用于治疗血液肿瘤的抗il-3ra抗体的利记博彩app

专利名称：用于治疗血液肿瘤的抗il-3ra抗体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及针对人类IL-3RCI蛋白(另一个名称人类⑶123)的抗体。本发明还涉及用于髓细胞恶性肿瘤、特别是急性骨髓性白血病(AML)的治疗药剂和诊断药剂，其包含人类IL-3Ra抗体作为活性成分的发明。
背景技术：
关于恶性肿瘤在日本，恶性肿瘤(癌症)是死亡的第一主导原因，患者的数量每年增加，极其需要开发具有高的效能和安全性的药物和治疗方法。作为形成恶性肿瘤的原因，存在着由辐射、紫外线和各种致癌物质引起的DNA突变。关于恶性肿瘤的研究集中于通过分子生物学鉴定这些遗传变化。结果，认为致瘤性转化由大量突变的积累等诱导。通过细胞系模型等已经显示，某些决定性突变与致瘤性转化直接相关。关于作为本发明的目标疾病之一的白血病，已经鉴定并分类了许多染色体畸变。在许多病例中发现了染色体易位，并且在主要的染色体易位中已经鉴定了与染色体易位相关的一些基因。通过分析易位相关基因的功能发现了一种情况，即这些基因与白血病的发生相关。关于癌症干细胞另一方面，长时间以来，从细胞生物学观点提出了所谓的癌症干细胞假说，其主张与正常组织类似，恶性肿瘤同样起源于干细胞。干细胞被定义为具有自主复制能力和多能性的细胞，并粗略分成全能干细胞和组织干细胞。组织干细胞源自于特定组织和器官例如血液系统、肝脏、神经系统等，并以极低频率存在。其中，造血干细胞研究得最频繁。已报道， 通过将一个造血干细胞移植到造血系统被致死剂量的辐射所破坏的小鼠中，可以在长时间内重建造血系统(非专利文献1)。与正常干细胞不同，关于癌症干细胞的研究已经延迟了很长时间，因为不能发现它们的真正本质。然而，在1997年由Dick等首次在急性骨髓性白血病中鉴定到癌症干细胞。此后，已经在各种恶性肿瘤中报道了癌症干细胞的存在。概括来说，癌症干细胞以全部肿瘤的百分之几或更低的频率存在，并且与正常干细胞同样稀少。 据认为，形成肿瘤的其余细胞是增殖能力有限的肿瘤前体细胞或肿瘤细胞。通过这些报告，显示了即使是在肿瘤中也存在与正常组织类似的层次结构，并且位于其顶点(源点)的癌症干细胞具有强的肿瘤形成能力。癌症干细胞的特征和治疗问题总结许多报告，认为癌症干细胞维持了正常干细胞所具有的各种特征。相似性的实例包括细胞的稀少性、细胞存在于其中的微环境(生境)、多药物抗性基因的表达、细胞周期阻滞等。具体来说，它们表达一组多药物抗性基因并且与正常干细胞类似处于细胞周期间期的特征，可能变成治疗上的极大问题。多药物抗性基因BCRP是通过将各种抗肿瘤药剂排除到细胞外部而损害药物效能的泵，并且已经报道了一种利用这种活性收集干细胞的方法 (非专利文献幻。此外，它们在细胞周期间期在“冬眠”状态下存在(非专利文献幻，引起对靶向癌症细胞快速生长的许多抗肿瘤药剂以及辐照敏感性的降低(非专利文献4和5)。
根据上述特征，认为对治疗表现出抗性的癌症干细胞是肿瘤再生的原因。关于分子定向药物恶性肿瘤治疗的三个主要过程包括抗肿瘤药剂治疗、放射治疗和切除。血液肿瘤仅限于抗肿瘤药剂治疗和放射治疗，并且如上所述，癌症干细胞可能对这些治疗具有抗性。 另一个问题是由于这两种治疗影响整个身体，因此副作用大。预期分子定向药物将作为这个问题的解决手段。它能够通过只在表达靶分子的细胞中表现出其药效来降低副作用。在血液病领域中分子定向药物的典型药物实例包括伊马替尼和利妥昔单抗。伊马替尼靶向由在95%的CML患者中观察到的染色体畸变(费城染色体)所产生的被称为 Bcr-Abl的引起白血病的因子。这是一种低分子量药物，其通过抑制Bcr-Abl的功能诱导白血病细胞自杀。利妥昔单抗是治疗性抗体，其识别B细胞上的表面分子CD20，并对B细胞的恶性肿瘤(非霍奇金淋巴瘤等)具有抗肿瘤效应。另一方面，用于AML的分子定向药物很少，只有药剂吉妥珠单抗-奥唑米星(Mylotarg)，其中将抗生素calicheamicin与针对已知 AML细胞表面抗原⑶33的单克隆抗体相连。然而，目前的形势是Mylotarg的使用受限，这是因为据认为源自于calicheamicin的强烈毒性，以及治疗范围狭窄的问题。基于上述，可以说发现新的靶基因并开发用于它的治疗药剂将是重要的发明，其直接导致治疗的可能性并扩展了选择范围。作为分子定向药物的实施方案，已经研究并开发了各种物质，例如治疗性抗体和低分子量药物，以及肽类药物、生物蛋白制剂例如细胞因子、siRNA、适体(aptamer)等。当抗体被用作治疗药剂时，由于其特异性，它可用于治疗其中患病细胞表达特定抗原的病理状况。抗体与作为其抗原在细胞表面上表达的蛋白结合，并有效地作用于被结合细胞。抗体具有长的血液半衰期和对其抗原的高特异性的特征，并且也可显著用作抗肿瘤药剂。例如，当抗体靶向肿瘤特异性抗原时，可以预计给药的抗体积累在肿瘤中，从而通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)攻击肿瘤细胞。此外，通过将放射活性物质、细胞毒性物质等与抗体结合，有可能将药剂有效转移到肿瘤部分并因此允许在其上发挥作用。同时，它能够降低药剂到达其他非特异性组织的量，并且也可以预期副作用的降低。当肿瘤特异性抗原具有诱导细胞死亡的活性时通过给药具有激动活性的抗体，或者当肿瘤特异性抗原与细胞生长和存活有关时通过给药具有中和活性的抗体，预期可以抑制肿瘤生长或使肿瘤退行。由于上述特征，因此认为抗体适合用作抗肿瘤药剂。关于治疗性抗体在原始抗体制备中，使用小鼠作为待免疫动物。然而，由于大量原因，使用小鼠抗体作为药物受到限制。在人体中可以被识别为外来物质的小鼠抗体，可以诱导所谓的“人类抗小鼠抗体”、即“HAMA”应答(非专利文献6)。此外，小鼠抗体的Fc区不能通过人类补体或细胞毒性有效攻击患病细胞。作为用于避免这样的问题的方法之一，开发了嵌合抗体(专利文献1和2)。嵌合抗体含有源自于两种或更多物种的抗体部分(小鼠抗体可变区、人类抗体恒定区等)。这种嵌合抗体的优点在于它保持了小鼠抗体的特征，但是可以刺激人类补体或细胞介导的细胞毒性，因为它具有人类Fe。然而，已知这样的嵌合抗体仍然诱导“人类抗嵌合抗体”、即 “HACA”应答(非专利文献7)。此外，已经开发了重组抗体，其中只有一部分被取代的抗体是互补性决定区(“⑶R”)(专利文献3和4)。通过使用⑶R嫁接技术，制备了包含小鼠⑶R和人类可变区构架和人类恒定区的抗体，即所谓的“人源化抗体”(非专利文献8)。此外，通过使用产人类抗体的小鼠或通过使用人类抗体文库进行筛选，已经提供了可用于制备完全人类抗体的广泛应用的技术(非专利文献9和10)。关于IL-3Ra IL-3Ra是IL_3受体的α链，属于细胞因子受体家族，并对作为其配体的IL_3显示出弱亲和性。通过与其β链(⑶131，在后文中也称为IL-3Ri3)形成异源受体，IL-3受体具有强的结合性，并通过β链的细胞内区域将信号例如生长、分化等传递到细胞中。IL-5 受体α链和GM-CSF受体α链享有共同的β链。IL-3Ra是单次通过的跨膜I型膜蛋白，并且根据序列了解到在膜外区域中存在 IL-3结合位点和III型纤连蛋白位点。已知不存在能够在膜内区域中传递信号的结构。 尽管IL-3Ra的三维结构还没有被分析，但可以推测家族之间细胞因子受体的结构是相似的，因为在大多数情况下形成结构上重要的S-S键的半胱氨酸残基的位置得以保留。在同样的细胞因子受体中，IL-13受体α链、IL-4受体α链和GM-CSF受体α链的晶体结构已被分析。根据这些细胞因子受体家族的信息，可以推测IL-3Ra的膜外区域粗略分成3个结构域(A-B-C结构域)。已知识别人类IL-3R α的A结构域的抗体7G3阻断IL-3信号传导(非专利文献11)。此外，已经报道了缺少A结构域的IL-3R α分子的表达(非专利文献 12)，并且当然识别A结构域的抗体不能识别缺少A结构域的IL-3R a。此外，据认为C结构域是IL-3Ra分子的根，并具有在三维上抑制IL-3Rβ与IL_3Ra的结合的高度可能性。IL-3是已知作为IL_3Ra配体的唯一配体。IL_3是一种造血因子，其已知加速下列细胞的集落形成红细胞，巨核细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，肥大细胞和单核系统细胞。已知IL-3也刺激具有多能性的前体细胞，但是宁可将IL-3说成是加速具有自主复制能力的未成熟干细胞的分化，而是加速定向前体细胞的分化。已知IL-3R α通过与β链形成异源二聚体，从而通过丝氨酸/苏氨酸磷酸化途径将IL-3信号传导到细胞中，而与骨髓细胞的生长和分化有关。已知IL-3Ra表达在造血祖细胞中的粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)或髓系共同祖细胞(CMP)中，并通过IL-3信号传导诱导生长和分化成中性粒细胞和巨噬细胞系统。另一方面，已报道存在于CMP下游中的巨核细胞-红细胞类祖细胞(MEP)与也存在于下游中的GMP不同，不表达IL-3Ra。关于AML干细胞，Bonnet和Dick报道了 AML干细胞存在于CDiM阳性CD38阴性级分中(非专利参考文献13)。此外，通过与正常干细胞的相同级分(CD34阳性CD38阴性) 进行比较，Jordan等已经发现IL-3Rci在AML干细胞中高表达(非专利参考文献14)。在随后的多篇报告中也已报道了 IL-3Ra不仅作为AML干细胞而且作为白血病干细胞的标志物的高潜力(非专利参考文献15和16)。在癌症包括白血病的治疗中，重要的是尽可能多地只移除癌症细胞而不损伤正常细胞，并且据认为，IL-3R α在正常干细胞与白血病干细胞之间的这种表达差异，可用于靶向白血病干细胞的治疗。关于与IL-3Ra形成异源二聚体的IL-3R β，没有报告表明IL_3Ri3在白血病干细胞中高表达，并且在其中对白血病干细胞和正常干细胞中mRNA的表达进行比较的微阵列的情况下，事实上IL_3Ri3未被鉴定为在白血病干细胞中表达被增加的分子(非专利参考文献17)。
