专利名称：新的肽酶底物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及新的化合物，其可用作PH指示剂和/或用作检测肽酶活性的酶底物。 这些底物可用于包括产生物理化学信号的酶促水解步骤的应用中，特别用于微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等中。本发明还涉及包含所述底物的反应培养基、所述底物或者所述培养基用于检测肽酶活性和/或区分革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌的用途，还涉及使用方法。
背景技术：
目前已有大量用于检测微生物的培养基。这种检测具体地可基于使用对期望检测的微生物的酶具有特异性的特定底物。一般而言，制备酶的合成底物以使该底物与其靶酶代谢的产物具有不同的物理化学性质，从而可区分它们，并且评价是否全部或者部分的底物已被酶转化成产物。水解酶底物通常由对要显示的酶活性特异性的第一部分以及用作标记物的第二部分(通常是发色或者发荧光的)组成。因此，在细菌的情况中，通过选择底物， 根据是否存在反应，可表征微生物的性质。肽酶活性可具体用来显示细菌的群、属或者种。 因此，例如，丙氨酸-氨肽酶活性使得可以区分革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌。用于检测肽酶活性的酶发色底物是本领域已知的。可具体提及的是Manafi的文章(Manafi等人，Microbiol Rev 55(3) :335_348，1991)，这是关于用于微生物学的酶底物的综述。但是，所述的氨肽酶底物通过水解释放扩散于培养基中的化合物(β_萘基胺， 7-氨基-4-甲基香豆素)。因此，在非均相反应培养基(培养皿上的菌落、组织切片等) 中，不可能准确定位水解的位置。还可提及由本申请人提交的专利申请WO 98/04735和WO 99/38995中所述的底物。但是，虽然这些底物少量扩散于培养基中，但是它们具有某些缺点它们难以合成，纯度低，收率低，并且它们对某些微生物具有毒性。
发明内容
因此，本发明提出新的化合物的用途，其用作ρΗ指示剂，或者用作肽酶底物，能够用来检测微生物。较之现有的底物，这些新的化合物易于合成，并且可具体地用于凝胶化的培养基中来检测微生物，因为它们产生的显色在反应培养基中少量或者根本不扩散。在用作酶底物的情况中，这使得能够在不表达肽酶活性的其他菌落或细胞器中准确地定位表达肽酶活性的菌落或者细胞器。在进一步描述本发明之前，为了便于公开本发明而作出以下定义。术语“_底物”是指这样底物，其可被酶水解成允许直接或间接地检测微生物、细胞或细胞器的产物。所述底物具体地包含对要显示的酶活性特异性的第一部分以及用作标记物的第二部分。本发明的用作底物的化合物适合用于流式细胞术，由于水解的产物主要保持位于表达酶活性的细胞中，因此可特异性地对表达此活性的细胞进行计数，乃至将它们从样品的其余部分分离。
本发明的用作底物的化合物还非常适合用于组织酶学，由于水解的产物主要保持在水解的位置处，因此可特异性地鉴定在组织内表达此活性的细胞或者细胞器。本发明的化合物由于它们的低毒性而非常适合分别用作pH指示剂，或者监测细胞培养物中的肽酶活性。本发明的化合物特别适合用于检测和/或鉴定培养基，因为它们产生不扩散于反应培养基中的显色或者荧光。 在本发明中，术语“显色”涵盖染色、吸收可见光谱的光或者荧光，以及在一种波长吸收(λ ex)并在更高的波长发射(λ Μ，λ Μ > λ ex)。本发明的化合物可成盐，即为盐的形式，例如，氯化物、溴化物、碘化物或者三氟乙酸盐。术语“pH指示剂”是指颜色和/或荧光随着培养基的PH改变而改变的化学物质， 其中所述PH改变任选地与在所述培养基上生长的微生物的代谢相关。术语“M”是指能够通过水解切割肽的酰基残基与伯胺之间形成的酰胺基团的酶。术语“MM”是指能够通过水解切割氨基酸的酰基与伯胺之间形成的酰胺基团的酶。 在本申请中，术语“肽酶”可适当地表示以上定义的肽酶和氨肽酶。术语“肽”是指包含1-10个氨基酸，优选1-4个氨基酸的肽链。优选地，所述肽是二丙氨酸或者三丙氨酸。术语“a^M”是指本领域技术人员已知的任何天然的或者非天然的氨基酸。根据本发明的一具体实施方案，所述氨基酸是β-丙氨酸或L-丙氨酸或D-丙氨酸，或者甘氨酸、焦谷氨酰基等。所述肽可包含在其N末端的封端剂。本发明的封端剂包括本领域技术人员已知的能够保护胺的任何封端剂。作为实例，可提及叔丁氧羰基(N-tB0C)、9-芴基氧基羰基、增溶剂如琥珀酰基，或者不可代谢的氨基酸，即非天然的氨基酸如2-哌啶酸，或者氨基酸的D形式如D-苯丙氨酸。封端剂并非系统地存在于本发明的化合物中。术语“烷基基团”是指基于饱和烃基团的链，具体而言，例如,C1-C6烷基，即含有 1-6个碳原子的直链或支链的烷基。