂肪酸组成。大多数源自商用植物品种的植物油主要由棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:l)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)组成。棕榈酸和硬脂酸分别为16碳和18碳长的饱和脂肪酸。油酸、亚油酸和亚麻酸是18碳长的不饱和脂肪酸，分别含有1、2和3个双键。油酸被称为单不饱和脂肪酸，而亚油酸和亚麻酸被称为多不饱和脂肪酸。芸苔属(Brassica)种类如甘蓝型油菜(Brassica napus,B. napus)和白菜型油菜(Brassica rapa,B. rapa)构成了世界上第三大植物油来源。在加拿大，植物科学家集中致力于构建所谓的“双低”品种，所述品种的种子油中芥酸含量低，并且在油提取之后剩余的固体粗粉中芥子油苷含量低(即，基于总脂肪酸含量的按重量计低于2.0%的芥酸含量(在下文中称为wt% )，且每克无油粗粉中低于30微摩尔的芥子油苷含量)。这些在加拿大开发的较高质量形式的油菜被称为卡诺拉(canola)油菜。从卡诺拉油菜的天然和以前商用品种中提取的油含有相对高(8% -10% )的a-亚麻酸含量(C18:3)(美国专利申请20080034457)。也曾报告过更高的数值，例如11 %(http://www. canolacouncil. org/canola_oil_properties_and_uses. aspx)。三稀月旨肪酸在烹饪过程中不稳定且易氧化，进而产生油的异味(GaiIIiard, 1980, Vol. 4,pp. 85_116In Stumpf, P. K. , ed. , The Biochemistry of Plants, Academic Press, New York)。它在存储期间也形成异味和酸败味(Hawrysh, 1990, Stability of canola oil, Chapter 7,pp. 99_122In F.Shahidi,ed. Canola和 Rapeseed Production,Chemistry,Nutrition, andProcessing Technology, Van Nostrand Reinhold, New York)。通过降低 C18:3 水平(有利于C18:2)改进了油的风味和营养质量两者(Di印enbrock和Wilson，Crop Sci 27:75-77，1987)。已知通过加氢降低a-亚麻酸含量水平增加了油的氧化稳定性。令人遗憾的是，化学加氢导致反式脂肪酸形成，而反式脂肪酸和血液中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL或“坏”胆固醇)的升高相关联，因而使冠心病的风险增加。
另一个改进油质量的策略是通过培育低亚麻酸品种，这特别具有挑战性，因为C18:3含量是多基因性状并通过隐性方式以相对低的遗传力(W004072259)遗传。Burns等人(Heredity 90 =39-48,2003)鉴定了与甘蓝型油菜中的C18: 3的含量相关联的五个质量性状基因座(QTL)，其中三个具有正效应的基因座位于N6、N7和N18上，两个具有负效应的基因座位于N7和Nll上。源自“Stellar”(具有低C18:3含量(3% ))和“Drakkar”(具有常规C18:3含量(9%-10%))杂交的种群的遗传分析表明，低C18:3性状由两个主要的指定为LI和L2的具有加性效应的基因座控制(Jourdren等人，Euphytica 90 =351-357,1996)。发现控制C18:3含量的这两个主要基因座与两个FAD3(脂肪酸去饱和酶3)基因对应；一个位于N4的基因组A (源于白菜型油菜)上，另一个位于N14的基因组C (源于甘蓝)上(Jourdren 等人，Theor. Appl. Genet. 93 :512-518,1996 ；Barret 等人 GCIRC, 1999)。具有FAD3基因突变的卡诺拉油菜品种已经描述于现有技术中。例如，W006/034059描述了两种具有降低的亚麻酸含量的卡诺拉品种，认为頂COl和MC02(最初分别披露于 US5750827和美国专利申请号20080034457中)具有FAD3基因突变。W004/072259披露了FAD3等位基因(基因组C)，其具有在来自突变卡诺拉油菜品系DMS100 (具有大约3%亚麻酸含量)的5’剪接位点中的单核苷酸置换。W001/25453描述了来自低亚麻酸“Apollo”品种的具有多个氨基酸置换的新的FAD3变体，其中之一也存在于“Stellar”中。美国专利申请20040083503披露了一种在保守域中具有一个氨基酸置换的非功能性FAD3突变体。然而，包含这样的突变FAD3等位基因的卡诺拉植物的亚麻酸表型可依赖于遗传背景而高度变异。因此，尽管事实上各种FAD3等位基因序列在本领域中是可得的，仍然需要用于稳定地降低种子中的a-亚麻酸的量而对植物生长和发育没有负效应的替代方法(尤其是非转基因方法)。在以下不同实施方案、实例和权利要求中所描述的本发明提供了用于开发产生低C18:3含量种子油的作物植物的方法和手段。
发明概述诸位本发明人已经发现，甘蓝型油菜植物包含5种不同的FAD3基因，通过控制在种子中“功能性表达的"FAD3基因/等位基因(即产生功能性(生物活性)FAD3蛋白)的数量和/或类型，可以控制芸苔属植物特别是所述芸苔属植物种子油中的C18:3的水平。通过结合5个FAD3基因(“fad3等位基因”)的某些突变等位基因，从而导致功能性FAD3蛋白水平的降低，可以显著降低种子油中的C18:3的水平。人们认为在植物中结合的FAD3突变等位基因越多，则C18:3种子油含量的将降低越多，而维持了正常的植物生长和种子发育。因此，在第一方面，本发明在一个实施方案中提供了在其基因组中包含至少两个突变FAD3等位基因的芸苔属植物(及其部分，例如种子)，其中
i.第一突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A1或FAD3-C1组成的组；并且
ii.第二突变FAD3等位基因选自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2组成的组。
其中当与不包含所述一个或多个突变FAD3等位基因的类似植物的种子油比较时，所述植物的种子油呈现出在包含所述突变FAD3等位基因的一种植物的种子油中的总a-亚麻酸(C18:3)量的显著降低。本发明还提供了一种进一步包含第三完全敲除型突变FAD3等位基因的植物，其中所述第三完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A1或FAD3-C1组成的组，由此该突变FAD3等位基因是至少3种不同的FAD3基因的突变等位基因。在此还提供了一种进一步包含第四完全敲除型突变FAD3等位基因的植物，其中所述第四完全敲除型突变FAD3等位基因选自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2组成的组，由此该突变FAD3等位基因是至少4种不同的FAD3基因的突变等位基因。另外，本发明提供了一种进一步包含第五完全敲除型突变FAD3等位基因的植物，其中所述第五完全敲除型突变FAD3等位基因选自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2组成的组，由此该突变FAD3等位基因是至少5种不同的FAD3基因的突变等位基因。在另一方面，本发明提供了编码野生型和/或突变FAD3蛋白及其片段的核酸序列(分离的)、以及使用这些核酸序列来改变芸苔属种子油组成的方法。在此还提供了野生型和/或突变FAD3蛋白本身及其用途、以及包含这些突变FAD3等位基因和FAD3蛋白的植物。本发明进一步涉及包含一种或多种敲除突变FAD3等位基因的一种植物及其细胞、部分、种子和子代。一方面，与包含编码相应的功能性FAD3蛋白的FAD3等位基因的一种 植物及其细胞、部分、种子和子代相比，所述植物包含降低量的功能性FAD3蛋白。这样的植物及其细胞、部分、种子和子代可以用于获得产生具有改变的种子油组成的种子或籽粒，特别是用于获得产生具有显著降低的C18:3种子油含量的种子或籽粒的芸苔属植物(优选地维持农艺上适当的植物发育)。如在此所使用的，“植物部分”包括源自本发明植物的任何对象，包括植物部分，如细胞、组织、器官、种子、种子荚、种子粗粉、种子饼、种子脂肪或油。在另一方面，本发明涉及可以从根据本发明的植物中获得的具有降低的C18:3油含量的种子或籽粒、以及所述种子或籽粒的用途，例如用于种植和培育植物子代或用于生产种子粗粉、种子饼、种子脂肪或油。在本发明的另一方面，提供了用于产生和选择植物及其细胞、部分、种子和子代的方法，所述植物及其细胞、部分、种子和子代含有一种或多种完全敲除型FAD3等位基因。特别地，提供了用于产生和选择包含至少两种FAD3等位基因的芸苔属植物，尤其是甘蓝型油菜植物及其细胞、部分、种子和子代的方法，其在基因组中的至少两个不同基因座上含有至少两种完全敲除型突变FAD3等位基因(即，至少两种不同的FAD3基因)，并且所述方法用于在植物或植物部分中的突变FAD3等位基因与野生型FAD3等位基因的存在之间进行辨另IJ。因此，这些方法(如诱变和/或标记辅助选择)被提供用于产生和/或鉴定突变FAD3等位基因或包含此这些等位基因的植物或植物部分，并且用于使适当数量的突变FAD3等位基因结合在单株植物中，由此该植物具有显著降低的种子油含量。还提供了使用本发明的植物及其细胞、部分、种子和子代的方法，用于从压碎的芸苔属种子中获得“低亚麻酸”种子油。如在此所使用的，“植物产物”包括源自本发明的植物的任何对象，包括植物部分，例如种子、种子粗粉、种子饼、种子脂肪或油。
一般定义术语“核酸序列”(或核酸分子)是指处于单链或双链形式的DNA或RNA分子，特别是编码根据本发明的蛋白质或蛋白质片段的DNA。“内源核酸序列”是指植物细胞内的核酸序列，例如存在于芸苔属细胞的核基因组中的FAD3基因的内源等位基因。“分离的核酸序列”用于表示不再处于其天然环境中的核酸序列，例如体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。术语“基因”表示包含在细胞内被转录成RNA分子(例如，包含内含子序列的然后被剪接为成熟mRNA的前mRNA)的区域(转录区)的DNA序列，其可操作地连接到调节区(例如启动子)上。因此，基因可以包含若干可操作地连接的序列，例如启动子(一种包含例如涉及翻译起始的序列的5’前导序列)、(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)以及包含例如转录终止位点的3’非翻译序列。“内源基因”用于与“外源基因”、“转基因”或“嵌合基因”区分，并且是指来自某一植物属、种类或品种的植物的基因，不是通过转化引入植物的(即，它不是‘转基因’)，而是通常存在于所述植物属、种类或品种的植物中的，或者是从其通常存在的另一种植物属、种类或品种的植物中，通过普通的育种技术或通过体细胞杂交(例如原生质体融合)引入到植物中的。类似地，基因的“内源等位基因”不是通过植物转化引入到植物或植物组织中的，而是例如通过植物诱变和/或选择产生的，或通过筛选天然植物种群而获得的。术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用，并且是指由氨基酸的链组成的分子，不涉及特定的作用模式、大小、三维结构或来源。因此，FAD3蛋白的“片段”或“部分”还可以被称为“蛋白质”。“分离的蛋白质”用来指不再处于其天然环境中的蛋白质，例如体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。“酶”是一种包含酶促活性的蛋白质，例如功能性FAD3蛋白，能够 将亚油酸脱饱和成亚麻酸。如在此所使用的，“FAD3蛋白”也称为“脂肪酸去饱和酶3”、“ Q _3脂肪酸去饱和酶”或“ A-15去饱和酶”，是指引入C18:3脂肪酸生物合成中的第三双键的内质网(ER)驻留蛋白。脂肪酸去饱和酶是催化将双键引入(依赖于NAD-(P)H-和02)到亚甲基间断的脂肪酰基链的含铁酶。亲水性分析表明这些酶包含多达三个长的疏水域，所述该长疏水域足够长以两次跨越膜双层。这些酶包含三个保守的含有组氨酸的区域(组氨酸簇)，其具有相对于这些潜在的跨膜结构域的一致的定位。推定地涉及铁结合的在这些保守区域中的所有单组氨酸残基对于蛋白质功能显得是必需的(Shanklin等人，Biochemistry 33:12787-94,1994)。在 FAD3-A1(SEQ ID NO :2)中，在氨基酸位置 92、96、128、131、132、295、298 和 299上存在8个保守的推定的结合二铁的组氨酸(GenBank ACS26169. I)。术语“信号序列”或“信号肽”是指在蛋白质N端上的短肽链(3-60个氨基酸长)，其指导一种蛋白质到胞内细胞器例如内质网(ER)的初始靶向。ER驻留蛋白，例如FAD3，可以包含用于初始共翻译祀向(co-translational targeting)到ER的可切割的N端信号序列，而第一跨膜域也可作为指导共翻译蛋白合成并作为锚定膜内蛋白质的停止转移序列的不可切割的信号序列。证明的是芸苔属FAD3以共翻译的方式插入ER膜中(McCartney等人，2004，Plant Journal 37，第 156-173 页)。如在此所使用的“ER滞留基序”是负责静态ER滞留或从分泌途径中的其他区室回收的C端四肽基序-H/K/RDEL。已知对于基序的任何非保守氨基酸变化导致ER回收损失。FAD3包含作为ER滞留信号起作用的保守双赖氨酸基序(相对C端的氨基酸位置-3和-5)。五个C端氨基酸-KSKIN的截短或两个赖氨酸置换为丙氨酸分别导致FAD3错误定位到高尔基体或质膜上，以及FAD3酶活性的严重损害(McCartney等人，2004，Plant Journal 37，156-173页)。其他FAD3序列中的相应的氨基酸区域或残基可以通过本领域的已知方法找至IJ，例如通过确定最佳比对，如下所述。术语“FADS基因”在此是指编码脂肪酸去饱和酶(即，FAD3蛋白)的核酸序列。功能性“FAD3蛋白”具有脂酰去饱和酶活性，更具体地，它能够将亚油酸(C18:2)去饱和为亚麻酸(C18:3)。可以使用生物测定测试FAD3蛋白的功能性。为了确定特定FAD3基因/蛋白的功能和/或功能性，可以使用例如由Vrinten等人，(2005，Plant Physiol. 139 :79-87)或由Reed等人，(2000,Plant Physiol。122 :715-20)所描述的酵母表达系统或例如Reddy等人，(Plant Mol Biol 22 =293-300,1993)所描述的细菌表达系统。可替代地，编码FAD3蛋白的基因可以例如被转化到芸苔属(或其他植物)中，并且针对过表达表型筛选生成的转化体，例如在美国专利申请20040083503中所描述的。如在此所使用的，术语“等位基因”表示在特定基因座的基因的任何一种或多种可替代形式。在生物的二倍体(或双二倍体)细胞中，给定基因的等位基因位于染色体的特定位置或基因座(复数个基因座)上。一个等位基因存在于同源染色体对的每条染色体上。如在此所使用的，术语“同源染色体”表示这样的染色体，所述染色体含有相同生物学特征的信息，在相同的基因座上含有相同的基因，但可能这些基因的等位基因不同。同源染色体是在减数分裂过程中配对的染色体。“非同源染色体”代表了生物体的所有生物学特征，形成一组，而在细胞中的组数被称为倍性。二倍体生物含有两组非同源染色体，其中每组同源染色体是从不同的亲体遗传来的。在双二倍体种类中，实质上存在两组二倍体基 因组，由此将两组基因组的染色体称为“同源染色体”(类似地，两组基因组的基因座或基因被称为部分同源基因座或基因)。二倍体或双二倍体的植物种类在特定基因座上可以包含大量的不同的等位基因。如在此所使用的，术语“杂合”表示当两个不同的等位基因存在于特定基因座但是分别位于相应的在细胞中的同源染色体对上时所存在的遗传条件。相反地，如在此所使用的，术语“纯合”表示当两个相同的等位基因存在于特定基因座但是分别位于相应的在细胞中的同源染色体对上时所存在的遗传条件。如在此所使用的，术语“基因座(复数个基因座)”表示在染色体上的一个或多个特定位置或位点，其中发现了例如基因或遗传标记。例如“FAD3-A1”是指在其中发现FAD3-A1基因(以及两个FAD3-A1等位基因)的在染色体上的位置，而“FAD3-C1基因座”是指在其中发现FAD3-C1基因(以及两个FAD3-C1等位基因)的在染色体上的位置。如在此所使用的，“基本相似(essentially similar) ”是指具有至少75%、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、98 %、99 %或100 %的序列一致性的序列。这些核酸序列也可以被称为与提供在序列表中的FAD3序列“实质相同”或“基本相同”。