关于与IL_3Ra形成异源二聚体的IL-3R β，没有报告表明IL_3Ri3在白血病干细胞中高表达，并且在其中对白血病干细胞和正常干细胞中mRNA的表达进行比较的微阵列的情况下，事实上IL_3Ri3未被鉴定为在白血病干细胞中表达增加的分子(非专利参考文献⑶。长时间以来，已知道存在依赖于IL-3的白血病细胞，并且老的研究聚焦于占白血病细胞的大多数的母细胞。根据关于白血病干细胞的最新研究，据说白血病干细胞通过尽可能详尽地抑制其生长获得了抗肿瘤药剂抗性。此外，据认为IL-3反应性母细胞具有高增殖能力，因此推测这种细胞在使用抗肿瘤药剂的普通治疗中是有效的。作为靶向IL-3R受体的药剂的候选物，长时间以来IL-3本身被给药于造血不足的患者，但是它没有因此变成药物。其中将白喉毒素添加到IL-3上的融合蛋白的临床试验正在进行之中，其目的在于将白血病作为靶疾病。对于IL-3和白喉毒素-IL-3融合物来说，它们不适合作为药剂靶向其中IL-3Ra的表达特异性增加的细胞，因为IL-3不是强烈地结合单独的IL-3Ra蛋白，而是强烈结合IL-3Ra和β的异源蛋白，这是由IL-3的性质而决定的。另一方面，作为靶向IL-3Ra的药剂的候选物，已经报道了 IL-3Ra人类小鼠嵌合抗体7G3的一期结果(非专利文献19)。因为7G3嵌合抗体利用IL-3信号传导的阻断目的作为AML疗法的机制，它不是旨在除去IL-3Ra阳性细胞的药剂。此外，尽管已知一些其他的 IL-3Ra 抗体(9F5 (Becton Dickinson)、6H6 (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)禾口 AC145 (Miltenyi-Biotech))，但它们不具有除去高表达IL_3Ra的细胞的能力。引用文献名单专利文献专利文献1 :EP公开的专利申请120694专利文献2 =EP公开的专利申请No. 125023专利文献3 =GB专利申请No. GB2188638A专利文献4 美国专利No. 5，585，089非专利文献非专利文献1 =Osawa M 等，Science. 273 :242-5 (1996)非专利文献2 =Goodell MA 等，J Exp Med. 183 :1797-806(1996)非专利文献3 =Yamazaki S 等，EMB0J. 25 :3515-23 (2006)非专利文献4 Jshikawa F 等，Nat Biotechnol. 25 :1315-21. (2007)非专利文献5 =Bao S 等，Nature. 444 :756-60(2006)非专利文献6 =Schiff 等，Cane. Res.，45，879-885 (1985)非专利文献7 =Bruggemann 等，J. Exp. Med.，170 :2153-2157 (1989)非专利文献8 =Riechmann 等，Nature, 332 :323-327 (1988)非专利文献9 :Ishida I 等，Cloning Stem Cells. 4 :91-102 (2002)非专利文献10 :Wu 等，J Mol Biol 19:151—62(1999)非专利文献11 :Sun 等，Blood，87 :83(1996)非专利文献12 =Chen 等，J Biol Chem, 284 :5763 (2009)非专利文献13 =Bonnet 等，NatMed, 1997 ；3 :730非专利文献14 Jordan 等，Leukemia，2000 ； 14 1777
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非专利文献15 =Haematologica, 2001 ；86 :1261非专利文献16 LeukLymphoma，2006 ；47 :207非专利文献17 =Majeti 等，Proc Natl Acad Sci USA. 2009 ； 106 :3396非专利文献18 =Majeti 等，Proc Natl Acad Sci USA. 106 :3396(2009)非专利文献19 =Blood,2008112(11)摘要 2956发明概述技术问题本发明的目的是提供能够单独移除白血病干细胞并且也能几乎不表现出对正常细胞的副作用(显示出较少副作用)的治疗药剂。具体来说，本发明提供了针对人类 IL-3Ra链的抗体，其不抑制IL-3信号传导并与人类IL-3RCI链的B结构域结合，但不与C 结构域结合；包含抗体的组合物；以及包含抗体的治疗方法或检测方法。解决问题的方案本发明涉及下列(1)至(9)。(1) 一种针对人类IL-3RCI链的抗体，所述抗体不抑制IL_3信号传导并与人类 IL-3Ra链的B结构域结合，但是与C结构域结合。(2)上述(1)中描述的抗体，其进一步具有高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。(3)上述(1)或O)中描述的抗体，其中通过使用用IL-2培养的PBMC的 C0l0nj6/h⑶123 ADCC测定法，高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)在0. 01 μ g/ml的抗体浓度下显示出10%的特异的裂解率。(4)上述(1)至(3)任一项中描述的抗体，其包含选自下列(a)至(e)的重链⑶R 和轻链⑶R的氨基酸序列(a)重链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO 113至115的氨基酸序列，轻链的⑶R 1 至3分别为SEQ ID NO :131至133的氨基酸序列，(b)重链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO 116至118的氨基酸序列，轻链的⑶R 1 至3分别为SEQ ID NO :1；34至136的氨基酸序列，(c)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO :119至121的氨基酸序列，轻链的CDR 1 至3分别为SEQ ID NO :137至139的氨基酸序列，(d)重链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO :122至124的氨基酸序列，轻链的⑶R 1 至3分别为SEQ ID NO 140至142的氨基酸序列，以及(e)重链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO :125至127的氨基酸序列，轻链的⑶R 1 至3分别为SEQ ID NO 143至145的氨基酸序列。(5)上述⑴至(4)任一项中描述的抗体，其包含选自下列(a)至(f)的重链可变区和轻链可变区(a)包含SEQ ID NO 53的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S) 的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO :55的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V) 至1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；(b)包含SEQ ID NO 57的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S) 的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO :59的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V) 至1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO :61的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S) 的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO :63的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D) 