作为实例，可提及甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基。术语“芳基基团”是指衍生自芳香族核，具体而言，例如C6-Cltl芳香族核的官能团 (或取代基)，特别是苯基、苄基、I"萘基或者2-萘基。术语“羧基基团”是指，具体而言,由通过双键与第一氧原子键合并通过单键与第二氧原子键合的碳原子组成的官能团，其本身带负电荷或者与氢原子相连。取决于分子的 PKa和培养基的pH，羧基基团可以是电离的形式，即不含有与第二氧原子相连的H，由此带负电荷。术语“反应培养基”是指这样的培养基,其包含微牛物、细胞或者细胞器的代谢表达和/或生长所需的所有组分。反应培养基可用于流式细胞术、组织酶学、细胞培养等，或者用作检测和/或鉴定微生物的培养基。所述反应培养基可包含一种或者多种组分的组合，例如，氨基酸、胨、糖、核苷酸、 矿物质、维生素、抗生素、表面活性剂、缓冲剂、磷酸盐、铵盐、钠盐或者金属盐。所述培养基还可包含染料。作为染料的实例，可提及伊文思蓝、中性红、羊血、马血、遮光剂如氧化钛、硝基苯胺、孔雀石绿、亮绿等。
所述反应培养基可以是固体、半固体或者液体。术语“固体培养基”是指，例如凝胶化的培养基。琼脂是常规的凝胶剂，在微生物学中用于培养微生物，但是可使用明胶或者琼脂糖。可商购获得某些配制品，例如，Columbia琼脂、Trypcase-soy琼脂、MacConkey琼月旨、Sabouraud琼脂，或者，更概括地，Handbook of Microbiological Media (CRC Press)中所述的那些。所沭反应培养基可以是检测和/或鉴定培养基,即，显示培养基或者培养且显示的培养基。在第一种情况中，微生物的培养在接种之前进行；在第二种情况中，检测和/或鉴定培养基也构成培养基。术语“^li^M^”是指临床样品，其来源于生物学流体的样本或者食物样品，来源于任何类型的食物，或者来源于任何化妆品或药物制剂的化妆品或药物样品。因此，样品可以是液体或者固体，并且可非限制性地提及，血液、血浆、尿液或粪便的临床样品，鼻、咽喉、皮肤、伤口或者脑脊髓流体样本的临床样品，来自水、饮料如乳品或果汁、酸奶、肉类、蛋类、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼类等的食物样品；来源于动物饲料的食物样品，具体而言，例如来源于动物食物的样品。所述样品还可来源于临床环境样本、家畜样本，或者食物、化妆品或药物生产的样本。术语“环境样本”具体是指表面、液体、原料或者产品的样本。因此，术语 “样品”是指样本本身(拭子、粪便、食物等)和由所述样本而得的微生物菌落(例如在凝胶化的培养基上分离后)，或者包含由所述样本而得的微生物的培养基(例如用所述样本接种的富集培养液)。对于本发明，术语“微牛物”涵盖细菌、酵母、霉菌，更概括而言，有机体，其通常是单细胞的有机体，并且是裸眼不可见的，可在实验室中对其进行倍增或者操作。作为革兰氏阴性细菌，可提及以下属的细菌假单胞菌属(I^seudomonas)、 埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、 J ff ^ M (Enterobacter)、 3 胃 白 ft 胃 M (Klebsiella) > ^ W K ^ M (Serratia)、 变形菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜血菌属(Haemophilus)、摩根氏菌属(Morganella)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、不动杆菌属 (Acinetobacter)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、伯克霍尔德氏菌属(Burldiolderia)、柠檬酸杆菌属(CitrcAacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、气单胞菌属(Aeromonas)、莫拉氏菌属(Moraxella)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、 产碱菌属(Alcaligenes)、博德特氏菌属(Bordetella)、西地西菌属(Cedecea)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、寡养单胞菌属 (Stenotrophomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)禾口军团菌属(Legionella)。