两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列一致性”，表示为百分比，是指在两个最优比对序列中，具有相同残基的位置数(xlOO)除以比较的位置数。一个空位，即在比对中的一个位置，其中一个残基存在于一个序列中，但不存在另一个序列中，其被视为具有不相同残基的位置。根据European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS, Rice 等人，2000, Trends inGenetics 16(6) :276-277 ;参见例如 http://www. ebi. ac. uk/emboss/align/index, html)中的Needleman和Wunsch总体比对算法(Needleman and ffunsch, 1970, J Mol Biol 48(3)443-53)使用缺省设置(空位开放罚分=10(对于核苷酸)/10(对于蛋白质)和空位拓展罚分=0. 5 (对于核苷酸)/0. 5 (对于蛋白质))，通过在全长上比对两个序列来发现两个序列的“最优比对”。对于核苷酸使用的缺省评分矩阵是EDNAFULL，而对于蛋白质，使用的缺省评分矩阵是EBL0SUM62。可以使用“严紧杂交条件”来鉴定与给定的核苷酸序列实质相同的核苷酸序列。严紧条件是序列依赖性的，在不同的情况下将是不同的。通常，严紧条件被选择为比特定序列在定义的离子强度和PH下的热熔点(Tm)低大约5°C。Tm(在定义的离子强度和pH下)是50%的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。典型地，所选择的严紧条件是在pH 7和至少60°C的温度下，盐浓度为约0.02摩尔。降低盐浓度和/或增加温度增加了严紧性。用于RNA-DNA杂交的严紧条件(Northern印迹，使用例如IOOnt的探针)是例如包括在63°C下，在0. 2X SSC中至少洗涤一次持续20min的那些条件、或等效条件。“高严紧条件”可以例如通过如下来提供在65 °C的水溶液中杂交，该溶液含有 6XSSC(20XSSC 含有 3.0M NaCl、0. 3M 柠檬酸 Na，pH 7.0)、5XDenhardt' s (100XDenhardt' s含有2% Ficoll、2*%聚乙烯卩比咯烧酮、2%牛血清白蛋白)、0. 5%十二烷基硫酸钠(SDS)、以及作为非特异性竞争物的20 yg/ml变性的载体DNA (单链鱼精子DNA，具有120-3000个核苷酸的平均长度)。在杂交之后，可以在若干步骤中进行高严紧洗涤，其中最终洗涤(大约30分钟)是在杂交温度下，在0. 2-0. I X SSC,
0.1% SDS中进行。 “中度严紧条件”是指与在上述溶液中杂交等效的条件，但是在大约60°C -62°C。中度严紧洗涤可以在杂交温度下，在1XSSC、0. 1% SDS中进行。“低严紧性”指与在上述溶液中杂交等效的条件，但是在大约50°C -52°C。低严紧洗涤可以在杂交温度下，在2XSSC、0. 1% SDS中进行。还参见Sambrook等人，(1989)以及Sambrook和 Russell(2001)。术语基因或蛋白质的“直向同源物”在此是指在另一个种类中发现的同源基因或蛋白质，其具有与该基因或蛋白质相同的功能，但其序列(通常)从当包含这些基因(即，通过物种形成从共同祖先进化的基因)的种类发散时的时间点发散。因此可以基于序列比较(例如，基于整个序列或特定结构域的序列一致性百分比)和/或功能分析，鉴定在其他的植物种类(例如芥菜型油菜等)中的甘蓝型油菜FAD3基因的直向同源物。术语“突变体”或“突变”是指例如不同于所谓的“野生型(wild type)”变异体(也可写成“wildtype”或“wild-type”)的植物或基因，是指例如在自然界中最常出现的植物或基因的典型形式。“野生型植物”是指一种这样的植物，其具有在自然种群中的这种植物的最常见表型。“野生型等位基因”是指产生野生型表型所需要的基因的等位基因。突变植物或等位基因可以发生在自然种群中或者可以通过人工干预产生，例如，通过诱变，因此“突变等位基因”是指产生突变表型所需要的基因的等位基因。如在此所使用的，术语“突变 FAD3 等位基因”(例如突变体 FAD3-A1、FAD3-C1、FAD3-A2、FAD3-A3 或 FAD3-C2)是指FAD3等位基因，相比于相应的野生型等位基因，其指导显著降低量的功能性FAD3蛋白的表达。这可以通过编码非功能性FAD3蛋白的突变FAD3等位基因或者可以通过编码显著降低量的功能性FAD3蛋白或根本没有FAD3蛋白的突变FAD3等位基因而发生，如在此所使用的非功能性FAD3蛋白是指与对应的野生型功能性FAD3蛋白比较，没有显著改变的生物活性和/或具有显著降低的生物活性的FAD3蛋白。因此，与野生型等位基因相比，这种“突变FAD3等位基因”包含在其核酸序列中的一种或多种突变，由此该一种或多种突变优选地导致在体内细胞中的功能性FAD3蛋白的量(绝对或相对)的显著减少。核酸序列中的突变可以包括例如
(a)“错义突变”，是核酸序列中的改变，其导致一个氨基酸置换另一个氨基酸；(b)“无义突变”或“终止密码子突变”，所述突变是核酸序列中的改变，其导致提前终止密码子的引入，从而终止翻译(导致截短的蛋白质)；植物基因含有翻译终止密码子“TGA” (RNA中的UGA)，“TAA” (RNA中的UAA)和“TAG” (RNA中的UAG);因此，导致有待进入正在被翻译的成熟mRNA中(在阅读框中)的这些密码子之一的任何核苷酸置换、插入、缺失将使翻译终止。
(C) 一个或多个氨基酸的“插入突变”，是由于在核酸的编码序列中已经添加一个或多个密码子所致；
(d)—个或多个氨基酸的“缺失突变”，是由于在核酸的编码序列中已经缺失一个或多个密码子所致；
(e)“移码突变”，导致核酸序列被翻译在突变的不同的框下游。移码突变可能具有不同的原因，例如一个或多个核苷酸的插入、缺失或复制，而且影响前mRNA剪接(剪接位点突 变)的突变可以导致移码；
(f)“剪接位点突变”，其改变或取消前-mRNA序列的正确剪接，导致与野生型不同的氨基酸序列的蛋白质。例如，在RNA剪接过程中可以跳过一个或多个外显子，导致一种缺乏由跳过的外显子编码的氨基酸的蛋白质。可替代地，可以通过错误剪接，或者可以保留一个或多个内含子，或者可以产生替代的剪接供体或受体，或者可以在一个替代位置(例如在内含子内)开始剪接，或者可以产生替代的多腺苷酸化信号，来改变阅读框。正确的前mRNA剪接是一个复杂的过程，可以是受到FAD3编码基因的核苷酸序列中的各种突变的影响。在高等真核生物例如植物中，主要的剪接体剪接内含子，所述内含子在5'剪接位点(供体位点)含有GU，在3'剪接位点(受体位点)含有AG。核真核基因的大约99%的剪接位点遵循 GU-AG 法则(或 GT-AG 法则；参见 Lewin,Genes VI, Oxford University Press 1998,第885-920页，ISBN 0198577788)，同时内含子在5’和3’剪接位点含有其他的二核苷酸，例如GC-AG和AU-AC，分别仅占大约I %和0. I %。所希望的是，在核酸序列中的一个或多个突变优选地导致突变蛋白质，所述蛋白质包含显著降低的体内酶活性或没有体内酶活性，即C18:2到C18:3去饱和酶活性。根本而言，相对于野生型蛋白质，导致包含至少一个氨基酸插入、缺失和/或置换的蛋白质的任何突变可以导致显著降低的酶活性或没有酶活性。然而，应当理解的是，在蛋白质某些部分中的突变更可能导致突变FAD3蛋白的功能降低，例如导致截短的蛋白质的突变，由此缺失了功能和/或结构域的重要部分。如在此所使用的，“完全敲除型等位基因”是一个指导显著降低功能的FAD3表达或没有功能性FAD3表达的突变体等位基因，即，细胞体内显著降低量的功能性FAD3蛋白或没有功能性FAD3蛋白。完全敲除型突变FAD3等位基因包括例如编码区的整个部分或基本部分的缺失突变，或导致蛋白质的基本缺失或整体缺失的移码或终止密码子突变。例如，完全敲除型FAD3等位基因包括中断或缺失ER滞留基序的突变，该ER滞留基序存在于5个最C端氨基酸(-KSKTN)中。这将导致高尔基体或质膜中的蛋白质的ER回收的完全丧失和随后的累积，致使不能执行其功能(McCartney等人,2004,Plant Journal 37,156-173页)。因此，例如导致包括ER滞留基序的蛋白质的C端截短的任何终止密码子、移码或剪接位点突变将导致完全敲除型FAD3等位基因，如同编码基序自身的核苷酸序列中的错义突变(例如两个赖氨酸之一或两者的置换)、插入或缺失，即在FAD3-A1或其同源残基的编码序列中，从SEQ ID NO :11的1117位核苷酸(相应于SEQ ID NO 2的Lys373)开始并进一步延伸到相对于ATG起始密码子的下游。或者，一个完全敲除型突变FAD3等位基因包含使八个保守组氨酸残基中的任何一个缺失或中断的突变。例如，一个完全敲除型突变FAD3等位基因包含突变，例如相对于FAD3-A1编码序列(Genbank登录号FJ985689. I)中的ATG起始密码子在核苷酸274-276和核苷酸895-897之间的无义突变或移码突变，核苷酸274-276和核苷酸895-897分别编码第一个和最后一个保守组氨酸(FAD3-A1蛋白的His92和His299 ；Genbank登录号ACS26169. I)或其同源残基。在另一个实例中，导致任何这八个组氨酸残基的置换的错义突变将导致非功能性FAD3蛋白。仍然在另一个实例中，完全敲除型突变FAD3等位基因包含使编码八个结合二铁的组氨酸的核苷酸的任何一个缺失或改变、或改变相对于潜在跨膜域的八个结合二铁的组氨酸的一个或多个或彼此间的定位的插入、缺失或一个或多个剪接位点突变。一个完全敲除型突变FAD3等位基因的另一个实例是编码N端截短的FAD3蛋白的 FAD3等位基因。在编码第一个二铁组氨酸的核苷酸的突变上游的情况下，初始起始密码子下游的一个替代的ATG可以用于翻译起始，由此仍然可以形成N端截短的蛋白质。然而，这种截短将使通常起到将蛋白质靶向ER上的作用的潜在N端信号序列中断或缺失，导致FAD3错误定位到细胞溶质中，从而导致所述信号序列不能执行其正常功能。如在此所使用的，“显著降低量的功能性FAD3蛋白”(例如，功能性FAD3-AI、FAD3-A2、FAD3-A3、FAD3-C1和/或FAD3-C2蛋白质)指与不包含突变FAD3等位基因的细胞产生的功能性FAD3蛋白的量相比，通过含有突变FAD3等位基因的细胞产生的功能性FAD3蛋白的量降低至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100% (即，细胞不产生功能性蛋白)。该定义涵盖了在体内不具有生物活性(C18:2到C18:3去饱和酶活性)的“非功能性”FAD3蛋白(例如，截短的蛋白质)的产生、功能性蛋白的绝对量的降低(例如，由于FAD3基因突变产生的无功能FAD3蛋白)、和/或与功能性野生型FAD3蛋白(例如FAD3蛋白中的一个或多个氨基酸残基被另一个氨基酸残基置换或缺失，其中一个或多个氨基酸残基对于该编码的FAD3蛋白的生物活性是至关重要的)相比具有显著降低的生物活性的FAD3蛋白的产生。如在此所使用的，术语“突变FAD3蛋白”是指突变FAD3核酸序列(“ fad3等位基因”)编码的FAD3蛋白，由此与无突变野生型FAD3序列(“FAD3等位基因”)编码的FAD3蛋白的活性相比，该突变导致体内生物学FAD3活性(C18:2到C18:3去饱和酶活性)显著降低和/或无活性。如在此所使用的，“显著降低的C18:3含量”或“低a -亚麻酸”是指当与不包含一个或多个突变FAD3等位基因的相应植物的种子油相比时，存在于包含所述一个或多个突变FAD3等位基因的植物的种子油中的总a-亚麻酸(C18:3)的量的显著降低。在另一个实施方案中，包含一个或多个突变FAD3等位基因的所述植物的C18:3种子油含量降低到低于总种子油含量的11重量％、10重量、9重量、8重量、7. 0重量、6. 0重量、5. 0重量％、4.0重量％、3.0重量％、2.5重量％、2.0重量％、1.5重量％、1.0重量％、0.5重量％。应当理解的是，C18:3种子油含量可以改变，取决于遗传背景和生长条件(例如，温度)。不期望限制本发明，预期的是，相比于当植物生长在温室中时，当它们生长在田间时，其C18:3种子油水平通常是更高的。因此，为了确定根据本发明的植物(即包含一个或多个突变FAD3等位基因的植物)是否具有显著降低的C18:3种子油含量，应当将其与生长在相同条件下的不包含所述一个或多个突变FAD3等位基因的相应植物(即具有相同的遗传背景)进行比较，而不是评估绝对C18:3种子油水平。可以使用本领域的已知方法确定种子油的脂肪酸组成，包括C18: 3含量，例如通过从种子中提取脂肪酰并且通过毛细管气-液相色谱法分析它们在种子油中的相对水平，如TO09/007091中所述。如在此所使用的，“诱变”指这样的过程，其中使植物细胞(例如，芸苔属种子或其他部分，如花粉等)经受一种诱导细胞DNA中的突变的技术，例如与诱变剂或电离辐射(中子(如快中子诱变等)、a射线、Y射线(如由钴60源提供的)、X射线、UV辐射等)或这些之中的两项或更多项的组合相接触，所述诱变剂例如化学物质(例如，乙基磺酸甲酯(EMS)、乙基亚硝基脲(ENU)等)。因此，所希望的一个或多个FAD3等位基因的诱变可以通过使用化学方法例如通过使一种或多种植物组织与乙基磺酸甲酯(EMS)、乙基亚硝基脲等接触，使用物理手段例如X射线等，或通过Y辐射(如钴60源提供的)来实现。虽然由辐射产生的突变通常是大段缺失或其他的严重损伤，例如易位或复杂的重排，而化学诱变剂产生的突变通常是更离散的损伤，例如点突变。例如，EMS烷基化物鸟嘌呤碱基导致碱基错配烷基化的鸟嘌呤将与胸腺嘧啶碱基配对，主要导致G/C向A/T转变。在诱变之后，使用已知的技术从处理的细胞再生芸苔属植物。例如，可以根据常规的生长程序种植所获得的芸苔属种子，之后在植物上形成自花授粉种子。可替代地，可以提取双单倍体小植物，以立即形成纯合植物，例如，如由Coventry等人(1988, Manual for Microspore CultureTechnique for Brassica napus. Dep. Crop Sci.Techn. Bull. OAC Publication 0489.Univ. of Guelph, Guelph，安大略省，加拿大)所描述。可以收获作为此类自花授粉的结果的在这一代或后代中形成的另外的种子，并就突变FAD3等位基因的存在进行筛选。筛选特定突变等位基因的一些技术是已知的，例如Deleteagene (Delete-a-gene ；Li等人,2001,Plant J 27 :235-242)使用聚合酶链式反应(PCR)测定，来筛选通过快中子诱变产生的缺失突变，TILING(定向诱导基因组局部突变技术；McCallum等人,2000, Nat Biotechnol18 =455-457)鉴定了 EMS-诱导的点突变等。另外的筛选特定突变FAD3等位基因的存在的技术描述于以下实施例中。无论何时，除非另外指明，当涉及根据本发明的“植物”或“多种植物”时，可以理解为在此还涵盖了植物部分(细胞、组织或器官、种子荚、种子、已分离的部分如根、叶、花、花粉等)，保留了亲本的区别特征(特别是C18:3种子油含量)的植物子代，例如通过自交或杂交获得的种子，如杂交种子(通过杂交两株近交亲本品系获得的)，从其衍生的杂交植物和植物部分。“作物植物”指作为作物栽培的植物物种，例如甘蓝型油菜(AACC，2n = 38)、芥菜(AABB, 2n = 36)、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata) (BBCC, 2n = 34)、白菜型油菜(Brassica rapa)(同义词，芸苔(Brassica campestris)) (AA, 2n = 20),甘蓝(Brassicaoleracea) (CC,2n = 18)或黑芥(Brassica nigra) (BB,2n = 16)。定义没有涵盖草,例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)。 在此使用的“品种”与国际植物新品种保护公约(UPOV)规范一致，是指在单个已知最低级别的植物分类单位中的植物分组，所述分组可以通过由给定基因型或基因型的组合所导致的特征的表达来定义，可以通过至少一种所述特征的表达与任何其他植物分组进行区分，并且在关于它进行无变化(稳定)繁殖的适合性方面可以认为是一个单位。如在此所使用的，当关于一种植物而使用时，术语“非天然发生”或“栽培”表示具有已经人工修饰的基因组的植物。转基因植物，例如是含有外源核酸分子(例如含有转录区的嵌合基因)的非天然发生植物，所述转录区在被转录时产生能够降低内源基因表达的生物活性RNA分子(如根据本发明的FAD3基因)，因此已经被人工基因修饰。此外，在内源基因中含有由于暴露于诱变剂导致的突变，例如内源FAD3基因中的突变(例如在调控元件或在编码序列中)的植物也被认为是一种非天然发生的植物，因为其已经被人工基因修饰。此外，一种特定种类的植物例如甘蓝型油菜也被认为是非天然发生的植物，所述植物含有在该特定植物种类中并不发生在自然中的内源基因(如内源FAD3基因)中的突变，这是用与该植物相同或不同种类(例如芥菜型油菜或白菜型油菜)的植物进行的例如定向育种过程如标记辅助育种和选择或基因渗入的结果。相反，仅含自发或天然发生的突变的植物，即，没有经过人工基因修饰的植物，不是如在此定义的“非天然发生的植物”，因此不包括在本发明内。本领域技术人员理解的是，相比于天然发生的植物，非天然发生的植物通常具有 改变的核苷酸序列，但非天然发生的植物也可以被人工基因修饰而不改变其核苷酸序列，例如通过修饰其甲基化方式来进行。如在此所使用的，“农艺学上适合的植物发育”是指植物特别是含油种子油菜植物的发育，该发育在通常的农业实践中对其性能(更具体的是田间移植生长(establishment)、活力、开花时间、高度、成熟、抗倒伏性、产量、抗病性、抗裂角性等)无不利影响。因此，与已知具有平均C18:3种子油含量的植物相比，具有农艺学上适合的植物发育的显著降低的C18:3种子油含量的品系具有已经降低的C18:3种子油含量，同时保持相似的田间移植生长、活力、开花时间、高度、成熟、抗倒伏性、产量、抗病性、抗裂角性等。术语“包含”应当被理解为详细说明所陈述的部分、步骤或组分的存在，但不排除一种或多种其他的部分、步骤或组分的存在。应当理解的是，当提及处于单数形式的词语(例如，植物或根)时，复数形式(例如，复数个植物，复数个根)也包括在内。因此，通过不定冠词(“a”或“an”)提及一种要素时，并不排除存在一个以上的要素的可能性，除非上下文明确要求有一个要素以及仅有这些要素之一。因此，不定冠词单数形式(“a”或“an”)通常表示“至少一个”。