至1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；(d)包含SEQ ID NO 65的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S) 的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO :67的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D) 至1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；(e)包含SEQ ID NO 69的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至138位丝氨酸(S) 的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO :71的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D) 至1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；以及(f)重链可变区和/或轻链可变区，其包含在上述(a)至(e)所显示的重链可变区和/或轻链可变区中缺失、取代、添加或插入1至3个氨基酸残基的氨基酸序列。(6) 一种用于预防或治疗血液肿瘤的组合物，在所述血液肿瘤中在对象的骨髓或外周血中发现了表达IL-3Rci的细胞，所述组合物包含(1)至( 任一项中描述的IL-3Rci 抗体作为活性成分。(7) 一种用于治疗血液肿瘤的方法，在所述血液肿瘤中在骨髓或外周血中发现了表达IL-3Rci的细胞，所述方法包含向对象给药包含(1)至( 任一项中描述的IL-3Rci 抗体作为活性成分的组合物。(8) 一种用于检测血液肿瘤的组合物，在所述血液肿瘤中在来自对象的生物样品的骨髓或外周血中发现了表达IL-3RCI的细胞，所述组合物包含(1)至( 任一项中描述的IL-3Ra抗体。(9) (1)至( 任一项中描述的组合物或方法，其中上面提到的血液肿瘤是急性骨髓性白血病(AML)。本发明的有益效果本发明能够提供针对人类IL-3RCI链的抗体，其不抑制IL_3信号传导并与人类 IL-3Ra链的B结构域结合，但不结合C结构域；包含所述抗体的组合物以及使用所述抗体的治疗方法或检测方法。附图简述[

图1]和[图2]图1和2是使用标记的抗IL-3Rci抗体对表达IL_3Ra/ GM-CSFRa嵌合蛋白的细胞进行的流式细胞术分析结果。[图3]图3是使用标记的抗IL-3Rα抗体对表达IL-3R a /GM-CSFR α嵌合蛋白的细胞进行的流式细胞术分析的结果。[图4]图4是图表，其中在人类IL-3Rci分子的A和B结构域的核苷酸和氨基酸序列中，排列在分子外部的区域1至7被GM-CSFRa序列取代的区域部分用虚线显示。[图5]图5是用于检测IL-3信号传导的阻断活性的细胞生长试验的结果。纵坐标表示细胞生长抑制率(％ )，横坐标表示各种IL-3Rci抗体名称。[图6]图6是用于检测IL-3信号传导的阻断活性的集落测定试验。GM、E和GEMM 分别显示了使用粒细胞/巨噬细胞系统、红细胞类系统集落和混合集落的结果。[图7]图7是在带肿瘤模型中检测各种人类抗体的抗肿瘤效果的结果。纵坐标表示M0LM13细胞的数量，横坐标表示各种IL-3Ra抗体名称。
[图8]和[图9]图8和9是使用抗IL-3Rα抗体对表达IL-3R α的细胞系进行的ADCC试验的结果。在图8中使用了未用IL-2培养的PBMC，在图9中使用了用IL-2培养的 PBMC。[图10]图10是通过抗IL-3Rα抗体和PE-标记的抗人类IgG第二抗体检测的表达食蟹猴(Macaca fascicularis) IL-3R α的流式细胞术分析的结果。上排显示了表达食蟹猴IL-3Rci的细胞，下排显示了表达人类IL-3Rci的细胞。实施本发明的方式(特别理想的实施方案的详细描述)在本说明书中使用的分段标题仅仅是出于组织的目的，不应被解释为对所描述的主题内容的限制。在本申请中引用的所有参考文献以任选目的在本说明书中明确引为参考。(概要)本发明涉及针对人类IL-3RCI链的抗体，其不抑制IL_3信号传导并与人类 IL-3Ra链(在后文中称为IL-3Rci)的B结构域结合，但不与C结构域结合。IL-3受体(在后文中称为IL-3R)、特别是IL-3Rci表达在白血病干细胞的细胞表面上。一般来说，IL-3受体β链(在后文中称为IL-3Ri3)将IL-3信号传导传递到细胞中，并因此诱导生长和分化。因此，存在着IL-3信号传导的抑制引起副作用、例如正常干细胞的正常造血功能的抑制的可能性。因此，作为靶向白血病干细胞的新治疗方法，优选情况下该方法靶向 IL-3Ra，并且也不抑制IL-3信号传导。(IL-3Ra )IL-3R α基因是I型跨膜蛋白，其属于细胞因子受体家族。在正常细胞中，IL-3R a 分子表达在一部分造血前体细胞、嗜碱性粒细胞、一部分树突状细胞等上。在肿瘤的情况下，已知它在造血系统癌症和白血病中表达。作为表达IL-3Rci的肿瘤的实例，已知 IL-3Ra在急变期AML和CML的母细胞上，以及在AML、CML、MDS、ALL和SM中被认为是白血病干细胞的分化标志物阴性⑶34阳性⑶38阴性级分的情形中表达。在血液中，IL-3Ra的已知配体IL-3表达在活化的T细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞和一部分巨核细胞上。此外， IL-3Ra也被称为CD 123。IL_3Ra包括哺乳动物(例如灵长类和人类)类型的IL_3Ra。 IL-3Ra序列包括多态性变体。全长人类IL-3Rci的具体实例包括下列氨基酸序列。MVLLWLTLLLIALPCLLQTKEDPNPPITNLRMKAKAQQLTWDLNRNVTDIECVKDADYSMPAVNNSYCQFGAISLCEVTNYTVRVANPPFSTWILFPENSGKPWAGAENLTCfflHDVDFLSCSWAVGPGAPADVQYDLYLNVANRRQQYECLHYKTDAQGTRIGCRFDDISRLSSGSQSSHILVRGRSAAFGIPCTDKFVVFSQIEILTPP匪TAKCNKTHSFMHWKMRSHFNRKFRYELQIQKRMQPVITEQVRDRTSFQLLNPGTYTVQIRARERVYEFLSAWSTPQRFECDQEEGANTRAWRTSLLIALGTLLALVCVFVICRRYLVMQRLFPRIPHMKDPIGDSFQNDKLVVWEAGKAGLEECLVTEVQVVQKT (SEQ ID NO 1)人类IL-3Rci的细胞外区域氨基酸序列的具体实例包括下列氨基酸序列。
MVLLWLTLLLIALPCLLQTKEDPNPPITNLRMKAKAQQLTWDLNRNVTDIECVKDADYSMPAVNNSYCQFGAISLCEVTNYTVRVANPPFSTWILFPENSGKPWAGAENLTCffIHDVDFLS CSffAVGPGAPADVQYDLYLNVANRRQQYECLHYKTDAQGTRIGCRFDDISRLSSGSQSSHILVRGRSAAFGIPCTDKFVVF^QIEILTPP匪TAKCNKTHSFMHWKMRSHFNRKFRYELQIQKRMQPVITEQVRDRTSFQLLNPGTYTVQIRARERVYEFLSAffSTPQRFECDQEEGANTRAffRTSL(SEQ ID NO :2)此外，IL_3Ra的细胞外区域分成A至C三个结构域。A结构域包含SEQ ID NO 2的氨基酸中从18位的谷氨酰胺(Q)到100位的丝氨酸⑶的区域，B结构域包含SEQ ID NO 2的氨基酸中从101位的甘氨酸(G)至203位的丝氨酸⑶的区域，C结构域是SEQ ID NO :2的氨基酸中从204位的谷氨酰胺(Q)到308 位的亮氨酸(L)的区域。此外，在A结构域和B结构域中，下列7个区域排列在分子外部。区域1是SEQ ID NO :2的氨基酸中从55位的天冬氨酸⑶到61位的脯氨酸(P)， 区域2是SEQ ID NO 2的氨基酸中从63位的缬氨酸(V)到70位的苯丙氨酸(F)，区域3是 SEQ ID NO 2的氨基酸中从91位的丝氨酸⑶到98位的谷氨酸(E)，区域4是SEQ ID NO 2的氨基酸中从97位的脯氨酸⑵到104位的色氨酸(W)，区域5是SEQ ID NO 2的氨基酸中从122位的半胱氨酸(C)到1 位的脯氨酸⑵，区域6是SEQ ID NO 2的氨基酸中从182位的异亮氨酸(I)到188位的丝氨酸⑶，区域7是SEQ ID NO 2的氨基酸中从192 位的甘氨酸(G)到198位的赖氨酸⑷。因此，本发明抗体的实例，包括与SEQ ID NO :2的氨基酸中作为IL-3R α的细胞外区域的101至203位的氨基酸序列结合，但不与204至308位的氨基酸序列结合的抗体，以及进一步与SEQ ID NO 2的氨基酸序列中182至188位和192至198位的氨基酸序列结合的抗体。