作为革兰氏阳性细菌，可提及以下属的细菌气球菌属(Aerococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、 芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、利斯特氏菌属(Listeria)、梭菌属(Clostridium)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、库克菌属(Kocuria)、乳球菌属 (Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、微球菌属(Micrococcus)、Falkamia、孪生球菌属(Gemella)、片球菌属(Pediococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)禾口棒杆菌属 (Corynebacterium)0
作为酵母，可提及以下属的酵母假丝酵母属(Candida)、隐球菌属 (Cryptococcus)、酵母属(Saccharomyces)禾口丝抱酵母属(Trichosporon)。优选地，所述微生物选自大肠杆菌(Escherichia coli)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes)、弗氏梓樣酸杆菌(Citrobacter freundii)、月市炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)禾口粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)。在此方面，本发明涉及式⑴的化合物及其盐作为检测肽酶活性和/或PH变化的酶底物的用途
权利要求
1.式⑴的化合物及其盐作为检测肽酶活性和/或PH变化的酶底物的用途
2.如权利要求1所述的式I的化合物的用途，其中Y1是肽，优选选自丙氨酸和甘氨酸。
3.如权利要求1或2所述的式I的化合物的用途，其中η= 1。
4.如权利要求1-3中任一项所述的式I的化合物的用途，其中m和W4独立地为H0
5.如权利要求1-4中任一项所述的式I的化合物的用途，其中U是CZ4，优选CH。
6.如权利要求1-5中任一项所述的式I的化合物的用途，其中V是N+R，优选N+CH3。
7.如权利要求1-6中任一项所述的式I的化合物的用途，其中W、Z3和\是H。
8.如权利要求1所述的式I的化合物的用途，其中所述化合物选自甘氨酰基-4-(4’ -酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鐺氯化物、L-丙氨酰基-4-(4’ -酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鐺TFA、β -丙氨酰基_4-(4’ -酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鐺氯化物和L-丙氨酰基_4-(4’ -酰氨基苯乙烯基)高氯酸吡啶(未被季铵化)。
9.检测微生物中的肽酶活性和/或PH变化的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤a)提供检测和/或鉴定培养基，其包含式(I)的化合物及其盐
10.区分细菌属于革兰氏阳性细菌或者革兰氏阴性细菌的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤a)提供检测和/或鉴定培养基，其包含式(I)的化合物及其盐
11.用于检测和/或鉴定微生物的培养基，其包含用于检测肽酶活性和/或PH变化的式(I)的化合物及其盐
全文摘要
本发明涉及式(I)的化合物及其盐用于检测肽酶活性和/或pH变化的用途其中Y1是肽、H或者烷基；W1、W2、W3和W4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)、或者上述基团的任何组合；n＝0、1或者2；U和V是N、N+R或者CZ4，R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或者烷基磺酰基；Z1、Z2、Z3和Z4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基，包括该羧基或者磺酰基的酯或者酰胺。
文档编号C12Q1/37GK102482704SQ201080033829
公开日2012年5月30日 申请日期2010年7月28日 优先权日2009年7月30日
发明者A·詹姆斯, J·佩里, S·奥伦加, S·斯坦福斯, V·L·萨尔瓦图拉 申请人:生物梅里埃公司