详细说明甘蓝型油菜(基因组么么0，211 =知=38)是异源四倍体(双二倍体)种类，由于它来源于二倍体祖先，实质上含有两个二倍体基因组(基因组A和C)，所述甘蓝型油菜在其基因组中包括位于基因组A和C上的两个FAD3基因，在下文中分别称为FAD3-A1和FAD3-C1。诸位发明人发现，甘蓝型油菜基因组包含另外三个FAD3基因，命名为FAD3-A2、FAD3-A3和FAD3-C2。在芸苔属育种品系优良雄株和优良雌株的杂交中发现，当与不含突变FAD3等位基因的甘蓝型油菜植物比较时，对于突变FAD3-A1或FAD3-C1等位基因是纯合的甘蓝型油菜植物显示出C18:3种子油含量显著降低，而对于任何新鉴定的FAD3基因中的突变是纯合的植物未展示C18:3的降低。进一步发现的是，除了对于FAD3-A1或FAD3-C1突变等位基因的纯合性以外，甘蓝型油菜中的处于纯合状态的一个第二突变FAD3基因的存在能进一步降低C18:3种子油含量(令人意外地，新的FAD3基因也是如此)。而且，除了处于纯合状态的FAD3-A1和FAD3-C1突变这两者以外，对于一个第三突变FAD3等位基因的纯合性能够将在温室中生长的植物的种子油中的C18:3含量降低至甚至低于总种子油含量的3%。此外观察到的是，叠加在该FAD3-A1和FAD3-C1基因的突变等位基因之上的另外的突变FAD3等位基因越多，则该C18:3油含量越低，生长在温室的芸苔属植物以及对于田间中的植物均是如此。因此，在一个第一实施方案中本发明提供了一种芸苔属植物，其包含具有两个不同FAD3基因的至少两个完全敲除型突变FAD3等位基因，其中，
i.该第一突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A1或FAD3-C1组成的组；且
ii.该第二突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2组成的组。在一个实施方案中提供了双突变植物，其对于该第一突变FAD3等位基因是杂合、或纯合的并且对于该第二突变FAD3等位基因是杂合或纯合的，其中该植物的基因型可以描述为(当该野生型等位基因被描述为FAD3时，该突变FAD3等位基因被缩写为fad3)
-FAD3-Al/fad3-al，FAD3-A2/fad3_a2-FAD3-Al/fad3-al，FAD3-A3/fad3_a3-FAD3-Al/fad3-al，FAD3-C3/fad3_c2-FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-A3/fad3_a3-FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fd3a-al，FAD3-A2/fad3~a2-fad3-al/fad3~al，FAD3-A3/fad3~a3-fad3-al/fad3-al，FAD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-cl, FAD3-A2/fad3_a2-fad3-cl/fad3-cI，FAD3-A3/fad3_a2-fad3-cl/fad3-cI，FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-A1/fad3~al， fad3~a2/fad3~a2-FAD3-A1/fad3~al， fad3~a3/fad3~a3-FAD3-Al/fad3-al， fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-a2/fad3-a2-FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-a3/fad3-a3-FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-cl/fad3-c2-fad3-al/fad3~al，fad3~a2/fad3~a2-fad3-al/fad3~al，fad3~a3/fad3~a3-fad3-al/fad3~al，fad3~c2/fad3~c2-fad3-cl/fad3-cl, fad3~a2/fad3~a2-fad3-cl/fad3-cl, fad3~a3/fad3~a2-fad3-cl/fad3-cl, fad3_cl/fad3~c2
其中该植物对于其余FAD3基因(例如FAD3-Al/fad3-al、FAD3-A2/fad3_a2相当于基因型 FAD3-Al/fad3-al、FAD3-A2/fad3-a2、FAD3-A3/FAD3-A3、FAD3-C1/FAD3-C1、FAD3-C2/FAD3-C2)的野生型等位基因是纯合的。本发明还提供了一种植物，其进一步包含一个第三完全敲除型突变FAD3等位基因，其中所述第三完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A1或FAD3-C1组成的组，由此这些突变FAD3等位基因是至少三个不同FAD3基因的突变等位基因。技术人员将清楚的是，当FAD3-A1被选择为该第一完全敲除型突变FAD3等位基因时，该第三完全敲除型突变FAD3等位基因将是FAD3-C1，反之亦然。因此，在另一个实施方案中提供了三突变植物，其对于该第一突变FAD3等位基因是杂合或纯合的、对于该第二突变FAD3等位基因的杂合或纯合的，且对于该第三突变FAD3等位基因是杂合或纯合的，其中该植物的基因型可以描述为(当该野生型等位基因被描述为FAD3时，该突变FAD3等位基因被缩写为fad3)
-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，FAD3-Cl/fad3_cl-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，FAD3-Cl/fad3_cl -FAD3-Al/fad3-al, FAD3-C2/fad3_c2，FAD3-Cl/fad3_cl-fad3-al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，FAD3-Cl/fad3_cl-fad3-al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，FAD3-Cl/fad3_cl-fad3-al/fad3-al, FAD3-C2/fad3_c2，FAD3-Cl/fad3_cl-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3_cl-FAD3-Al/fad3-al, fad3-c2/fad3-c2, FAD3-Cl/fad3_cl-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，fad3-cl/fad3-cl-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，fad3-cl/fad3-cl-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-C2/fad3_c2，fad3-cl/fad3-cl-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3-cl/fad3_cl-fad3-al/fad3~al, FAD3-A3/fad3~a3, fad3-cl/fad3_cl-fad3-al/fad3-al, FAD3-C2/fad3_c2，fad3-cl/fad3-cl-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-C1/fad3-cl-fad3-al/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, FAD3-C1/fad3-cl-fad3-al/fad3-al, fad3-c2/fad3-c2, FAD3-Cl/fad3_cl-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3_cl-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, fad3-cl/fad3_cl-FAD3-Al/fad3-al, fad3-c2/fad3-c2, fad3-cl/fad3-cl-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3_cl-fad3-al/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, fad3-cl/fad3_cl-fad3-al/fad3~al, fad3~c2/fad3~c2, fad3-cl/fad3_cl
其中该植物对于其余 FAD3 基因(例如 FAD3-Al/fad3-al、FAD3-A2/fad3-a2、FAD3-Cl/fad3-cl 相应于基因型 FAD3-Al/fad3-al、FAD3-A2/fad3_a2、FAD3-Cl/fad3_cl、FAD3-A3/FAD3-A3、FAD3-C2/FAD3-C2)的野生型等位基因是纯合的。人们认为，结合在一种植物中的突变FAD3等位基因越多，则C18:3种子油含量的降低就越多。因此，本发明还提供了一种植物，其进一步包含第四完全敲除型突变FAD3等位基因，其中所述第四完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2组成的组，由此该突变FAD3等位基因是至少四个不同FAD3基因的突变等位基因。技术人员将清楚的是，当FAD3-A2被选择为该第二完全敲除型突变FAD3等位基因时，该第四完全敲除型突变FAD3等位基因将是FAD3-A3或FAD3-C2。同样，当FAD3-A3被选择为该第二完全敲除型突变FAD3等位基因时，该第四完全敲除型突变FAD3等位基因将是FAD3-A2或FAD3-C2，并且当FAD3-C2被选择为该第二完全敲除型突变FAD3等位基因时，该第四完全敲除型突变FAD3等位基因将是FAD3-A2或FAD3-A3。因此，在另一个实施方案中提供了四突变植物，其对于该第一突变FAD3等位基因是杂合或纯合的、对于该第二突变FAD3等位基因是杂合或纯合的、对于该第三突变FAD3等位基因是杂合或纯合的，且对于该第四突变FAD3等位基因是杂合或纯合的，其中该植物的基因型可以被描述为(当该野生型等位基因被描述为FAD3时，该突变FAD3等位基因缩写为 fad3)
-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，FAD3-Cl/fad3_cl，FAD3-A3/fad3_a3-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，FAD3-Cl/fad3_cl，FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，FAD3-Cl/fad3_cl，FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，FAD3-Cl/fad3_cl，fad3-a3/fad3-a3-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，FAD3-Cl/fad3_cl，fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，FAD3-Cl/fad3_cl，fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，fad3-cl/fad3-cl, FAD3-A3/fad3_a3-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, fad2-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl，FAD3-A3/fad3_a3-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl，FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3_cl，FAD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，FAD3-Cl/fad3_cl，FAD3-A3/fad3_a3-fad3-al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，FAD3-Cl/fad3_cl，FAD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，FAD3-Cl/fad3_cl，FAD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-A3/fad3~a3-fad3-al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl，FAD3-A3/fad3_a3-fad3-al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl，FAD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-al, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3_cl，FAD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，FAD3-Cl/fad3_cl，fad3-a3/fad3-a3-fad3-al/fad3-al, FADD3-A3/fad3_a2，FAD3-Cl/fad3_cl，fad3-a3/fad3-c2-fad3-al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，FAD3-Cl/fad3_cl，fad3-c2/fad3-c2-FAD3-A/flad3-al, FAD3-A/fad3_a3，fad3-cl/fad3-cl, fad3-c3/fad3-a3-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，fad3-cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，fad3-cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl，fad3-a3/fad3-a3-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl，fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3_cl，fad3-c2/fad3-c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-A3/fad3~a3-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a3/fad3-a3, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, fad3~a3/fad3~a3-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, fad3-cl/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, fad3~a3/fad3~a3-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A3/fad3~a3, fad3-cl/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~a3/fad3~a3-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-A3/fad3~a3 -fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, fad3~a3/fad3~a3-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, fad3-cl/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2其中，该植物对于其余 FAD3 基因(例如 FAD3-Al/fad3-al、FAD3-A2/fad3-a2、FAD3-Cl/fad3-cl、FAD3-A3/fad3-a3 相应于基因型 FAD3-Al/fad3_al、FAD3-A2/fad3_a2、FAD3-C1/fad3-cl、FAD3-A3/fad3-a3、FAD3-C2/FAD3-C2)的野生型等位基因是纯合的。