本发明的抗体与IL-3Ra的细胞外区域的上述特定区域结合，并且不抑制IL_3信号传导。当在本发明中使用时，术语“不抑制IL-3信号传导，，是指它不由IL-3通过IL-3R 抑制细胞内信号，并且它包括其中IL-3与IL-3R的结合不被抑制和IL-3Rci链与β链的结合不被抑制的情况。具体来说，它意味着按照实施例8中的分析，当抗体浓度被设定为 10 μ g/ml时，如图5所示的细胞生长抑制率为40%以上，优选为60%以上，更优选为80% 以上。根据本说明书，术语“IL-3信号传导的阻断”和“IL-3信号传导的抑制”以相同意义使用并且不可区分，并且IL-3信号传导的阻断活性是指抑制IL-3信号传导的能力。此外，除了上面提到的性质之外，本发明的抗体具有高的抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)。具有ADCC活性的IL-3Rci抗体是指与表达IL-3R α的细胞结合，通过具有细胞毒性的效应细胞例如NK细胞等杀死表达IL_3Ra的细胞的抗体。高ADCC活性是指使用用IL-2培养的PBMC通过Colonj6/hCD123ADCC测定法测量时，在0. 01 μ g/ml或以下的抗体浓度下特异的裂解率为10%以上。特异的裂解率是指通过测量靶细胞被抗体的裂解率而获得的值，具体来说它可以按照下面的实施例11来计算。表达IL-3Rci的细胞的实例包括血液癌细胞(急性骨髓性白血病(AML)细胞、慢性骨髓性白血病(CML)细胞、骨髓增生异常综合征(MDQ细胞、急性淋巴性白血病(ALL)细胞、慢性淋巴性白血病(CLL)细胞、多发性骨髓瘤(多发性骨髓瘤MM)细胞、系统性肥大细胞瘤(SM)细胞等)、调节性T细胞(例如CD4阳性CD25阳性细胞)、抗原呈递细胞(例如树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和与其类似的细胞(肝星状细胞、破骨细胞、小神经胶质细胞、主要表皮吞噬细胞、尘细胞(肺泡巨噬细胞)等))、嗜碱性粒细胞等。此外，AML细胞、CML细胞、ALL细胞、CLL细胞、MDS细胞、SM细胞、MM细胞、各种淋巴瘤细胞包括它们的癌症干细胞。癌症干细胞是构成肿瘤的细胞组之一。例如，在急性骨髓性白血病(AML)中，它用谱系(_)CD34(+)CD38(_)髓系细胞表示。因此，由于本发明的抗体具有高ADCC活性，它诱导表达IL-3Rci的细胞的减少或消除。此外，本发明的IL-3Rci抗体包括具有选自下列(a)至(e)的重链⑶R和轻链⑶R 的IL-3Ra抗体(a)重链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO :113至115所显示的氨基酸序列，轻链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO :131至133所显示的氨基酸序列，(b)重链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO :116至118所显示的氨基酸序列，轻链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO :134至136所显示的氨基酸序列，(c)重链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO :119至121所显示的氨基酸序列，轻链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO :137至139所显示的氨基酸序列，(d)重链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO :122至IM所显示的氨基酸序列，轻链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO :140至142所显示的氨基酸序列，以及(e)重链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO :125至127所显示的氨基酸序列，轻链的⑶R 1至3分别为SEQ ID NO :143至145所显示的氨基酸序列。此外，本发明的抗体包括含有选自下列(a)至(f)的重链可变区和轻链可变区的 IL-3Ra抗体(括号中显示的是下面实施例中描述的每个可变区所源自的抗体的名称)(a)包含SEQ ID NO 53的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S) 的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO :55的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V) 至1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称01d4)(b)包含SEQ ID NO 57的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S) 的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 59的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V) 至1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称01d5)(c)包含SEQ ID NO 61的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S) 的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO :63的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D) 至1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称01dl7)(d)包含SEQ ID NO 65的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S) 的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO :67的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D) 至1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称01dl9)(e)包含SEQ ID NO 69的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至138位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO :71的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D) 至1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称Newl(^)；以及(f)重链可变区和/或轻链可变区，其包含在上述(a)至(e)所显示的重链可变区和/或轻链可变区中缺失、取代、添加或插入了 1至3个氨基酸残基的氨基酸序列。(抗体)抗体以最广义的意义使用，并包括单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们显示出所需生物活性即可。抗体含有成熟的重链或轻链可变区序列。此外，抗体还包括修饰形式和变体形式， 例如抗体的恒定区、成熟重链或轻链可变区序列的互补性决定区(CDR)或构架(FR)区内部或外部的取代等。在特定实施方案中，取代包括保守氨基酸取代。此外，抗体还包括成熟重链或轻链可变区序列的子序列。在特定实施方案中，子序列选自 Fab、Fab，、F (ab，) 2、Fv、FcU单链 Fv (scFv)、二硫键 Fv (sdFv)和 VL 或 VH。此外，抗体还包括异源结构域。在特定实施方案中，异源结构域包括标签、可检测标记物或细胞毒性剂。抗体的实例包括单克隆抗体和多克隆抗体及其任何同种型或亚类。在特定实施方案中，上面提到的抗体是IgG的同种型(例如IgGU IgG2、IgG3或IgG4)、IgA、IgM、IgE或 IgD。“单克隆”抗体是指抗体基于、得自单一克隆包括真核细胞克隆、原核细胞克隆或噬菌体克隆，或源自于单一克隆包括真核细胞克隆、原核细胞克隆或噬菌体克隆，基于单一克隆包括真核细胞克隆、原核细胞克隆或噬菌体克隆，因此，“单克隆”抗体是结构确定的物质， 而不是用于产生它的方法。IL-3Ra抗体、抗IL-3Ra和抗IL_3Ra抗体是指特异性结合IL-3Rα的抗体。特异性结合是指它对于IL-3Ra中存在的表位具有选择性。特异性结合可以使用本技术领域中已知的测定方法(例如免疫沉淀、ELISA、流式细胞术、Western印迹)与非特异性结合区分开。当IL-3Rci抗体所特异性结合的全部或部分抗原表位存在于不同蛋白中时，存在着该抗体能够与不同蛋白结合的可能性。因此，取决于IL-3Ra表位的序列或结构同源性， 存在着IL-3Ra抗体特异性结合与IL-3Ra表位具有高的序列或结构同源性的其他蛋白的可能性。因此，当不同蛋白中存在具有足够序列或结构同源性的表位时，存在着IL-3Ra抗体与不同蛋白结合的可能性。IL-3Ra抗体包括分离和纯化抗体。本发明的抗体包括从人类分离或纯化的 IL-3Ra 抗体。术语“(被)分离的”当用作组合物的修饰语时，是指组合物通过人工制备，或一般通过一个或多个操作步骤或过程与天然存在的体内环境中的一种或多种其他组分分离开。 一般来说，通过这种方式分离的组合物基本上不含在自然状态下一般与其相伴的一种或多种物质，例如一种或多种蛋白质、核酸、脂类、糖类和细胞膜。因此，分离的组合物与组合物天然存在于其中的生物体细胞中的其他生物组分、或组合物在其中生产(例如通过合成或细胞培养)的人造介质分离开。例如，分离的IL-3Ra抗体可以从产生抗体的动物(例如非转基因哺乳动物或转基因动物(鼠类(小鼠)或有蹄类动物(牛))获得，并与其他多肽和核酸分离开。因此，含有从这样的动物获得的抗体的血清被认为是分离的。术语“(被)