本发明还提供了一种植物，其进一步包含第五完全敲除型突变FAD3等位基因，其中所述第五完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2组成的组，由此该突变FAD3等位基因是至少五个不同FAD3基因的突变等位基因。因此，在另一个实施方案中提供了五突变植物，其对于该第一突变FAD3等位基因是杂合或纯合的、对于该第二突变FAD3等位基因是杂合或纯合的、该对于该第三突变FAD3等位基因是杂合或纯合的、对于该第四突变FAD3等位基因是杂合或纯合的，并且对于该第五突变FAD3等位基因的杂合或纯合的，其中该植物的基因型可以被描述为(当该野生型等位基因被描述为FAD3时，该突变FAD3等位基因被缩写为fad3)
-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-fad3-al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-fad3al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3~Cl/fad3_cl，FAD3~C2/fad3_c2-fad3al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3~Cl/fad3_cl，FAD3~C2/fad3_c2-fad3al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-fad3al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3~Cl/fad3_cl，FAD3~C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fa d3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3~a3/fad3 ~a3, FAD3-C1/fad3-cl, FAD3-C2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-A3/fad3~a3, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-A3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, FAD3-C2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, FAD3-C2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, FAD3-A3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, FAD3-C2/fad3~c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-A3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2-FAD3-A1/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, FAD3-C2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, daf3~a3/fad3~a3, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-A3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2在另一个实施方案中，本发明的这些植物包含突变FAD3等位基因，其包含一个无义(终止密码子)突变。在另一个实施方案中，本发明的这些植物包含突变FAD3等位基因，其是选自由LOLI105, LOLI103, LOLI108, L0LI111 或 LOLI115 组成的组。如在此所使用的，LOLI105或LOLI105是一个FAD3-A1基因组序列的一个突变等位基因，其分别是SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :2的编码序列或氨基酸序列，其在SEQ ID NO:I核苷酸位置2405、在SEQ ID NO : 11核苷酸位置732或在SEQ ID NO :2氨基酸位置244包含一种突变，导致在SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :11中的密码子TGG变为TGA或者在色氨酸SEQ ID NO : 2中的氨基酸变为终止。如在此所使用的，LOLI103或LOLI103是FAD3-C1基因组序列的一个突变等位基因，其分别是SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :12或SEQ ID NO :4的编码序列或氨基酸序列，其在SEQ ID NO :3中的核苷酸位置2702、在SEQ ID NO : 12中核苷酸位置543或在SEQ ID NO 4中的氨基酸位置181包含一个突变，导致在SEQ ID NO :3或SEQ ID NO : 12中的密码子TGG变为TGA变或者在SEQ ID NO 4中的氨基酸Trp变为终止(Trp to stop)。
如在此所使用的，LOLI108或LOLI108是FAD3-A2基因组序列的一个突变等位基因，其分别是SEQ ID NO :5、SEQ ID NO : 13或SEQ ID NO 6的编码序列或氨基酸序列，其在SEQ ID NO 5中的核苷酸位置3934、在SEQ ID NO 13中的核苷酸位置749或在SEQ IDNO 6中的氨基酸位置250包含一个突变，导致在SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 13中的密码子TGG变为TGA或者在SEQ ID NO :6中的氨基酸Trp变为终止。如在此所使用的，L0LI111或L0LI111是FAD3-A3基因组序列的一个突变等位基因，其分别是SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:14或SEQ ID NO :8的编码序列或氨基酸序列，其在SEQ ID NO 7中的核苷酸位置2847、在SEQ ID NO 14中的核苷酸位置552或在SEQ IDNO 8中的氨基酸位置184包含一个突变，导致在SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 14中的密码子TGG变为TGA或者在SEQ ID NO :8中的氨基酸Trp变为终止。如在此所使用的，LOLI115或L0LI115是FAD3-C2基因组序列的一个突变等位基因，分别是SEQ ID NO 9, SEQ ID N0:15或SEQ ID NO : 10的编码序列或氨基酸序列，其在SEQ ID NO :9中的核苷酸位置3909、在SEQ ID NO : 15中的核苷酸位置551或在SEQ ID NO:10中的氨基酸位置184包含一个突变，导致在SEQ ID NO :9或SEQ ID NO: 15中的密码子 TGG变为TGA或者在SEQ ID NO 10中的氨基酸Trp变为终止。在一个实施方案中，与不含本发明的突变FAD3等位基因的相应植物产生的功能性FAD3蛋白的量相比，本发明的植物可以产生功能性FAD3蛋白的量的显著降低。在另一个实施方案中，与不含突变FAD3等位基因的植物相比，该植物的种子可具有一个显著降低的C18:3种子油含量。在此进一步提供了来自芸苔属种类的野生型和突变FAD3基因/等位基因的核酸序列、以及野生型和突变FAD3蛋白。还提供了在芸苔属植物中产生和结合突变与野生型FAD3等位基因的方法、以及在其基因组中包含野生型与突变FAD3等位基因的特定组合的芸苔属植物和植物部分，由此C18:3种子油含量降低。使用这些植物将突变FAD3等位基因转移到其他植物也是本发明的一个实施方案，如所描述的任何植物的植物产物。另外提供了用于结合或检测突变FAD3基因和/或等位基因的标记辅助选择(MAS)的试剂盒和方法。下文详细描述了本发明的每个实施方案。
根据本发明的核酸序列提供了编码功能性FAD3蛋白的野生型FAD3核酸序列和来自十字花科(特别是来自芸苔属种类，尤其是来自甘蓝型油菜，也可以是来自其他芸苔属作物种类)的FAD3基因的突变FAD3核酸序列(其包含一个或多个突变，优选导致编码的FAD3蛋白没有生物活性或生物活性显著降低、或者导致不产生FAD3蛋白的突变)。例如，包含一个基因组A和/或C的芸苔属种类可以包含FAD3基因的不同等位基因，其可以被鉴定并且结合在根据本发明的一个单株植物中。另外，可以采用诱变方法在野生型FAD3等位基因中产生突变，由此产生用于根据本发明的用途的突变FAD3等位基因。由于特定的FAD3等位基因优选通过杂交和选择结合在一种植物中，在一个实施方案中该FAD3核酸序列被提供在一种植物内(即内源地)，例如一种芸苔属植物，优选一种可以与甘蓝型油菜杂交或可以用来制造一种“合成的”甘蓝型油菜植物的芸苔属植物。在本领域中描述了在不同芸苔属种类之间的杂交，例如，在 Snowdon(2007,Chromosome research 15 :85-95)中提到的。.种间杂交可以，例如，用于将基因从如甘蓝型油菜中的基因组C(AACC)转移到埃塞俄比亚芥中的基因组C(BBCC)中，甚至从如甘蓝型油菜中的基因组C(AACC)转移到芥菜型油菜的基因组B (AABB)中(通过在它们的基因组C和B之间的非常规重组的偶发事件)。通过杂交原始祖先，甘蓝型油菜(CC)和白菜型油菜(AA)，可以产生“再合成的”或“合成的”甘蓝型油菜品系。在芸苔属作物种类和其亲缘植物之间的杂交，可以成功克服种间还有属间的不亲和性障碍，例如通过胚胎拯救技术或原生质体融合(参见例如，Snowdon,见上文)。然而，在此还提供了分离的FAD3和FAD3核酸序列(例如，通过克隆从该植物中分离的或通过DNA合成来合成制备的)，以及在此提供了任何这些序列的变体及其片段，由于这些可以用来确定哪个序列在一种植物或植物部分中是内源地存在的，无论该序列是否编码一种功能性、非功能性的蛋白质或不编码蛋白质(例如，通过在重组宿主细胞中表达，如在此所述)，以及用于选择特定的等位基因并且将其从一个植物转移到另一个植物中，以便产生一种具有所希望的组合的功能和突变等位基因的植物。已经从甘蓝型油菜中分离出FAD3等位基因的核酸序列，如在序列表中所述。关于野生型FAD3序列，描述了野生型FAD3序列，同时在下文和实施例中描述了这些序列的突变FAD3序列以及与这些基本相似的序列。编码基因组FAD3蛋白的DNA、以及相应的前-mRNA， 包含被7个内含子(内含子1-7，从5’端开始编号)中断的8个外显子(外显子1-8，从5’端开始编号)。在该cDNA和相应的加工的mRNA (即剪接的RNA)中，内含子被去除并且外显子被连接，如在序列表中所示。外显子序列是在进化上更保守的，因此比内含子序列更少变化。根据本发明的“FAD3-A1核酸序列”或“FAD3-A1变体核酸序列”是编码与SEQ IDNO 2具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或者与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :11具有至少80%、至少85 %、至少90 %、至少95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的序列一致性的核酸序列。这些核酸序列也可以被称为与提供在序列表中的FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根据本发明的“FAD3-C1核酸序列”或“FAD3-C1变体核酸序列”是编码与SEQ IDNO 4具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或者与SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :12具有至少80%、至少85 %、至少90 %、至少95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的序列一致性的核酸序列。这些核酸序列也可以被称为与提供在序列表中的FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。
根据本发明的“FAD3-A2核酸序列”或“FAD3-A2变体核酸序列”是编码与SEQ IDNO 6具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%的序列一致性的氨基酸序列的核酸数列或者与SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :13具有至少80%、至少85 %、至少90 %、至少95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的序列一致性的核酸序列。这些核酸序列也可以被称为与提供在序列表中的FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根据本发明的“FAD3-A3核酸序列”或“FAD3-A3变体核酸序列”是与SEQ ID NO 8具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%的序列一致性的氨基酸序列的核酸数列或者与SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :14具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列一致性的核酸序列。这些核酸序列也可以被称为与序列表中提供的该FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根据本发明的“FAD3-C2核酸序列”或“FAD3-C2变体核酸序列”是编码与SEQ IDNO 10具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列或者与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :15具有至少80%、至少85 %、至少90 %、至少95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的序列一致性的核酸序列。这些核酸序列也可以被称为与提供在序列表中的FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。因此，本发明提供了编码野生型、功能性FAD3蛋白的核酸序列，包括其变体和片段(如下文进一步定义的)，以及任何这些序列的突变核酸序列，与野生型FAD3蛋白相比，该核酸序列中的突变优选地导致一个或多个氨基酸插入、缺失或置换。如已经提及的，优选地，该核酸序列中的一个或多个突变导致一个或多个氨基酸变化(即相对于野生型氨基酸序列，插入、缺失或置换一个或多个氨基酸)，由此该FAD3蛋白的生物活性显著降低或完全消除，或者由此表达显著降低量的功能性FAD3蛋白或不表达功能性FAD3蛋白。该FAD3蛋白生物活性的显著降低或完全消除在此是指结构和/或功能上相关的氨基酸残基或结构域(例如C-端ER驻留基序)的缺失或者中断，八种保守组氨酸的任何一种的缺失、置换或复位，和/或该信号序列的缺失或中断，这样使得与表达相应野生型FAD3等位基因的一种植物相比，表达该突变FAD3等位基因的一种植物的C18:3种子油含量降低。
在此提供了内源核酸序列和分离的核酸序列两者。还提供了以上定义的FAD3序列和FAD3变体核酸序列的片段，用作引物或探针以及用作根据本发明的另一个方面的试剂盒的组分(见下文)。一个FAD3或FAD3核酸序列或其变体的一个“片段”(如定义的)可以具有不同的长度，例如该FAD3编码序列(或其变体序列)的至少10、20、50、100、200、500、1000、1100个连续的核苷酸，或者例如该FAD3基因组序列(或其变体序列)的至少10、20、50、100、200、500、1000、2000、2900 个连续的核苷酸。
编码功能性FAD3蛋白的核酸序列描述于序列表中的核酸序列编码来自甘蓝型油菜的野生型、功能性FAD3蛋白。因此，这些序列对于它们自其分离的甘蓝型油菜植物来说是内源性的。可以针对其他的FAD3等位基因对其他芸苔属作物种类、品种、育种品系或野生登记物(wild accession)进行筛选，这些基因编码相同的FAD3蛋白或其变体。例如，可以使用核酸杂交技术(例如使用严紧杂交条件的Southern印迹)或基于PCR的技术来鉴定对于其他芸苔属植物(例如不同的甘蓝型油菜品种、品系或登记物)的内源FAD3等位基因，而且还可以针对其他的野生型FAD3等位基因对荠菜型油菜(特别是在基因组A上的FAD3等位基因)、埃塞俄比亚芥(特别是在基因组C上的FAD3等位基因)和白菜型油菜(基因组A)和甘蓝(基因组C)植物、器官或组织进行筛选。同样，也可以针对基因组B上的FAD3等位基因对黑芥(基因组B)、埃塞俄比亚芥(基因组B和C)和芥菜型油菜(基因组A和B)植物、器官或组织进行筛选。为了针对FAD3等位基因的存在对这些植物、植物器官或组织进行筛选，可以使用提供在序列表中的FAD3核酸序列，或任何这些序列的变体或片段。例如可以使用完整序列或片段作为探针或引物。例如可以使用特异性或简并引物从植物、植物器官或组织的基因组DNA或cDNA来扩增编码FAD3蛋白的核酸序列。可以使用标准分子生物学技术分离这些FAD3核酸序列并将其测序。然后，可以使用生物信息学分析来表征一个或多个等位基因，例如为了确定该序列对应哪种FAD3等位基因、以及该序列编码哪种FAD3蛋白或蛋白质变体。可以通过本领域已知的重组DNA技术分析一个核酸序列是否编码一种功能性FAD3蛋白，例如，通过一种遗传互补试验(使用例如对于完全敲除型FAD3是纯合的一种拟南芥属植物)、或者通过如上所述的方法。此外，可以理解的是，通过在核酸数据库中筛选基本相似的序列，可以用电脑(inSilico)鉴定FAD3核酸序列及其变体(或任何这些序列的片段)。同样，可以化学合成核酸序列。还提供了根据本发明的核酸分子的片段，将在下文中进一步描述。
编码突变FAD3蛋白的核酸序列相对于这些野生型核酸序列，包含一个或多个核苷酸缺失、插入或置换的核酸序列是本发明的另一个实施方案(同样地这些突变核酸分子的片段也是)。如下文进一步描述的，可以使用多种已知的方法产生和/或鉴定这些突变核酸序列(称为fad3序列)。此夕卜，以内源形式和分离的形式两者提供了这些核酸分子。在一个实施方案中，一个或多个突变导致所编码的FAD3蛋白的氨基酸序列中的一个或多个变化(缺失、插入和/或置换)(即，其不是一个“沉默突变”)。在另一个实施方案中，核酸序列中的一个或多个突变导致所编码的FAD3蛋白的生物活性显著降低或完全消失(相对于野生型蛋白质)。
因此，这些核酸分子可以包含一个或多个突变，例如如上已经详细描述的错义突变、无义突变或“终止”密码子突变、插入或缺失突变、移码突变和/或剪接位点突变。如已经提及的，所希望的是，核酸序列中的一个或多个突变优选地导致在细胞体内显著降低量的功能性FAD3蛋白或没有功能性FAD3蛋白。根本而言，相对于野生型蛋白质，导致一个包含至少一个氨基酸插入、缺失和/或置换的蛋白质的任何突变都可以导致显著降低的生物活性或没有生物活性。然而，可以理解的是，在蛋白质的某些部分的突变更可能导致该突变FAD3蛋白的功能降低，例如导致截短的蛋白质的突变，由此缺失或取代了该功能性氨基酸残基或结构域的重要部分，例如ER驻留信号、八个保守组氨酸残基或信号序列。因此，在一个实施方案中，提供了包含一个或多个上述任何突变类型的核酸序列。在另一个实施方案中，提供了包含一个或多个终止密码子(无义)突变的fad3序列。提供了任何上述突变核酸序列本身(以分离的形式)，如内源地包含这些序列的植物和植物部分。在下文的表2中描述了最优选的fad3等位基因。如在此所使用的，在FAD3等位基因中的一个无义突变是在FAD3等位基因中的这样一个突变，由此一个或多个翻译终止密码子被引入到相应的野生型FAD3等位基因的编码DNA和相应的mRNA序列中。翻译终止密码子是TGA (在mRNA中是UGA)、TAA (UAA)和TAG(UAG)。因此，导致在该编码序列中产生一个框内终止密码子的任何突变(缺失、插入或置换)将导致翻译的终止和氨基酸链的截短。在一个实施方案中，包含一个无义突变的一个突变FAD3等位基因是这样的FAD3等位基因，其中一个框内终止密码子通过单核苷酸置换(例如LOLI103, LOLI105, LOLI108, LOLI111和LOLI115)而被引入到该FAD3密码子序列中。在另一个实施方案中，包含一个无义突变的一个突变FAD3等位基因是这样的FAD3等位基因，其中一个框内终止密码子通过双核苷酸置换而引入到该FAD3编码序列中。在另一个实施方案中，包含一个无义突变的一个突变FAD3等位基因是这样的FAD3等位基因，其中一个框内终止密码子通过三核苷酸置换而被引入到该FAD3编码序列中。该截短的蛋白质缺乏由该突变的编码DNA下游(3’)所编码的氨基酸(即，该FAD3蛋白的C-端部分)，并保留了由该突变的编码DNA上游(5，)所编码的氨基酸(即，该FAD3蛋白的N-端部分)。在一个实施方案中，本发明提供了包含一个无义突变的突变FAD3等位基因，该突变FAD3等位基因是这样的FAD3等位基因，其中该无义突变存在于编码ER驻留基序(SEQ ID NO : 11的核苷酸1117-1131)的核苷酸的上游或包括该核苷酸的任何地方，因此至少缺乏赖氨酸375和/或赖氨酸373，或其同源残基。与野生型FAD3蛋白相比，该突变FAD3蛋白截短得越多，则该截短越有可能导致该FAD3蛋白在体内的功能性显著降低或无功能性。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一个突变FAD3等位基因，其包含SEQ ID NO :11的核苷酸895-897、核苷酸892-894或核苷酸883-885的上游(或包括SEQ ID NO : 11的核苷酸895-897、核苷酸892-894或核苷酸883-885)的一个无义突变即，导致少于SEQ ID NO 2的大约299、298或295个氨基酸的截短的蛋白质(缺乏第三组氨酸簇的第八、第七和/或第六保守组氨酸)。在另一个实施方案中，本发明提供了一个突变FAD3等位基因，其包含SEQ ID NO : 11的核苷酸394-396、核苷酸391-393或核苷酸382-384上游(或包括SEQ ID NO : 11的核苷酸394-396、核苷酸391-393或核苷酸382-384)的一个无义突变，即导致少于SEQ ID NO :2的大约131、130或128个氨基酸的截短的蛋白质(缺乏第二组氨酸簇的第五、第四和/或第三保守组氨酸)。 仍然在另一个实施方案中，本发明提供了一个突变FAD3等位基因，其包含SEQ ID N0:11的核苷酸286-288或核苷酸274-276上游(或包括SEQ ID NO 11的核苷酸286-288或核苷酸274-276)的一个无义突变，即导致少于SEQ ID NO 2的大约96或92个氨基酸的截短的蛋白质(缺乏第一组氨酸簇的第二和/或第一第六保守组氨酸)。如已经提及的，可以通过确定最佳比对来鉴定在其他FAD3核酸序列和FAD3氨基酸序列中的相应区域或残基。在另一个实施方案中，本发明提供了包含一个无义突变的突变FAD3等位基因，该无义突变导致使用一个可替代的ATG作为起始密码子以及合成缺乏推定信号序列的N-端截短的蛋白质。如在此所使用的，一个FAD3等位基因的错义突变是在FAD3等位基因中的任何突变(缺失、插入或置换)，其中一个或多个密码子改变成相应野生型FAD3等位基因的编码DNA和相应的mRNA序列，导致该野生型FAD3蛋白中的一个或多个氨基酸被置换成该突变FAD3蛋白中的一个或多个其他氨基酸。在一个实施方案中，包含一个错义突变的突变FAD3等位基因是一个这样的FAD3等位基因，其中该ER驻留基序的一个或多个氨基酸，即残基373-377，特别是FAD3-A1的赖氨酸373和/或375或其同源残基被取代。这些突变将引起ER定位的丧失。导致八个保守的结合二铁的组氨酸残基的一个或多个置换的错义突变也将导致蛋白质功能的完全丧失。此外，由于其ER定位的丧失，导致N-端信号序列中的氨基酸的置换的错义突变有可能导致一种非功能性酶。如在此所使用的，在FAD3等位基因中的一个移码突变是在FAD3等位基因中的这样的突变(缺失、插入、复制等等)，其导致该核酸序列在该突变的一个不同的框的下游被翻译，该突变引起体内显著降低量的功能性FAD3酶或不产生功能性FAD3酶。在FAD3等位基因中的一个剪接位点突变是一个这样的突变，其导致前mRNA的异常剪接，由此导致具有显著降低的活性或没有活性的突变蛋白质。改变前mRNA剪接并由此导致体内显著降低量的功能性FAD3酶或不产生功能性FAD3酶的任何突变(一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或置换)包含在此。在一个实施方案中，包含一个剪接位点突变的突变FAD3等位基因是这样的FAD3等位基因，其中改变的剪接是通过在该FAD3转录的DNA区域中引入5’剪接位点或3’剪接位点的共有二核苷酸的一个或多个核苷酸置换导致的，如上所述。例如，GU可以例如在该供体剪接位点中突变为AU和/或AG可以在该受体剪接位点序列中突变为AA。
根据本发明的氨基酸序列提供了野生型(功能性)FAD3氨基酸序列、以及来自十字花科的尤其是来自芸苔属种类，特别是来自甘蓝型油菜(但也可以来自其他芸苔属作物种类)的突变FAD3氨基酸序列(包括一个或多个突变，优选导致体内显著降低量的功能性FAD3酶或不产生功能性FAD3酶的突变)。例如，包含基因组A和/或C的芸苔属种类可以编码不同的FAD3氨基酸。此外，可以使用诱变方法在野生型FAD3等位基因中产生突变，从而产生可以编码其他突变FAD3蛋白的突变等位基因。在一个实施方案中，提供了在一种芸苔属植物中(即内源)的野生型和/或突变FAD3氨基酸序列。然而，在此还提供了分离的FAD3氨基酸序列(例如从该植物中分离的或人工合成的)、及其变体以及任何这些序列的片段。已经从分离自甘蓝型油菜的基因组DNA FDA3序列中推导出FAD3蛋白的氨基酸序、列，如在序列表中所描述。关于该野生型FDA3序列，描述了这些野生型FAD3序列，而在下文描述了这些序列的突变FDA3序列以及与这些序列基本类似的序列。在此描述的芸苔属的这些FAD3蛋白的长度为377至378个氨基酸，并且包含许多结构性和功能性结构域以及氨基酸残基，如上所述。根据本发明的“FAD3-A1氨基酸序列”或“FAD3-A1变体氨基酸序列”是与SEQ IDNO 2具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。这些氨基酸序列还可以被称为与提供在该序列表中的这些FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根据本发明的“FAD3-C1氨基酸序列”或“FAD3-C1变体氨基酸序列”是与SEQ IDNO 4具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以被称为与提供在该序列表中的这些FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根据本发明的“FAD3-A2氨基酸序列”或“FAD3-A2变体氨基酸序列”是与SEQ IDNO 6具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。这些氨基酸序列还可以被称为与提供在该序列表中的这些FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根据本发明的“FAD3-A3氨基酸序列”或“FAD3-A3变体氨基酸序列”是与SEQ IDNO 8具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。这些氨基酸序列还可以被称为与提供在该序列表中的这些FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根据本发明的“FAD3-C2氨基酸序列”或“FAD3-C2变体氨基酸序列”是与SEQ IDNO 10具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。这些氨基酸序列还可以被称为与提供在该序列表中的这些FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。因此，本发明提供了野生型、功能性FAD3蛋白的氨基酸序列两者，包括其变体和片段(如下文进一步定义的)，还提供了任何这些序列的突变氨基酸序列，与相应的野生型FAD3蛋白的生物活性相比，由此氨基酸序列中的突变优选地导致该FAD3蛋白的生物活性显著降低或完全消除。FAD3蛋白的生物活性的显著降低或完全消除在此是指C18:2转化为C18:3的显著降低，这样，相比于表达相应的野生型FAD3蛋白的一种植物，表达该突变FAD3蛋白的一种植物的种子油具有降低的C18:3含量。在此提供了内源性氨基酸序列和分离的氨基酸序列两者。还提供了以上定义的FAD3氨基酸序列和FAD3变体氨基酸序列的片段。一个FAD3氨基酸序列或其变体(如定义的)的一个“片段”可以具有不同的长度，例如该FAD3序列的(或其变体序列的)至少10、
12、15、18、20、50、100、150、200、250、300、350 或 370 个连续的氨基酸。
功能性FAD3蛋白的氨基酸序列序列表中描述的氨基酸序列是源自甘蓝型油菜的野生型、功能性FAD3蛋白。因此，这些序列对于分离它们的甘蓝型油菜植物是内源的。可以针对具有相同氨基酸序列的 其他的功能性FAD3蛋白或其变体对其他的芸苔属作物种类、品种、育种品系或野生登记物进行筛选，如上所述。此外，可以理解的是，通过在氨基酸数据库中筛选基本相似的序列，可以用电脑(in silico)鉴定FAD3氨基酸序列及其变体(或任何这些序列的片段)。还提供了根据本发明的氨基酸分子的片段。