13分离的”不排除可选的物理形式，例如，分离的抗体可以包括抗体子序列和嵌合体、多聚体或衍生化形式。术语“(被)纯化的”当用作组合物的修饰语时，是指组合物不含在自然状态下典型与其相伴的大部分或基本上所有的物质。一般来说，纯化的抗体从普遍存在于抗体环境中的组分获得。因此，从产抗体杂交瘤的细胞培养混合物分离的抗体上清液被认为是纯化的。因此，“(被)纯化的”不要求绝对纯度，并且取决于上下文。此外，“(被)纯化的”组合物可以与一种或多种其他分子组合。因此，术语“(被)纯化的”不排除组合物的组合。 纯度可以通过任选的适合方法来确定，例如UV光谱测定法、色谱法(例如HPLC、气相)、凝胶电泳(例如银染色或考马斯亮蓝染色)、序列分析(肽和核酸)等。“(被)纯化的”蛋白和核酸包括通过标准纯化方法获得的蛋白和核酸。通过在宿主细胞中重组表达和化学合成获得的蛋白和核酸也包括在该术语中。此外，“(被)纯化的”也可以是指组合物中污染物的水平低于用于人类或非人类动物给药的管理机构例如食品和药品管理局(FDA)所能接受的水平。IL-3Ra抗体包括在体内或体外(例如在对象中)与IL-3Ra结合并调节IL_3Ra 的功能或活性的抗体。在本说明书中，“调节”及其语法变化形式当与IL-3Ra的活性或功能关联使用时，是指IL-3Ra的活性或功能受到可检测的影响、修改或改变，但是不包括IL-3 信号传导的抑制。因此，调节IL-3Ra的活性或功能的IL-3Ra抗体是提供影响、修改或改变，使得可以检测到一种或多种IL-3Ra活性或功能而不抑制IL-3信号传导的抗体，并且这样的IL_3Ra活性或功能可以包括例如IL_3Ra与IL_3Ra配体(例如IL-3)的结合， IL-3Ra介导的信号传递，或IL-3Rci介导的细胞应答或可以被IL-3Rα调节的细胞应答， 或本说明书中描述的或公知的或可以了解到的其他IL-3Ra活性或功能。可以被调节的各种非限制性的IL-3Ra活性和功能的实例包括IL_3Ra介导的信号转导或IL-3Rci介导的细胞应答，可以通过IL-3Rci调节的细胞应答，细胞增殖或细胞扩增(例如AML细胞、CML细胞、ALL细胞、CLL细胞、MDS细胞、MM细胞、SM细胞、各种淋巴瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、髓系祖细胞和淋巴祖细胞)，细胞存活或凋亡(例如AML细胞、CML细胞、ALL细胞、 CLL细胞、MDS细胞、匪细胞、SM细胞、各种淋巴瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、髓系祖细胞和淋巴祖细胞)，细胞因子(例如Th、Th2和非Thl/Th2细胞因子)和干扰素表达或生产，抗凋亡蛋白或前凋亡蛋白的表达或生产，障碍、疾病、生理状况、病理状况和症状的治疗、抑制或改善。可以被调节的具体细胞因子不受限制，其实例包括IL-I、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-14、 IL-16、IL-17、IL-23、IL-26、TNF-α和γ -干扰素(体外或体内)。具体的抗凋亡蛋白和前凋亡蛋白不受限制，其实例包括Bcl-xL、Bcl-2、Bad、Bim和Mcl-I。因此，本说明书中描述的抗IL-3RCI抗体包括调节下列过程的抗体IL_3Ra介导的信号转导或IL-3Rci介导的细胞应答，可以通过IL-3Rci调节的细胞应答，细胞增殖或细胞生长(例如AML细胞、CML细胞、ALL细胞、CLL细胞、MDS细胞、MM细胞、SM细胞、各种淋巴瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、髓系祖细胞和淋巴祖细胞)，细胞存活或凋亡(例如AML细胞、CML细胞、ALL细胞、CLL细胞、MDS细胞、匪细胞、SM细胞、各种淋巴瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、髓系祖细胞和淋巴祖细胞)， 细胞因子(例如Th、Th2和非Thl/Th2细胞因子)和干扰素表达或生产，抗凋亡蛋白或前凋亡蛋白的表达或生产，障碍、疾病、生理状况、病理状况和症状的治疗、抑制或改善。在具体实施方案中，本发明的抗IL-3R α抗体能够调节AML细胞的扩增或存活，其他血液癌细胞 (例如CML细胞、ALL细胞、MDS细胞、匪细胞、SM细胞或各种淋巴瘤细胞)的数量，非癌血液细胞例如单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、髓系祖细胞和淋巴祖细胞的生长或存活，以及减少、消除或贫化AML细胞、CML 细胞、ALL细胞、CLL细胞、MDS细胞、MM细胞、SM细胞或各种淋巴瘤细胞。IL-3Ra抗体包括修饰的形式，例如也被称为变体的取代产物(例如氨基酸取代产物)、添加产物、缺失产物(例如子序列或片段)等。这样的修饰的抗体形式和变体保留了本发明显示的IL-3RCI抗体的至少部分功能或活性，例如与IL-3RCI的结合或IL_3Ra 活性或功能(例如IL-3Ra信号传递)的调节。因此，修饰的IL-3Ra抗体可以保留调节例如至少一部分IL-3Rci结合或一种或多种IL-3Rci功能或活性(例如信号传递、细胞应答等)的能力。根据本说明书，术语“改变”(“修饰”)及其语法变化形式是指组合物衍生自参比组合物。修饰的蛋白、核酸和其他组合物可以具有与参比的未修饰蛋白、核酸或其他组合物相比更高或更低的活性，或者可以具有与参比的未修饰蛋白、核酸或其他组合物不同的功能。这样的含有氨基酸取代的抗体可以由核酸编码。因此，本发明还提供了编码含有氨基酸取代的抗体的核苷酸序列。术语“同一性”或“同一的”是指两个或多个参比物质相同。因此，当两个蛋白序列(例如IL-3RCI抗体)同一时，它们至少在参比区域或部分中具有相同的氨基酸序列。 术语“同一区”是指两个或多个参比物质的同一的区域。因此，当两个蛋白序列在一个或多个序列区域中同一时，它们在所述区域中具有同一性。“显著同一性”是指分子在结构或功能上保守，使得分子具有或预计具有一种或多种参比分子功能或活性的至少部分功能或活性，或具有与其享有同一性的参比分子的相关/相应区域或部分。因此，具有显著同一性的多肽(例如IL-3Ra抗体)具有或预计具有参比多肽(例如IL-3Ra抗体)的至少部分活性或功能。例如，在特定实施方案中，具有一个或多个修饰(例如1至3个氨基酸残基的缺失、取代、添加或插入)并保留了未修饰IL-3Ra抗体的至少部分活性或功能的IL-3Ra抗体，被认为与参比IL-3Ra抗体具有显著同一性。由于结构相关蛋白和功能相关蛋白之间的变异，需要一定量的序列同一性才能保留蛋白、区域上的功能或活性以及区域的功能或活性。在蛋白的情况下，通过仅存在30%的氨基酸序列同一性就可能保留活性或功能，但一般来说，存在着与参比序列的50%、60%、 75%、85%、90%、95%、96%、97%或98%的较高同一性。两个序列之间的同一性程度可以使用本技术领域中公知的计算机程序或数学算法来确认。在这样的计算序列同一性(同源性)比例的算法中，一般来说考虑比较区域内的序列间隙和错配。例如，BLAST (例如BLAST 2.0)检索算法(例如参见 Altschul 等，J. Mol. Biol.，215 :403 (1990)，可通过 NCBI 公开使用)具有下列说明性的检索参数错配-2;间隙开始5;间隙延长2。在多肽序列比较中， BLASTP 算法典型地与计分矩阵例如 PAM100、PAM 250、BLOSUM 62、BL0SUM50. FASTA (例如FASTA 2和FASTA 3)等组合使用，并且也可以使用SSEARCH序列比较程序来确定同一性程 it (Pearson ^,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 :2444(1988) ；Pearson,Methods Mol. Bio.