突变FAD3蛋白的氨基酸序列相对于野生型氨基酸序列，包含一个或多个氨基酸缺失、插入或置换的氨基酸序列是本发明的另一个实施方案(这些突变氨基酸分子的片段也是)。如上所述，可以使用多种已知的方法产生和/或鉴定这些突变氨基酸序列。此外，以内源形式和分离的形式提供了这些氨基酸分子。在一个实施方案中，该氨基酸序列中的一个或多个突变导致该FAD3蛋白的生物活性显著降低或完全消除(相对于野生型蛋白质)。如上所述，基本上导致包含至少一个氨基酸插入、缺失和/或置换的蛋白质的任何突变(相对于野生型蛋白质)可以导致显著降低的生物活性或没有生物活性。然而，可以理解的是，在该蛋白质的某些部分中的突变更有可能导致该突变FAD3蛋白的功能降低，例如导致截短的蛋白质的突变，由此缺失或取代了功能性和/或结构性氨基酸残基或结构域的重要部分，例如ER驻留信号、八个保守氨基酸残基或信号序列，如上所述。因此在一个实施方案中，提供了包含一个或多个缺失或插入突变的突变FAD3蛋白，由此该一个或多个缺失、一个或多个插入或置换导致在体内具有显著降低的活性或没有活性的突变蛋白。这些突变FAD3蛋白是这样的FAD3蛋白，其中与野生型蛋白相比，缺失、插入或置换了至少 I、至少 2、3、4、5、10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、370 或更多个氨基酸，由此该一个或多个缺失或一个或多个插入导致在体内具有显著降低的活性或没有活性的突变蛋白。在另一个实施方案中，提供了截短的突变FAD3蛋白，由此该截短导致一个在体内具有显著降低或没有活性的突变蛋白。该截短的蛋白质缺乏由该突变的编码DNA下游(3’)(SP，该FAD3蛋白的C-端部分)编码的氨基酸，并且保留了由该突变的编码DNA上游(5，)(即该FAD3蛋白的N-端部分)编码的氨基酸。在一个实施方案中，本发明提供了一种截短的FAD3蛋白，其包含相应野生型FAD3蛋白的N-端部分，直到但不(完全)包括该ER驻留基序，即相应于SEQ ID NO 2的第375位和/或第373位赖氨酸残基的上游的任何地方，这样至少缺乏赖氨酸375和/或赖氨酸373(或其他FAD3蛋白中的相应赖氨酸残基)。与野生型FAD3蛋白相比，该突变FAD3蛋白被截短得越多，则该截短越有可能导致在体内FAD3蛋白活性的显著降低或没有活性。在另一个实施方案中，本发明提供了一种截短的蛋白质，其含有少于SEQ ID NO :2或其同源残基的大约299、298或295个氨基酸(缺乏第三组氨酸簇的第八、第七和/或第六保守组氨酸)，少于大约131、130或128个氨基酸(缺乏第二组氨酸簇的第五、第四和/或第三第六保守组氨酸)，少于大约96或92个氨基酸(缺乏第一组氨酸簇的第二和/或第一第六保守组氨酸)。仍然在另一个实施方案中，本发明提供了一种缺乏该推定信号序列的N-端截短的蛋白质。在另一个实施方案中，提供了包含一个或多个置换突变的突变FAD3蛋白，由此该置换导致在体内具有显著降低的活性或无活性的突变蛋白。这些突变FAD3蛋白是这样的FAD3蛋白，由此置换了具有特定功能(例如ER靶向或驻留或铁结合)的保守氨基酸残基。在一个实施方案中，提供了一种突变FAD3蛋白，其中置换了该ER驻留基序或其同源残基的一个或多个氨基酸，即SEQ ID NO :2的残基373-377，特别是赖氨酸373和/或375。这些突变将导致ER定位的丧失。还提供了突变FAD3蛋白，其具有八个保守组氨酸残基的一个或多个的置换，这种置换将导致蛋白质功能的完全丧失。此外，提供了突变FAD3蛋白，其具 有在N-端信号序列中的一个或多个氨基酸的一个或多个置换。由于初始ER靶向的丧失，这些置换可能导致一种非功能性FAD3蛋白。仍然在另一个实施方案中，提供了突变FAD3蛋白，其包含一个或多个插入或缺失突变，其中该一个或多个插入和/或一个或多个缺失导致在体内具有显著降低的活性或无活性的突变蛋白。这些突变FAD3蛋白是这样的FAD3蛋白，由此已经改变了具有一个特定功能的在保守氨基酸残基之间的定位。在一个实施方案中，提供了一种突变FAD3蛋白，其中在八个保守组氨酸的任何一个与推定跨膜结构域之间已经插入了一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，提供了一种突变FAD3蛋白，其中在八个保守组氨酸的任何一个与该推定跨膜结构域之间已经缺失了一个或多个氨基酸。这些突变可能导致该FAD3蛋白的一种改变的结构，并且可能导致其功能的丧失。
根据本发明的方法利用本领域常规的一系列方法，可以产生(例如通过诱变产生)和/或鉴定突变FAD3等位基因，例如采用基于PCR的方法来扩增部分或全部FAD3基因组或cDNA。诱变之后，采用已知技术，从处理的种子生长出、或从处理的细胞再生出植物。例如，可以根据常规的生长步骤种植诱变的种子，并且在自花授粉后，在该植物上形成种子。可替代地，可以从处理的小孢子或花粉细胞中提取双单倍体小植物，立即形成纯合植物，例如 Coventry 等人描述的(1988, Manual for Microspore Culture Technique forBrassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph，Guelph，安大略省，加拿大)。可以收获在这一代或下一代作为此类自花授粉的结果所形成的另外的种子，并筛选突变FAD3等位基因的存在，使用本领域的常规技术，例如基于聚合酶链反应(PCR)的技术(扩增该FAD3等位基因)或基于杂交的技术(例如Southern印迹分析、BAC库筛选等)、和/或FAD3等位基因的直接测序。为了在突变FAD3等位基因中筛选点突变(所谓的单核苷酸多态性或SNP)的存在，可以使用本领域常规的SNP检测方法，例如基于寡核苷酸连接(oligoligation)的技术、基于单碱基延伸的技术(如焦磷酸测序(pyrosequencing))、或基于限制酶切位点的差异的技术(如TILLING)。如上所述，特定野生型FAD3等位基因的诱变(自发的和诱导的)导致在生成的突变FAD3等位基因中存在一个或多个缺失、插入或置换的核苷酸(在下文中称为“突变区”)。因此，可以通过该野生型FAD3等位基因中的一个或多个缺失、插入或置换的核苷酸的位置和构型来表征突变FAD3等位基因。在该野生型FAD3等位基因中分别被一个或多个核苷酸插入、缺失或取代的位点再次也被称为“突变区或序列”。在此使用的“5’或3’侧翼区或序列”指在该突变(或相应的野生型)FAD3等位基因中的一个DNA区域或序列，所述DNA区域或序列是至少20bp、优选地至少50bp、至少750bp、至少1500bp和多达5000bp的DNA(该DNA与含有一个或多个缺失、插入或置换的核苷酸的DNA不同)，优选地，该DNA来自该突变(或相应的野生型)FAD3等位基因，其刚好位于该突变FAD3等位基因(或相应的野生型FAD3等位基因)突变区的上游并且与之相邻(5，侧翼区或序列)，或者刚好位于所述突变区的下游并且与之相邻(3’侧翼区或序列)。在此使用的一个“连接区”是指在该突变(或相应的野生型)FAD3等位基因中的一个DNA区域，在该DNA区域中，该突变区和该5’或3’侧翼区相互连接。因此，一个跨越在该突变区和该5’或3’侧翼区之间的连接区的序列包含一个突变序列以及与其邻近的侧翼序列。与相应的野生型FAD3等位基因的基因组特征相比，基于特定突变FAD3等位基因的特定基因组特征，例如，包含突变区的基因组区域的特定限制性酶切图谱、分子标记、或者侧翼和/或突变区的序列，开发了多种工具，以鉴定一种特定突变FAD3等位基因或者包含该特定突变FAD3等位基因的植物或植物材料、或者包括含有该特定突变FAD3等位基因的植物材料的产品。一旦对一种特定突变FAD3等位基因进行了测序，就可以通过一种分子生物学技术开发引物和探针，所述引物和探针特异性识别样品核酸(DNA或RNA)中的在该突变FAD3等位基因的5’侧翼、3’侧翼和/或突变区之内的一个序列。例如，可以开发用来鉴定在生物样品(例如植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品)中的该突变FAD3等位基因的PCR方法。这样的PCR是基于至少两种特异性“引物”(I)分别是一种识别该突变FAD3等位基因的5’或3’侧翼区中的一个序列，另一种识别该突变FAD3等位基因的3’或5’侧翼区中的一个序列；或者(2) —种识别该突变FAD3等位基因的5’或3’侧翼区中的一个序列，另一种识别该突变FAD3等位基因的突变区中的一个序列；或者(3)分别是一种识别该突变FAD3等位基因的5’或3’侧翼区中的一个序列，另一种识别跨越该特定突变FAD3等位基因的3’或5’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列(如下所述)。这些引物优选具有一个在15至35个核苷酸之间的序列，其在优化的PCR条件下“特异性识别”特定突变FAD3等位基因的在5’或3’侧翼区中的一个序列、在该突变区中的一个序列、或跨越3’或5’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列，以便从包含该特定突变FAD3等位基因的核酸样品中扩增一个特定片段(“突变FAD3特异性片段”或区分性扩增子)。这表示在优化的PCR条件下在植物基因组中仅有靶向的突变FAD3等位基因而没有其他序列被扩增。适合于本发明的PCR引物可以是以下各项
-长度范围在17nt至大约200nt的寡核苷酸，其包含选自特定突变FAD3等位基因的5’或3’侧翼序列或其互补序列(即，例如，在本发明的突变FAD3等位基因中的一个或多个核苷酸缺失、插入或置换的5’或3’侧翼的序列，例如在上述无义、错义、插入、缺失、移码或剪接位点突变的5’或3’侧翼的序列或其互补序列)的至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的一个核苷酸序列(识别5’侧翼序列的引物)；或
-长度范围在17nt至大约200nt的寡核苷酸，其包含选自特定突变FAD3等位基因的突变区的一个至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列(即，例如，在本发明的FAD3基因中插入或置换的核苷酸的序列或其互补序列)(识别突变序列的引物)。当然这些引物可以比提及的17个连续核苷酸长，并且可以是例如18、19、20、21、30、35、50、75、100、150、200个nt长或甚至更长。这些引物可以完全由选自所提及的侧翼和突变序列的核苷酸序列组成。然而，这些引物在其5’末端的核苷酸序列(即在3’定位的17个连续核苷酸外侧)是较不关键的。因此，这些引物的5’序列可以由一个选自侧翼或突变序列的核苷酸序列组成，但是在适当情况下可以含有若干个(例如1、2、5、10个)错配。这些引物的5’序列甚至可以完全由一个与该侧翼或突变序列无关的核苷酸序列组成， 例如像代表限制酶识别位点的核苷酸序列。这样的无关序列或具有错配的侧翼DNA序列优选地应当不长于100个，更优选地不长于50个或甚至25个核苷酸。此外，适合的引物可以包含一个跨越在侧翼与突变序列之间的连接区的核苷酸序列或者由其组成(即，例如，在本发明的该突变FAD3等位基因中的一个或多个缺失、插入或置换的核苷酸的5’或3’侧翼的序列与一个或多个插入或置换的核苷酸的序列或分别在一个或多个缺失的核苷酸的3’或5’侧翼的序列之间的连接区，例如，在本发明上述FAD3基因中的无义、错义、插入、缺失、译码或剪接位点突变5’或3’侧翼的序列与无义、错义或移码突变的序列之间的连接区，或者在以上指出的潜在终止密码子突变或以上指出的置换突变的5’或3’侧翼的序列与该潜在终止密码子突变或该置换突变的序列之间的连接区)，条件是该核苷酸序列不是专一地源自该突变区或侧翼区。对于本领域技术人员立即清楚的是，适当选取的PCR引物对还应当不包含彼此互补的序列。出于本发明的目的，“SEQ ID No :X代表的核苷酸序列的互补序列”是这样的核苷酸序列，其可以根据查加夫法贝1J (Chargaff ’ s rule) ( A*^T；Cj4- C )通过用其互补的核苷酸来取代该核苷酸，并以5’至3’方向阅读该序列(即，与所代表的核苷酸序列相反的方向)而源自所代表的核苷酸序列。适合于鉴定特定突变FAD3等位基因的引物的例子描述于实施例中。如在此所使用的，“从位置X到位置Y的核苷酸序列SEQ ID No. Z”表示包括两个核苷酸端点的核苷酸序列。优选地，该扩增的片段具有在50至1000个核苷酸之间的一个长度，例如在50至500个核苷酸之间的一个长度，或在100至350个核苷酸之间的一个长度。特异性引物可以具有一个与特定突变FAD3等位基因的5’或3’侧翼区中的一个序列、突变区中的一个序列或跨越3’或5’侧翼与突变区之间的连接区的一个序列具有80至100%同一性的序列，条件是这些错配仍然允许用这些引物在优化的PCR条件下特异性地鉴定该特定突变FAD3等位基因。然而，通过实验可以容易确定可允许的错配范围，这是本领域技术人员已知的。“突变FAD3特异性片段”的检测和/或鉴定可以存在多种方法，例如，通过在凝胶或毛细管电泳之后的大小评估、或者通过基于荧光的检测方法。还可以对突变FAD3特异性片段直接测序。用于检测扩增DNA片段的其他序列特异性方法也是本领域已知的。本领域描述了标准的PCR实验方案，例如“PCR应用手册”(Roche MolecularBiochemicals，第2版，1999)和其他参考文献。对于各个特定突变FAD3等位基因，在“PCR鉴定实验方案”中详细说明了优化的PCR条件，包括特异性引物的序列。然而，应当理解的是，可能需要将PCR鉴定实验方案中的多个参数调整到特定的实验室条件，并且可以略加修改以获得相似的结果。例如，使用不同的制备DNA的方法可能需要调整例如所使用的引物的量、聚合酶、氯化镁(MgCl2)浓度或退火条件。同样，其他引物的选择可以指定用于PCR鉴定实验方案的其他优化条件。然而，这些调整对本领域技术人员而言是清楚的，并且进一步详述在当前的PCR应用手册中，例如上文所引用的。可替代地，可以使用特异性引物来扩增突变FAD3特异性片段，所述片段可以用作“特异性探针”，用于鉴定在生物样品中的特定突变FAD3等位基因。在允许该探针和该核酸中的相应片段的杂交的条件下，使生物样品的核酸与该探针接触，导致形成一种核酸/探 针杂交体。可以检测这种杂交体的形成(例如，该核酸或探针的标记)，由此该杂交体的形成指示特定突变FAD3等位基因的存在。本领域中已经描述了这样的基于与一种特异性探针杂交(在一种固相载体上或在溶液中)的鉴定方法。该特异性探针优选是这样的序列，其在优化的条件下与该特定突变FAD3等位基因的5’或3’侧翼区之内和/或突变区之内的一个区域(在下文中称为“突变FAD3特定区域”)特异性地杂交。优选地，该特异性探针包含在10至IOOObp之间、在50至600bp之间、在100至500bp之间、在150至350bp之间的一个序列，其与一个特定区域的核苷酸序列至少80%，优选在80%至85%之间，更优选在85 %至90 %之间，特别优选在90 %至95 %之间，最优选在95 %至100 %之间是一致的(或互补的)。优选地，该特异性探针将包含一个大约13至大约100个连续的核苷酸的序列，所述核苷酸序列与该特定突变FAD3等位基因的一个特定区域是一致的(或互补的)。适合于本发明的特异性探针可以是以下各项
-长度范围在13nt至大约IOOOnt的寡核苷酸，其包含选自特定突变FAD3等位基因的5’或3’侧翼序列的至少13个连续核苷酸的一个核苷酸序列或其互补序列(即，例如，在本发明的突变FAD3等位基因中的一个或多个缺失、插入或置换的核苷酸的5’或3’侧翼的序列，例如上述无义、错义、插入、缺失、移码突变或剪接位点的5’或3’侧翼的序列，或无义、错义、插入、缺失或移码突变的5’或3’侧翼的序列)，或者与之具有至少80%序列一致性的序列(识别5’或3’侧翼序列的探针)；或者
-长度范围在13nt至大约IOOOnt的寡核苷酸，其包含选自特定突变FAD3等位基因的突变序列的至少13个连续核苷酸的一个核苷酸序列或其互补序列(即，例如，在本发明的该FAD3基因中插入或置换的核苷酸的序列，或其互补序列)，或者与之具有至少80%序列一致性的序列(识别突变序列的探针)。这些探针可以完全由选自提及的侧翼和突变序列的核苷酸序列组成。然而，在这些探针的5’或3’末端的核苷酸序列是较不关键的。因此，这些探针的该5’或3’序列可以由选自侧翼或突变序列的一个核苷酸序列组成，但是在适当情况下也可以由一个与侧翼或突变序列无关的核苷酸序列组成。这样的无关序列应当优选地不长于50个，更优选地不长于25个或甚至不长于20个或15个核苷酸。
而且，适合的探针可以包含这样一个核苷酸序列或由其组成，该核苷酸序列跨越了侧翼与突变序列之间的连接区(即，例如，在本发明的突变FAD3等位基因中的一个或多个核苷酸缺失、插入或置换的5’或3’侧翼的序列与一个或多个插入或置换的核苷酸的序列或分别在一个或多个缺失的核苷酸的3’或5’侧翼的序列之间的连接区，例如，在上述本发明的FAD3基因中的无义、错义、插入、缺失、移码或剪接位点突变的5’或3’侧翼的序列与无义、错义、插入、缺失失、移码或剪接位点突变的序列之间的连接区)，条件是该提及的核苷酸序列不专一地源自该突变区或侧翼区。适合于鉴定特定突变FAD3等位基因的特异性探针的例子描述于实施例中。与特异性探针杂交的“突变FAD3特定区域”的检测和/或鉴定可以存在多种方法，例如，通过在凝胶电泳之后的大小评估、或者通过基于荧光的检测方法。用于检测与特异性探针杂交的“突变FAD3特定区域”的其他的序列特异性方法也是本领域已知的。可替代地，可以使用其他方法产生和鉴定包含一个或多个突变FAD3等位基因的植物或植物部分，例如“Delete-a-gene ”方法，所述方法使用PCR来筛选通过快中子诱 变(综述见 Li 和 Zhang, 2000, Funct Integr Genomics 2 :254-258)产生的缺失突变体，例如鉴定EMS-诱导的点突变的TILLING (定向诱导基因组局部突变技术)，其使用变性高效液相色谱分析(DHPLC)通过异源双链分析检测碱基对变化等(McCallum等人，2000，NatBiotech 18 :455，和 McCallum 等人 2000，Plant Physiol 123,439-442)。如所提及的，TILLING使用针对突变的高通量筛选(例如使用突变体-野生型异源双链DNA的Cel I切割以及使用一种测序胶系统的检测)。因此，在此涵盖了使用TILLING来鉴定包含一个或多个突变FAD3等位基因的植物或植物部分、以及用于产生和鉴定这样的植物、植物器官、组织和种子的方法。因此在一个实施方案中，根据本发明的方法包含以下步骤诱变植物种子(例如EMS诱变)、植物个体或DNA的汇合、感兴趣区域的PCR扩增、异源双链体的形成和高通量检测、突变植物的鉴定、突变PCR产品的测序。应当理解的是，同样可以使用其他诱变和选择方法来产生这样的突变植物。除了在FAD3基因中诱导突变以外，可以通过本领域已知方法鉴定天然(自发)突变等位基因。例如，可以使用ECOTILLING(Henikoff 等人，2004，Plant Physiology 135(2)630-6)来筛选在多种植物或植物部分中的天然突变FAD3等位基因的存在。对于上述诱变技术，优选地包含基因组A和/或C的芸苔属种类被筛选，这样所鉴定的FAD3基因可以通过杂交(种内或种间杂交)和选择随后引入到其他芸苔属种类(例如甘蓝型油菜)中。在EC0TILLING中，通过上述TILLING方法学，筛选育种品系或相关种类中的天然多态性，其中，使用单个植物或植物库进行FAD3靶的PCR扩增、异源双链形成和高通量分析。在此之后，可以选择具有一个所需突变的单个植物，其随后可以被用于育种计划中以掺入所希望的突变等位基因。然后，可以对这些鉴定的突变等位基因进行测序，并且可以将该序列与该野生型等位基因比较，以鉴定一个或多个突变。任选地，可以如上所示测试功能性。采用这种方法可以鉴定多个突变FAD3等位基因(以及包含这些等位基因中的一个或多个的芸苔属植物)。然后，进一步如下所述，可以通过杂交和选择方法，将所希望的突变等位基因与所希望的野生型等位基因组合。最后，产生了一个包含所希望的数量的突变FAD3和所希望的数量的野生型FAD3等位基因的单个植物。
适合作为PCR引物或特异性探针用于检测特定突变FAD3等位基因的寡核苷酸也可以用来开发确定该特定突变FAD3等位基因的接合性状态的方法。为了确定特定突变FAD3等位基因的接合性状态，可以开发一种基于PCR的测定来确定突变和/或相应的野生型FAD3特异性等位基因的存在为了确定特定突变FAD3等位基因的接合性状态，可以以这样的方式设计特异性识别野生型FAD3等位基因的两种引物，即两种引物针对彼此且具有位于两种引物之间的突变区。这些引物可以是分别特异性识别5’和3’侧翼序列的引物。该组引物允许该突变体以及相应的野生型FAD3等位基因的同步诊断性PCR扩增。可替代地，为了确定一个特定突变FAD3等位基因的接合性状态，可以以这种方式设计特异性识别野生型FAD3等位基因的两种引物，即两种引物针对彼此且其中一种特异性识别突变区。这些引物可以是分别特异性识别野生型FAD3等位基因的5’或3’侧翼区 和突变区的引物。该组引物与特异性识别突变FAD3等位基因中的突变区的序列的一个第 三引物一起，允许突变FAD3基因以及野生型FAD3基因的同步诊断性PCR扩增。可替代地，为了确定一个特定突变FAD3等位基因的接合性状态，可以以这种方式设计特异性识别野生型FAD3等位基因的两种引物，即两种引物是针对彼此的并且其中一种特异性识别在5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区。这些引物可以是分别特异性识别野生型FAD3等位基因的5’或3’侧翼序列和在突变区与3’或5’侧翼区之间的连接区的引物。该组引物与第三弓I物一起，允许突变FAD3基因以及野生型FAD3基因的同步诊断性PCR扩增，所述第三引物特异性识别突变FAD3等位基因的在突变区与3’或5’侧翼区之间的连接区。可替代地，可以通过使用替代的引物组来确定特定突变FAD3等位基因的接合性状态，这些引物组特异性识别突变和野生型突变FAD3等位基因。如果该植物对于突变FAD3等位基因或相应的野生型FAD3等位基因是纯合的，对于突变或野生型FAD3等位基因，上述诊断性PCR测定将产生一个典型的单PCR产品，优选在长度上是典型的。如果该植物对于突变FAD3等位基因是杂合的，将出现两种特异的PCR产品，其反映突变和野生型FAD3等位基因两者的扩增。例如可以通过在凝胶或毛细管电泳之后的大小评估(例如，对于包含导致从野生型和突变FAD3等位基因扩增的片段之间的大小差异的多个插入或缺失核苷酸的突变FAD3等位基因，从而所述片段可以在一种凝胶上可视地分离)；通过在凝胶或毛细管电泳之后，评估两种不同片段的存在或缺乏，由此任选地可以将突变FAD3等位基因的诊断性PCR扩增与野生型FAD3等位基因的诊断性PCR扩增分开进行；通过扩增片段的直接测序；或者通过基于荧光的检测方法，来进行野生型和突变FAD3特定PCR产品的鉴定。< 0适合于确定特定突变FAD3等位基因的接合性的引物的例子描述于实施例中。可替代地，为了确定特定突变FAD3等位基因的接合性状态，可以开发基于杂交的测定来确定突变和/或相应的野生型FAD3特定等位基因的存在。为了确定特定突变FAD3等位基因的接合性状态，可以以这样一种方式设计鉴定野生型FAD3等位基因的两种特异性探针，即每种探针特异性识别在FAD3野生型等位基因中的一个序列，并且突变区位于探针识别的序列之间。这些探针可以是分别特异性识别5’或3’侧翼序列的探针。这些探针的一种或者优选地两种的使用允许突变以及相应的野生型FAD3等位基因的同步诊断性杂交。可替代地，为了确定特定突变FAD3等位基因的接合性状态，可以以这样一种方式设计识别野生型FAD3等位基因的两种特异性探针，即其中一种特异性识别在FAD3野生型等位基因中的在突变区上游或下游(优选在突变区的上游)的序列，并且两种探针之一特异性地识别突变区。这些探针可以是分别特异性识别野生型FAD3等位基因的5’或3’侧翼区(优选5’侧翼区)、以及突变区的序列的探针。这些探针的一种或者优选地两种、任选地连同一个第三探针的使用允许突变以及野生型FAD3基因的诊断性杂交，所述第三探针特异性识别在突变FAD3等位基因中的突变区的序列。可替代地，为了确定特定突变FAD3等位基因的接合性状态，可以以这样一种方式设计识别野生型FAD3等位基因的特异性探针，即该探针特异性识别在野生型FAD3等位基因的5’或3’侧翼区(优选5’侧翼区)与突变区之间的连接区。这种探针任选地与一个第二探针一起允许突变和野生型FAD3等位基因的诊断性杂交，所述第二探针特异性识别在突变FAD3等位基因的5’或3’侧翼区(优选5’侧翼区)与突变区之间的连接区。
可替代地，可以通过使用可替代的多个探针组来确定一个特定突变FAD3等位基因的接合状态，这些探针组特异性识别突变和野生型FAD3等位基因。如果该植物对于突变FAD3基因或相应的野生型FAD3基因是纯合的，对于突变或野生型FAD3等位基因，上述诊断性杂交测定将产生一种典型的单特异性杂交产物，例如一个或多个杂交DNA(限制性)片段，优选地在长度上是典型的。如果该植物对于突变FAD3等位基因是杂合的，则可出现两种特异性杂交产物，其反映突变和野生型FAD3等位基因两者的杂交。例如可以通过在凝胶或毛细管电泳之后的大小评估(例如，对于包含导致来自野生型和突变FAD3等位基因中的杂交DNA(限制性)片段之间的大小差异的多个插入或缺失核苷酸的突变FAD3等位基因，由此所述片段可以在一种凝胶上可视地分离)；通过在凝胶或毛细管电泳之后评估两种不同的特异性杂交产物的存在或缺乏，由此任选地可以将突变FAD3等位基因的诊断性杂交与野生型FAD3等位基因的诊断性杂交分开进行；通过杂交DNA(限制性)片段的直接测序；或者通过基于荧光的检测方法，来进行野生型和突变FAD3特异性杂交产物的鉴定。适合于确定特定突变FAD3等位基因的接合性的探针的例子描述于实施例中。此外，还可以使用在此提供的特定突变FAD3等位基因特异性序列信息，开发针对特定突变FAD3等位基因的特异性的多种检测方法，这些检测方法不同于基于PCR或杂交的扩增方法。这些可替代的检测方法包括基于特定核酸结构的侵入性切割(invasive cleavage)的线性信号扩增检测方法,也称为Invader 技术(描述在美国专利5，985，557 “Invasive Cleavage of Nucleic Acids”，6001567 “Detection of NucleicAcid sequences by Invader Directed Cleavage，，,通过引用结合在此)，基于RT-PCR的检测方法，例如Taqman,或其他检测方法,例如SNPlex。简言之,在Invader 技术中，该革巴向突变序列可以例如与一个标记的第一核酸寡核苷酸(包含突变序列的核苷酸序列或跨越在5’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列)、并且与一个第二核酸寡核苷酸(包含与突变序列相邻且刚好在其下游的3’侧翼序列)杂交，其中该第一和第二寡核苷酸重叠至少一个核苷酸。通过这种杂交产生的双链体或三链体结构允许用酶(Gleavase )选择性探针切割，使靶序列完整。随后有可能通过一个中间步骤检测切割下来的标记探针，导致进一步的信号放大。如在此所使用的，一个“试剂盒”是指用于实施本发明方法的目的的试剂集合，更特别地用于生物样品中的特定突变FAD3等位基因的鉴定、或包含特定突变FAD3等位基因的植物材料的接合状态的确定等。更特别地，本发明的试剂盒的一个优选实施方案包括如上所述的用于特定FAD3等位基因鉴定的至少两种特异性引物、或用于接合性状态确定的至少两种或三种特异性引物。任选地，该试剂盒可以进一步包括任何在此描述的在PCR鉴定实验方案中的其他试剂。可替代地，根据本发明的另一个实施方案，试剂盒可以包含至少一个特异性探针，所述探针与生物样品的核酸特异性杂交，以鉴定其中的如上所述的特定突变FAD3等位基因的存在，用于特定突变FAD3等位基因的鉴定，或者包含至少两种或三种用于确定接合状态的特异性探针。任选地，该试剂盒可以进一步包括通过使用该特异性探针用于鉴定生物样品中的特定突变FAD3等位基因的任何其他试剂(例如但不限于杂交缓冲液，标记)。、
可以使用本发明的试剂盒(并且其组分可以被特异性地调整)，用于以下目的质量控制(例如，种子批的纯度)、检测植物材料或者包含或源自植物材料的材料(例如但不限于食品或饲料产品)中的特定突变FAD3等位基因的存在或缺乏。如在此所使用的，术语“引物”涵盖了能够在一个依赖模板的过程(如PCR)中引发新生核酸合成的任何核酸。典型地，引物是10至30个核苷酸的寡核苷酸，但可以使用更长的序列。引物可以被提供为双链形式，虽然单链形式是优选的。探针可以用作引物，但是被设计为与靶DNA或RNA结合，而无需用于一个扩增过程中。当提及特异性引物时，如在此所使用的术语“识别”是指这样的事实，即在该方法中所提出的条件下(例如PCR鉴定实验方案的条件)，这些特异性引物与特定突变FAD3等位基因中的核酸序列特异性杂交，由此通过阳性和阴性对照的存在来确定该特异性。当提及特异性探针时，如在此所使用的术语“杂交”是指这样的事实，即在标准严紧条件下，该探针与特定(突变或野生型)FAD3等位基因的核酸序列中的特定区域结合。如在此所使用的标准严紧条件是指在此描述的用于杂交的条件、或由Samtoook等人，1989，(Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbour LaboratoryPress,NY)描述的常规杂交条件，例如可以包括下列步骤1)将植物基因组DNA片段或BAC文库DNA固定在滤膜上，2)在65°C，6X SSC, 5X Denhardt试剂，0. 5% SDS和20 u g/ml变性载体DNA中使该滤膜预杂交I至2小时，3)添加已经标记的杂交探针，4)孵育16至20小时，5)在 68°C在 6X SSC, 0. I % SDS 中洗涤滤膜一次，30 分钟，6)在 68°C，6X SSC, 0. I % SDS中洗涤滤膜三次(在30ml中两次，各30分钟，在500ml中一次，10分钟)，以及7)将滤膜在_70°C下暴露于X射线膜持续4至48小时。如在此所使用的，“生物样品”是植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品。术语“植物”意指涵盖任何成熟阶段的植物组织，以及取自或源自任何此类植物的任何细胞、组织或器官，包括但不限于任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。如在此所使用的，“植物材料”指从植物获得的或源自植物的材料。包含植物材料的产品涉及食品、饲料或其他产品，所述产品使用植物材料生产或可能被植物材料污染。应当理解的是，在本发明的上下文中，针对特定突变FAD3等位基因特异的核酸的存在对这些生物样品进行测试，提示样品中核酸的存在。因此，本文所指的用于在生物样品中识别特定突变FAD3等位基因的方法，涉及生物样品中核酸的识别，所述核酸包含特定突变FAD3等位基因。本发明还涉及在一株植物中的特定FAD3等位基因的组合，涉及将一个或多个特定突变FAD3等位基因从一株植物转移到另一株植物，涉及包含一个或多个特定突变FAD3等位基因的植物，从这些植物获得的子代，并且涉及源自这些植物的植物细胞、植物部分和植物种子。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种用于将两个或更多个选择的突变FAD3等位基因结合在一株植物中的方法，所述方法包括下列步骤
a.产生和/或鉴定两株或更多株植物，每株包含如上所述的一个或多个选择的突变FAD3等位基因，
b.使包含一个或多个选择的突变FAD3等位基因的第一植物与包含一个或多个其他选择的突变FAD3等位基因的第二植物杂交，从杂交体(cross)收集Fl种子，以及任选地鉴定包含来自第一植物的一个或多个选择的突变FAD3等位基因和来自第二植物的一个或多个选择的突变FAD3等位基因的Fl植物，如上所述，
c.任选地，重复步骤(b)，直到获得包含所有选择的突变FAD3等位基因的Fl植物，
d.任选地，
-通过确定如上所述的突变FAD3等位基因的接合性状态，鉴定对于选择的突变FAD3等位基因是纯合或杂合的Fl植物，或
-通过进行以下步骤之一，产生对于一个或多个选择的突变FAD3等位基因是纯合的植物:0}
-从包含如上所述的一个或多个选择的突变FAD3等位基因的Fl植物的经处理的小孢子或花粉细胞中提取双单倍体植物，
-使包含一个或多个选择的突变FAD3等位基因的Fl植物自交一代或多代(y)，从自交体(selfing)中收集FlSy种子，并且鉴定对于如上所述的一个或多个突变FAD3等位基因是纯合的Fl Sy植物。在本发明的另一个实施方案中，提供了将一个或多个突变FAD3等位基因从一株植物转移到另一株植物的方法，所述方法包括以下步骤
a.产生和/或鉴定包含如上所述的一个或多个选择的突变FAD3等位基因的第一植物，或者通过在一株植物中结合一个或多个选择的突变FAD3等位基因来产生第一植物，如上所述(其中该第一植物对于一个或多个突变FAD3等位基因是纯合或杂合的)，
b.使包含一个或多个突变FAD3等位基因的第一植物与不包含一个或多个突变FAD3等位基因的第二植物杂交，从杂交体收集Fl种子(其中，如果第一植物对于突变FAD3等位基因是纯合的，则这些种子对于突变FAD3等位基因来说是杂合的；并且其中，如果第一植物对于突变FAD3等位基因来说是杂合的，则这些种子中的一半对于突变FAD3等位基因来说是杂合的，这些种子中的一半是不成对的，即不包含突变FAD3等位基因)，以及任选地鉴定包含如上所述的一个或多个选择的突变FAD3等位基因的Fl植物，
c.使包含一个或多个选择的突变FAD3等位基因的Fl植物与不包含一个或多个选择的突变FAD3等位基因的第二植物回交一代或多代(X)，从杂交体中收集BCx种子，并且在每一代中鉴定包含如上所述的一个或多个选择的突变FAD3等位基因的BCx植物，
d.任选地，产生对一个或多个选择的突变FAD3等位基因是纯合的BCx植物，这通过以下步骤之一来进行
-从包含如上所述的一个或多个所希望的突变FAD3等位基因的BCx植物的经处理的小孢子或花粉细胞中提取双单倍体植物，