， 132 :185(2000)；和 Smith 等，J. Mol. Biol.，147 :195(1981))。也可以使用基于 Delaunary 类型的拓扑作图来开发用于确定蛋白结构相似性的程序(Bostick等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，304 :320 (2003))。“保守取代”是将一个氨基酸用生物、化学或结构上类似的残基取代。生物相似性是指生物活性例如IL-3RCI结合活性不被取代所破坏。结构相似性是指氨基酸具有长度相似的侧链(例如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸)或具有相似尺寸。化学相似性是指残基具有相同电荷或是亲水或疏水的。具体实例包括将一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸用另一个残基取代，或将一个极性残基用另一个残基取代，例如用赖氨酸取代精氨酸、用天冬氨酸取代谷氨酸或用天冬酰胺取代谷氨酰胺，以及用苏氨酸取代丝氨酸。此外，修饰的抗体的实例包括肽模拟物，其具有一个或多个用L-氨基酸(或其混合物)取代的D-氨基酸、结构和功能类似物例如合成或非天然氨基酸或氨基酸类似物及其衍生形式。修饰的实例包括环状结构，例如分子的氨基和羧基末端之间的端对端酰胺键或分子内或分子间二硫键或分子内或分子间二硫键。氨基酸修饰的其他非6限制性具体实例包括IL-3RCI的部分序列(子序列)和片段。IL-3RCI的示例性子序列和片段包括与本发明的示例性IL-3Rα抗体结合的IL_3Ra 序列的部分。此外，IL-3RCI的示例性子序列和片段包括免疫原性区域，例如与本发明的示例性IL-3Ra抗体结合的IL_3Ra的部分。根据本发明，提供了编码IL-3Ra抗体片段子序列的核酸，所述片段保留了 IL-3Ra抗体和未修饰或参比IL-3Ra抗体的至少部分功能或活性。在本说明书中，术语 “子序列”或“片段”是指全长分子的一部分。编码IL-3Ra抗体的IL-3Ra抗体子序列具有比全长IL-3Ra抗体少至少一个的氨基酸(例如缺失了一个或多个内部氨基酸或从氨基端或羧基端缺失一个或多个末端氨基酸)。IL_3Ra抗体的子序列具有比全长IL-3Ra抗体少至少一个的氨基酸。核酸子序列具有比全长对比核酸序列少至少一个的核苷酸。因此， 子序列可以是全长天然IL-3Ra内的任选长度。IL-3Ra抗体子序列和片段可以具有与全长抗体相同的结合亲和性、与全长抗体相同的结合特异性或与全长抗体相同的一种或多种活性或功能，例如IL-3Ra拮抗或激动抗体的功能或活性。在指称抗体时，术语“功能子序列”或“功能片段”是指保留了与全长参比抗体相同的一种或多种功能或活性，例如IL-3Ra抗体的至少一部分功能或活性的抗体部分。例如，与IL-3Ra或IL-3Ra片段结合的抗体子序列被认为是功能子序列。抗体子序列和片段可以组合。例如，VL或VH子序列可以通过连接序列相连，并可以由此形成VL-VH嵌合体。单链Fv(SCFV)子序列的组合可以通过连接序列相连，并可以由此形成scFv-scFv-嵌合体。IL-3Ra抗体子序列和片段包括单独或与所有或一部分其他 IL-3Ra抗体子序列组合的单链抗体或可变区。抗体子序列和片段可以通过抗体的蛋白水解作用、例如用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体来制备。通过用胃蛋白酶进行酶切割获得的抗体子序列和片段，提供用 F(ab' )2表示的5S片段。该片段可以用巯基还原剂进一步切割，形成3. 5S的Fab’单价片段。或者，使用胃蛋白酶进行的酶切割直接产生两个单价Fab’片段和Fc片段(参见例如美国专利 No. 4，036, 945 和美国专利 No. 4，331，647 ；以及 Edelman 等，Methods Enzymol, 1 422(1967))。也可以使用其他切割抗体的方法，例如分离重链以形成单价轻链-重链片段， 进一步切割片段，或其他酶或化学方法。蛋白和抗体及其子序列和片段可以使用遗传工程来制备。技术包括将编码蛋白或抗体的全部或部分基因在宿主细胞例如COS细胞和大肠杆菌中表达。重组宿主细胞合成全长或子序列例如 ScFv (例如 Whitlow 等，In :Methods :A Companion to Methods in Enzymology 2:97(1991) ；Bird 等，Science 242:423(1988)；和美国专利 No. 4，946，778)。 单链Fv和抗体可以按照下述文献中描述的步骤来制备美国专利No. 4，946，778和美国专利 No. 5，258，498 ；Huston 等，Methods Enzymol 203 :46(1991) ；Shu 等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90 :7995(1993)；和 Skerra 等，Science 240:1038(1988)。修饰形式包括衍生化序列，例如在氨基酸中游离氨基形成胺的盐酸盐、对甲苯磺酸基团和羰基苯醌基团；游离羧基形成盐或甲基和乙基酯；游离羟基形成0-酰基或0-烷基衍生物，以及天然存在的氨基酸衍生物例如4-羟基脯氨酸(脯氨酸的衍生物)、5_羟基赖氨酸(赖氨酸的衍生物)、高丝氨酸(丝氨酸的衍生物)、鸟氨酸(赖氨酸的衍生物)等。 修饰可以使用本技术领域通常已知的方法来进行(例如基于PCR的位点特异性缺失或插入突变、化学修饰和诱变、交联等)。添加产物和插入产物包括在蛋白(抗体)、核酸和其他组合物的修饰形式中。例如，添加可以是与任何类型的蛋白(抗体)、核酸或其他组合物的分子的共价或非共价键合。一般来说，添加和插入产生不同功能或活性。融合(嵌合)多肽或核酸序列包括在添加和插入产物中，它们是具有在参比的天然(野生型)序列中一般不存在的一个或多个分子共价连接于上述序列而形成的序列。具体实例是另一个蛋白(例如抗体)的序列，用于产生多功能蛋白(例如多特异性抗体)。本发明的抗体还包括嵌合或融合产物，其中一个或多个附加结构域共价连接到其上，以赋予不同或互补的功能或活性。抗体的实例包括在自然界中天然不存在并且其中两个或多个氨基酸序列相互键合的嵌合和融合产物。根据本发明，提供了含有异源结构域和编码IL-3RCI抗体的核酸的IL_3Ra抗体。 异源结构域可以是氨基酸添加产物或插入产物，但是不限于氨基酸残基。因此，异源结构域可以由各种类型的小的或大的功能部分中的任一种构成。这样的部分包括核酸、肽、糖类、 脂类或小的有机化合物例如药物、金属(金、银)等。异源结构域的具体的非限制性实例包括标签、可检测标记物和细胞毒性药剂。标签和可检测标记物的具体实例包括T7-、His-、myC-、HA-和FLAG-标签，酶(辣根过氧化物酶、脲酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、氯霉素转移酶)，酶的底物，配体(例如生物素)，受体(亲和素)，放射性核素(例如C14、S35、Ρ32、Ρ33、Η3、1125和1131)，电子密度试剂，能量转移分子，顺磁性标记物，荧光团(荧光素、罗丹明、藻红蛋白)，发色团，化学发光剂(咪唑、萤光素酶)和生物发光剂。细胞毒性药剂的具体实例包括白喉毒素(白喉，毒素)、霍乱毒素和赖氨酸。连接序列可以插入到蛋白(例如抗体)、核酸或其他组合物与添加产物或插入产物(例如异源结构域)之间，使得两种物质维持至少一部分不同功能或活性。连接序列可以具有一种或多种性质，其能够加速任一结构域或能够执行与任一结构域的相互反应，并且这样的特征包括不能形成柔性结构和有序二级结构，或疏水性质或带电性质。在柔性蛋白区域中通常发现的氨基酸的实例包括甘氨酸、天冬酰胺和丝氨酸。其他接近中性的氨基酸例如苏氨酸和丙氨酸也可用于连接序列中。连接序列的长度可以变化(例如参见美国专利No. 6，087，329)。连接物还可以包括化学交联剂和结合试剂(偶联试剂)例如磺基_琥珀酰亚胺基衍生物(磺基-SMCC、磺基-SMPB)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSQ、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)和二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)。添加的其他实例包括下列任一种糖基化，脂肪酸，脂类，乙酰化，磷酸化，酰胺化， 甲酰化，泛素化和通过保护或阻断基团衍生化，以及大量化学修饰。本技术领域的专业人员可以容易地理解其他的替代方案和可能性，并且它们被认为属于本发明的范围内。这样的修饰序列可以使用介导细胞表达或体外翻译的重组DNA技术来制备。多肽和核酸序列也可以通过本技术领域公知的方法来制备，例如使用自动化肽合成仪的化学合成(参见例如 Applied Biosystems, Foster City CA)。修饰的和变体抗体例如取代产物、子序列添加产物等，可以维持IL-3Rci抗体的可检测活性。