-使包含一个或多个所希望的突变FAD3等位基因的BCx植物自交一代或多代(y)，从自交体中收集BCx Sy种子，并且鉴定出对于如上所述的一个或多个所希望的突变FAD3等位基因是纯合的BCx Sy植物。在本发明的另一个方面，第一和第二植物是十字花科植物，特别是芸苔属植物，尤其是甘蓝型油菜植物或来自其他的芸苔属作物种类的植物。在本发明的另一方面，该第一植物是十字花科植物，特别是芸苔属植物，尤其是甘蓝型油菜植物或来自其他芸苔属作物种类的植物，并且该第二植物是来自十字花科育种品系，特别是来自芸苔属育种品系，尤其是来自甘蓝型油菜育种品系或者来自其他芸苔属作物种类的育种品系的植物。如在此所使用的，“育种品系”优选地是一种纯合的植物品系，其可通过优选的基因型和/或表型与其他植物品系区别开，其用来产生杂交后代。仍然在本发明的另一个实施方案中，提供了一种方法用于生产植物，特别是芸苔属作物植物，例如甘蓝型油菜植物，所述植物的种子油具有显著降低的C18:3含量，但优选地保持农艺学上适合的发育，该方法包括将根据本发明的突变FAD3等位基因结合和/或转移进或转移到一株芸苔属植物，如上文所述。在本发明的一个方面，该植物是包含至少两个突变FAD3等位基因的芸苔属植物，其中种子油具有显著降低的C18:3含量，但该植物优选地保持农艺学上适合的发育，这通过将根据本发明的至少两个突变FAD3等位基因结合和/或转移进或转移到该芸苔属植物来实现，如上文所述。本发明还涉及一种植物的用途，特别是一种芸苔属作物植物，例如一种甘蓝型油菜植物，其包含一个或多个本发明的突变FAD3等位基因，用于将根据本发明的突变FAD3等位基因结合和/或转移进或至转移到一株芸苔属植物，如上文所述。仍然在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的突变FAD3等位基因用来降低一种芸苔属植物的种子油中的C18:3含量的用途。在本发明的另一方面，提供了本发明的植物和种子用于生产菜籽油的用途。在另外一个实施方案中，本发明提供了本发明的植物用于生产包含突变FAD3等位基因的种子或生产包含突变FAD3蛋白的油菜作物的用途。序列SEQ ID NO : I :来自甘蓝型油菜的FAD3-A1基因的基因组DNASEQ ID NO 2 2 :来自甘蓝型油菜的FAD3-A1蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO 3 :来自甘蓝型油菜的FAD3-C1基因的基因组DNASEQ ID NO 4 4 :来自甘蓝型油菜的FAD3-A2蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO 5 :来自甘蓝型油菜的FAD3-A2基因的基因组DNASEQ ID NO 6 :来自甘蓝型油菜的FAD3-A2蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO 7 :来自甘蓝型油菜的FAD3-A3基因的基因组DNASEQ ID NO 8 :来自甘蓝型油菜的FAD3-A3蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO :9 :来自甘蓝型油菜的FAD3-C2基因的基因组DNASEQ ID NO 10 :来自甘蓝型油菜的FAD3-C2蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO : 11 :来自甘蓝型油菜的FAD3-A1基因的编码区SEQ ID NO 12 :来自甘蓝型油菜的FAD3-C1基因的编码区SEQ ID NO: 13 13 :来自甘蓝型油菜的FAD3-A2基因的编码区SEQ ID NO 14 :来自甘蓝型油菜的FAD3-A3基因的编码区
SEQ ID NO 15 :来自甘蓝型油菜的FAD3-C2基因的编码区SEQ ID NO 16 :拟南芥属FAD3正向PCR引物SEQ ID NO 17 :拟南芥属FAD3反向PCR引物SEQ ID NO :18 :L0LI105FAM 探针SEQ ID NO :19 :L0LI105VIC 探针SEQ ID NO 20 L0LI 105Fw 引物SEQ ID NO 21 :L0LI105Rw 引物SEQ ID NO :22 :L0LI103FAM 探针SEQ ID NO :23 :L0LI103VIC 探针SEQ ID NO :24 L0LI103Fw 引物SEQ ID NO :25 L0LI103Rw 引物SEQ ID NO :26 :L0LI108FAM 探针SEQ ID NO :27 :L0LI108VIC 探针SEQ ID NO :28 L0LI108Fw 引物SEQ ID NO :29 L0LI108Rw 引物SEQ ID NO :30 :L0LI111FAM 探针SEQ ID NO 31 :L0LI111VIC 探针SEQ ID NO :32 L0LI11 IFw 引物SEQ ID NO :33 L0LI11 IRw 引物SEQ ID NO :34 :L0LI115FAM 探针SEQ ID NO :35 :L0LI115VIC 探针SEQ ID NO :36 L0LI115Fw 引物SEQ ID NO 37 L0LI115Rw 引物
实施例所有实施例基本如W009/007091所描述而进行，以其全部内容通过引用结合在此。
实施例I-甘蓝型油菜中的FAD3基因数目的确定以及FAD3基因的DNA序列的分离根据标准分子生物技术，使用一种探针筛选甘蓝型油菜研究春OSR品系(research spring OSR line)的细菌人工染色体(BAC)文库,所述探针是用具有SEQ IDN0:16和SEQ ID NO : 17的引物是从拟南芥属(Arabidopsis)基因组DNA扩增的，并且分离与该探针杂交的BAC集落(在下文称“阳性集落”)。根据标准分子生物技术，使用如上所述的相同探针对从这些阳性集落分离的BAC克隆DNA以及从甘蓝型油菜(AC)、白菜型油菜(AA)和甘蓝(CC)分离的基因组DNA进行Southern印迹分析。基于鉴定的阳性集落的BAC克隆DNA和从甘蓝型油菜、白菜型油菜和甘蓝分离的基因组DNA消化之后所获得的杂交图谱的对比，这些BAC克隆被分为5组，其中三组可映射到基因组A，两组可映射到基因组C。对于5组中的每一组，选择了一个BAC克隆
实施例2-来自甘蓝型油菜的FAD3基因序列的表征所选阳性集落的BAC克隆的全部DNA序列通过454测序确定，其后用拟南芥FAD3基因(GenBank登录号D26508)作为查询序列通过BLAST分析(Blast2seq)鉴定FAD3序列。用FgeneSH(Softberry, Inc. Mount Kisco, NY, USA)并且通过与具有拟南芥编码序列(GenBank登录号NM_128552)的基因序列的最佳比对来确定FAD3序列的内含子-外显子结构。FAD3基因的蛋白编码区域以及由这些核酸序列编码的FAD3氨基酸序列呈现于序列表中。在映射到基因组A的FAD3基因中，发现映射到N04的FAD3基因的序列与FAD3-A基因(GenBank登录号L22962)对应并且被命名为FAD3-A1，而映射到N05和N03的序列分 别被命名为FAD3-A2和FAD3-A3。在映射到基因组C的FAD3基因中，发现这些序列之一与FAD3-C基因(描述于W004/072259中)对应并且被命名为FAD3-C1，而发现另一个序列与FAD3-A2是同源的并且被命名为FAD3-C2。这些名称贯穿本说明书而被使用。FAD3基因的基因组序列呈现于序列表中。
实施例3-芸苔属FAD3基因的表达基因的相对和绝对表达水平。为了产生cDNA，使用TRIZOL试剂(Invitrogen)提取总RNA。对于每个胚芽的发育阶段，该操作重复进行三次。其后，将从同一发育阶段的胚的总RNA样品汇集，并且用GE Healthcare mRNA纯化试剂盒从总RNA样品提纯mRNA。在下一步骤中，使用SuperScript双链cDNA合成试剂盒(Invitrogen)制备cDNA。然后，根据SMART cDNA文库构建试剂盒(Clontech)中描述的实验方案使用CHROMA Spin-400柱根据大小进行cDNA分级。在cDNA序列分析之后，通过靶序列的读数进行转录本的定量。用每个时间点数据集中的序列的数目将每个FAD3基因的表达标准化。
表I :在14-35个花后天数(DAF)的甘蓝型油菜的胚中的总FAD3表达的标准化(norm)FAD3表达和百分比(％ )。
权利要求
1. 一种芸苔属植物，包含至少两种完全敲除型突变FAD3等位基因，其中 1.第一完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A1或FAD3-C1组成的组；并且 ii.第二完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C组成的组。
其中所述完全敲除型突变FAD3等位基因各自包含一种选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成(a)一种包含与 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7 或 SEQ IDNO 9具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；(b)一种包含与 SEQ ID NO 1U SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO : 14 或 SEQID NO 15具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；或(c)一种编码包含与 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 8 或 SEQID NO 10具有至少90%的序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。
2.如权利要求I所述的植物，进一步包含一个第三，或一个第三和一个第四，或一个第三、一个第四和一个第五完全敲除型突变FAD3等位基因，其中所述第三完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A1或FAD3-C1组成的组，并且其中所述第四和所述第五完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2组成的组，并且由此所述完全敲除型突变FAD3等位基因是具有不同FAD3基因的突变等位基因。
3.如权利要求I或2所述的植物，所述完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由LOLI105, LOLI103, LOLI108, L0LI111 或 LOLI115 组成的组。
4.一种FAD3基因的完全敲除型突变等位基因，包含一种选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成(a)一种包含与 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7 或 SEQ IDNO 9具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；(b)一种包含与 SEQ ID NO 1U SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO : 14 或 SEQID NO 15具有至少90%序列一致性的核苷酸序列；或(c)一种编码包含与 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 8 或 SEQID NO 10具有至少90%的序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的完全敲除型突变等位基因，选自由L0LI105、L0LI103、L0LI108、L0LI111或LOLI115组成的组。
6.一种芸苔属植物，包含FAD3基因的至少一种完全敲除型突变等位基因，该FAD3基因包含一种选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成(a)一种包含与 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7 或 SEQ IDNO 9具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；(b)一种包含与 SEQ ID NO 1U SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO : 14 或 SEQID NO 15具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；(c)一种编码包含与 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 8 或 SEQID NO 10具有至少90%的序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的芸苔属植物，其中所述完全敲除型突变等位基因是选自由LOLI105, LOLI103, LOLI108, L0LI111 或 LOLI115 组成的组。
8.—种如权利要求1、2、3、6或7的任一项所述的植物的植物细胞、种子或子代。
9.一种可以从权利要求1、2、3、6或7的任一项所述的植物的种子获得的种子油。
10.一种选自下组的芸苔属种子，该组由以下各项组成 -包含 FAD3-A1-LOLI105 和 FAD3-C1-LOLI103 (已经于 2009 年 10 月 9 日以登录号 NCMB41655保藏在NCMB Limited中)的芸苔属种子。
-已经于2009年10月9日以登录号NCMB 41656保藏在NCMB Limited 中的包含 FAD3-A2-L0LI108 和 FAD3-C2-LOLI115 的芸苔属种子。
-已经于2009年10月9日以登录号NCMB 41657保藏在NCMBLimited中的包含FAD3-A3-LOLI111的芸苔属种子。
11.一种用于确定在一种植物或其细胞、部分、种子或子代中的如权利要求4或5的任一项所述的突变FAD3等位基因的接合性状态的方法，包括确定在所述植物或其细胞、部分、种子或子代的基因组DNA中的突变和/或相应的野生型FAD3特定区域的存在。
12.一种用于将如权利要求4或5所述的至少两种选择的突变FAD3等位基因结合在一种植物中的方法，该方法包括以下步骤 (a)通过根据权利要求11确定该至少一种选择的突变FAD3等位基因的接合性状态，鉴定各自包含至少一种选择的突变FAD3等位基因的至少两种植物； (b)使这至少两种植物杂交,并且从至少一个杂交体收集Fl杂交种子；并且 (c)任选地，通过根据权利要求11确定该至少两种选择的突变FAD3等位基因的接合性状态，鉴定一种包含至少两种选择的突变FAD3等位基因的Fl植物。
13.一种降低在芸苔属植物种子油中的C18:3含量的方法，包括使至少两种完全敲除型FAD3等位基因结合在所述植物的基因组DNA中，其中 i.第一完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A1或FAD3-C1组成的组；并且 ii.第二完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2组成的组， 其中所述完全敲除型突变FAD3等位基因各自选自下组，该组由以下各项组成(a)一种包含与 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7 或 SEQ IDNO 9具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；(b)一种包含与 SEQ ID NO 1U SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO : 14 或 SEQID NO 15具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；或(c)一种编码包含与 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 8 或 SEQID NO 10具有至少90%的序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述植物进一步包含一个第三，或一个第三和一个第四，或一个第三、一个第四和一个第五完全敲除型突变FAD3等位基因，所述第三完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A1或FAD3-C1组成的组，且其中所述第四和所述第五完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2组成的组，由此所述完全敲除型突变FAD3等位基因是具有不同FAD3基因的突变等位基因。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述完全敲除型突变FAD3等位基因是选自由 LOLI105, LOLI103, LOLI108, L0LI111 或 LOLI115 组成的组。
16.如权利要求4或5所述的突变FAD3等位基因用来降低芸苔属植物的种子油中的C18:3含量的用途。
17.如权利要求1、2、3、6或7的任一项所述的植物或如权利要求8或10所述的种子用来生产菜籽油或油菜种子饼的用途。
全文摘要
本发明涉及包含突变FAD3等位基因、FAD3核酸序列和蛋白质的芸苔属植物，以及用于产生和鉴定所述植物和等位基因的方法，这些植物和方法可以用来获得具有降低的α-亚麻酸含量的种子油。
文档编号C12N9/02GK102712911SQ201080052417
公开日2012年10月3日 申请日期2010年11月19日 优先权日2009年11月20日
发明者B·拉加, P·德诺尔夫 申请人:拜尔作物科学公司