在实施方案中，修饰抗体具有与IL-3Rα分子结合的活性，并通过免疫系统、 主要以效应细胞为中心，诱导IL-3Rci表达细胞的减少或消除。修饰抗体涉及IL-3Rci表达细胞的功能控制，并诱导细胞的存活、生长、静息、细胞死亡等。细胞死亡包括凋亡、坏死、 自噬等。(IL-3Ra的筛选方法)根据本发明，还提供了筛选、检测和鉴定IL-3RCI的无细胞方法和基于细胞的方法(例如体内或体外方法)(例如在溶液中或通过固相)。这些方法可以在体外在溶液中使用生物材料或样品来进行，以及使用例如动物来源细胞(例如淋巴细胞)的样品在体内进行。在实施方案中，方法包含将生物材料或样品与结合IL-3RCI的抗体在允许抗体与 IL-3RQ结合的条件下进行接触的步骤，以及测定与IL-3Rα结合的抗体的步骤。IL_3Ra 的存在通过抗体与IL-3Rci的结合来检测。在实施方案中，IL-3Rci存在于细胞或组织中。 在另一个实施方案中，上面提到的生物材料或样品从哺乳动物被分析物获得。当用于组合物例如蛋白(例如IL-3RCI抗体)、材料、样品或治疗时，术语“接触”是指组合物(例如IL-3Ra抗体)与其他所指称物质之间的直接或间接相互作用。直接相互作用的具体实例包括结合。间接相互作用的具体实例包括其中组合物作用于中间分子，然后将该中间分子作用于所指称物质的情况。因此，例如将细胞(例如淋巴细胞)与IL-3Rci 抗体接触包括允许抗体与细胞结合(例如通过与IL-3Ra结合)或允许抗体作用于中间物质，然后将该中间物质作用于细胞。术语“测定”和“测量”及其语法变化形式在本说明书中同义使用，并且是指定性测量和定量测量中的任一种或定性测量和定量测量两者。当这些术语用于指称结合时，它们包括评估结合的相对量、亲和性或特异性的任何手段，包括在说明书中描述的和本技术领域中公知的各种方法。例如，IL-3Rci抗体与IL-3Rci的结合可以通过流式细胞术测定法来测定或测量。(抗体的生产)本发明还提供了用于制备具有对IL-3RCI阳性细胞有毒性的人类IL-3Rα抗体的方法。在实施方案中，方法包含向能够表达人类免疫球蛋白的动物(例如转基因小鼠或转基因牛)给药与导入到细胞中的人类IL-3Ra重组蛋白或IL-3Ra基因偶联的人类 IL-3Ra细胞外区域；筛选动物中人类IL-3Rci抗体的表达；选择产生人类IL-3R α抗体的动物；以及从所选动物分离抗体。适合用于抗体生产的IL-3Rci蛋白可以通过各种标准的蛋白纯化和重组表达技术中的任一种来生产。例如，IL-3Ra序列可以通过标准的肽合成技术例如固相合成来制备。为了便于表达或合成的蛋白的纯化，蛋白的一部分可以包含氨基酸序列例如FLAG标签、T7标签、聚组氨酸序列等。蛋白表达在细胞内，并可以被纯化。蛋白可以通过重组方法表达成另一个大的蛋白(例如融合或嵌合产物)的一部分。适合用于产生免疫应答的IL-3Ra 的实施方案包括IL-3Ra子序列例如免疫原性片段。IL-3Ra的其他实施方案包括表达 IL-3Ra的细胞、含有IL-3Rci的制备物或细胞提取液或级分，以及部分纯化的IL-3Rα。用于制备多克隆抗体和单克隆抗体的方法在本技术领域中是公知的。例如，将 IL-3Ra或其免疫原性片段通过任选与载体例如匙孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(例如 BSA)偶联，或与佐剂例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合，用于免疫动物。通过分离源自于对IL-3Rci有反应的被免疫动物的脾细胞，可以使用杂交瘤技术将其与骨髓瘤细胞融合。通过与IL-3Ra或其免疫原性片段的反应性，可以筛选由杂交瘤产生的单克隆抗体。可以被免疫的动物包括灵长类、小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、牛和豚鼠。最初和任选的任何后续免疫可以通过静脉内途径、腹膜内途径、肌肉内途径或皮下途径。此外，为了增加免疫应答，可以将抗原与其他蛋白例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白和破伤风类毒素偶联，或者可以与佐剂例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等混合。最初和任选的任何后续免疫可以通过腹膜内途径、肌肉内途径、眼内途径和皮下途径。免疫可以使用相同浓度或不同浓度的IL-3Ra制备物，或以规则或不规则的时间间隔进行。动物包括经过遗传修饰以包含人类基因座的动物，并且可以使用其制备人类抗体。具有一个或多个人类免疫球蛋白基因的转基因动物的实例，描述在例如美国专利 No. 5，939，598、W002/43478和W002/092812中。使用常规的杂交瘤技术，从对抗原具有高响应性的被免疫小鼠分离脾细胞，并将其与骨髓瘤细胞融合。由此可以获得与IL-3Ra结合的单克隆抗体。用于生产人类多克隆抗体和人类单克隆抗体的方法被进一步描述(参见例如 Kuroiwa 等,Nat.Biotechnol. 20 :889(2002) ；W098/24893 ；W092/01047 ；W096/34096 ； W096/33735 ；美国专利 No. 5，413，923 ；美国专利 No. 5，625，126 ；美国专利 No. 5，633，425 ； 美国专禾Ij No. 5，569，825 ；美国专利No. 5，661，016 ；美国专利No. 5，545，806 ；美国专利No. 5，814，318 ；美国专利No. 5，885，793 ；美国专利No. 5，916，771和美国专利 No. 5，939，598)。术语“人类”当用于指称抗体时，是指抗体的氨基酸序列完全是人类氨基酸序列， 即是人类重链和人类轻链可变区和人类恒定区。因此，所有氨基酸都是人类的氨基酸或存在于人类抗体中。非人类抗体的抗体可以通过用人类抗体中存在的氨基酸残基取代非人类氨基酸残基，制造成完全人类抗体。人类抗体中存在的氨基酸残基、CDR区图谱和人类抗体共有残基在本技术领域中是众所周知的(参见例如Kabat，免疫重要的蛋白的序列(第四版)(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition),美国卫生与人类月艮务部公共卫生服务局(US Department of Health and Human Services,Public Health
19Service (1987) ；Chothia和Lesk (1987))。根据使用22个已知人类VHIII序列作为对象所进行的调查获得的人类VH第III亚组的共有序列，以及根据使用30个已知人类κ链I序列作为对象所进行的调查获得的人类VL κ链第I亚组的共有序列，描述在Indian，Mol. Immunol, 31 :169(1994)和 Padlan，Mol. Immunol, 28 :489(1991)中。因此，人类抗体包括其中一个或多个氨基酸残基已被在任选的其他人类抗体中存在的一个或多个氨基酸取代的抗体抗IL-3Rci抗体的实例包括使用本技术领域中的已知方法制备的抗体，所述方法例如CDR嫁接(EP 239，400 ；W091/09967 ；美国专利No. 5，225，539 ；美国专利 No. 5，530, 101 ；和美国专利 No. 5，585，089)、表面镶饰、表面重塑(EP592, 106 ；EP519, 596 ； Padlan, Molecular Immunol. 28 :489(1991) ；Studnicka 等，Protein Engineering 7 805 (1994) ；Roguska 等，Proc. Nat ‘ 1 Acad. Sci. USA 91 :969 (1994))和链改组(美国专利No. 5，565，332)。为了产生人源化抗体，人类共有序列(Padlan，Mol. Immunol 31: 169 (1994)；和 Padlan，Mol. Immunol. 28 :489 (1991))已被使用(Carter 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :4285(1992)；和 Presta 等，J. Immunol 151 :2623 (1993)) 术语“人源化”当用于指称抗体时，是指抗体的氨基酸序列在受体的人类免疫球蛋白分子中具有与目标抗原特异性结合的互补决定区(CDR)的一个或多个非人类氨基酸残基(例如小鼠、大鼠、山羊、兔等)，以及Fv构架区(FR)中的一个或多个人类氨基酸残基(位于CDR两侧的氨基酸残基)。被称为“灵长类化”的抗体在“人源化”的意义范围之内，只是受体人类免疫球蛋白分子和构架区的氨基酸残基，除了任何人类残基之外，可以是任何灵长类的氨基酸残基(例如猴、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、恒河猴)。免疫球蛋白的人类 FR残基可以用相应的非人类残基取代。因此，例如，为了改变、通常是提高抗原亲和性或特异性，CDR或人类构架区中的残基可以替换成相应的来自非人类CDR或构架区供体抗体的残基。人源化抗体可以包含不能在人类抗体和供体CDR或构架序列中发现的残基。例如， 可以预计，在特定位置处不能在人类抗体和供体非人类抗体中发现的FR取代，可以提高人类抗体在该位点处的结合亲和性或特异性。基于分子模拟的抗体构架和CDR取代在本技术领域中是公知的，例如通过模拟CDR和架构残基的相互作用来鉴定对于抗原结合来说重要的构架残基，以及通过序列比较来鉴定特定位置处的不常见构架残基(参见例如美国专利 No. 5，585，089 ；和 Riechmann 等，Nature, 332 :323 (1988))。在IL-3Ra抗体中包括嵌合抗体。根据本说明书，术语“嵌合”及其语法变化形式当用于指称抗体时，是指抗体的氨基酸序列包含一个或多个部分，其源自于两种或多种不同物种，从两种或多种不同物种获得或分离，或基于两种或多种不同物种。例如，抗体的一部分可以是人类的(例如恒定区)，并且抗体的其他部分可以是非人类的(例如小鼠重链或小鼠轻链可变区)。因此，嵌合抗体的实例包括其中抗体的不同部分源自于不同物种的抗体。与人源化或灵长类化抗体不同，嵌合抗体可以在抗体的任意区域中具有不同物种的序列。用于生产嵌合抗体的方法在本技术领域中是已知的(例如Morrison，Science 229 :1202 (1985) ；Oi 等,BioTechniques 4 :214(1986) ；Gillies 等,J. Immunol. Methods 125 :191(1989)；美国专利 No. 5，807，715 ；美国专利 No. 4，816，567 ；和美国专利 No. 4，816，397)。例如，在 Munro，Nature 312:597(1984) ；Neuberger 等，Nature 312 604(1984) ；Sharon等，Nature 309 :364(1984) ；Morrison等，Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 81 :6851(1984) ；Boulianne 等，Nature 312 :643(1984) ；Capon 等，Nature337 :525 (1989)； 和Traunecker等，Nature 339:68(1989)中，嵌合抗体中源自于一个物种的抗体可变区被源自于另一个物种的抗体可变区代替。此外，抗IL-3Rci抗体可以通过杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术及其组合来制备(参见美国专利No. 4，902, 614、美国专利No. 4，543, 439和美国专利 No. 4，411，993 ；也参见《单克隆抗体，杂交瘤新维度生物分析》(Monoclonal Antibodies. Hybridomas :A New Dimensionin Biological Analyses), Plenum Press, Kennett, McKearn 和 Bechtol 等，1980，以及 Harlow 等，《抗体实验指南》(Antibodies :A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二片反，1988)。本发明的人类抗人类IL-3Ra抗体使用染色体转移小鼠(KM小鼠(注册商标))产生，所述小鼠用各种形式的可溶型重组人类IL-3Rα蛋白或表达IL-3Ra的细胞系来免疫 (W002/43478, W002/092812 和 Ishida 等，((IBC 第 11 次抗体工程会议摘要》(IBC' s IIth Antibody EngineeringMeeting，Abstract (2000))。因为人类抗人类 IL-3R α 抗体可检测染色的不是未转化的亲代细胞系，而是人类IL-3Rci稳定转染的细胞系例如JUrkat-IL-3Ra 细胞和L9^-IL_3Ra细胞，因此特异性显示与人类IL-3R α结合的抗体。本发明的抗体可以具有κ轻链序列或λ轻链序列、如天然存在的抗体中所存在的它们任一种的全长、其混合物(即κ链序列与λ链序列的融合产物)及其子序列/片段。天然存在的抗体分子含有两个K轻链或两个λ轻链。本发明提供了用于制备与IL-3Ra特异性结合的抗体的方法。在特定实施方案中，制备IL-3Ra抗体的方法包含将人类IL-3Ra、其子序列或其片段(例如IL_3Ra细胞外区域)，如果需要与人类Fc重组蛋白偶联，给药于能够表达人类免疫球蛋白的动物(例如转基因小鼠或转基因牛)，筛选表达人类IL-3Ra抗体的动物，选择产生人类IL-3Ra抗体的动物，以及从所选动物分离抗体。在实施方案中，人类IL-3Ra抗体是否具有IL-3Ra拮抗或激动活性通过该方法判断。效应细胞活性是指通过抗体的Fc区的抗体依赖性活性，已知的例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC活性)、补体依赖性细胞毒性(CDC活性)、由吞噬细胞例如巨噬细胞和树突状细胞进行的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADP活性)等。作为控制本发明的抗IL-3Ra单克隆抗体的效应细胞活性的方法，实例包括控制与抗体Fc区的297位天冬氨酸(Asn)结合的复合物类型的N-连接糖链的还原端中，通过 a_l，6键与N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)结合的岩藻糖(也称为核心岩藻糖)的量的方法 (W02005/035586, W02002/31140和W000/61739)，通过修饰抗体Fc区的氨基酸残基进行控制的方法等。效应细胞活性可以通过向本发明的抗IL-3Ra单克隆抗体使用这些方法中的任一种来控制。通过控制抗体Fc的复合物类型的N-连接糖链的核心岩藻糖含量，可以增加或降低抗体的效应细胞活性。作为降低与结合抗体Fc的复合物类型的N-连接糖链结合的岩藻糖含量的方法，可以提到的是脱岩藻糖化作用(脱岩藻糖化或非岩藻糖化)。脱岩藻糖化作用是使用a-1，6-岩藻糖基转移酶基因被缺失的CHO细胞来表达抗体，并可以获得不与岩藻糖结合的抗体。不与岩藻糖结合的抗体具有高的ADCC活性。另一方面，作为增加与结合抗体Fc的复合物类型的N-连接糖链结合的岩藻糖含量的方法，可以通过使用导入了 α-1， 6-岩藻糖基转移酶基因的宿主细胞表达抗体来获得与岩藻糖结合的抗体。与岩藻糖结合的抗体与不与岩藻糖结合的抗体相比，具有较低的ADCC活性。此外，可以通过修饰抗体Fc区的氨基酸残基来增加或降低ADCC活性和⑶C活性。 例如，可以使用在US2007/0148165中描述的Fc区的氨基酸序列来增加抗体的CDC活性。此夕卜，可以通过执行在US6，737，056、US7, 297, 775和US7，317，091中描述的氨基酸修饰来增加或降低ADCC活性或CDC活性。此外，可以通过在一个抗体中使用组合的上述方法，来获得其中抗体的效应细胞活性被控制的抗体。根据本发明，进一步提供了本发明的例如载体等的核苷酸序列。在实施方案中，载体包含编码IL-3RCI抗体或其子序列或片段的核酸序列。核酸可以具有各种不同长度。编码本发明的IL-3RCI抗体或其子序列的核酸的长度一般约为100至600个核苷酸，或涵盖在上述长度范围内的任何数值或范围；100至150、 150 至 200,200 至 250,250 至 300,300 至 350,350 至 400,400 至 450,450 至 500,500 至 550 或550至600个核苷酸长，或在上述长度范围内或涵盖上述长度范围的任何数值或范围。编码本发明的IL-3Ra抗体或其子序列的核酸长度的实例一般包括10至20、20至30、30至 50,50 至 100,100 至 150,150 至 200,200 至 250,250 至 300,300 至 400,400 至 500,500 至 600个核苷酸，以及在这些长度内或涵盖这些长度的任何数值或范围。术语“核酸”和“多核苷酸”是指通过磷酸酯键或等效的键相连的至少两个或多个核糖或脱氧核糖核酸碱基对(核苷酸)。核酸包括多核苷酸和多核苷。核酸包括单分子、 双分子、三分子、环状分子或线性分子。核酸的实例包括RNA、DNA、cDNA、基因组核酸、天然存在的核酸和非天然核酸例如合成的核酸，但不限于此。短的核酸和多核苷酸(例如10至 20,20至30、30至50、50至100个核苷酸)通常被称为单链或双链DNA的“寡核苷酸”或 “探针”。核酸可以使用各种标准克隆技术和化学合成技术来制备。技术的实例包括但不限于核酸扩增例如聚合酶链反应(PCR)，其使用基因组DNA或cDNA靶，并使用可以与抗体编码序列退火的引物(例如简并引物混合物)。此外，核酸也可以通过化学合成(例如固相氨基磷酸酯合成)或从基因转录来制备。然后，在将制备的序列克隆到质粒中然后扩增，或体外翻译所述序列后，制备的序列可以被细胞(例如宿主细胞例如酵母、细菌或真核细胞(动物或哺乳动物细胞或在植物中))表达。载体是可以通过插入或掺入核酸进行操作的媒介。载体的实例包括质粒载体、病毒载体、原核细胞(细菌)载体和真核细胞(植物、真菌、哺乳动物)载体。载体可用于核酸的体外或体内表达。这样的载体被称为“表达载体”，可用于转移包括编码IL-3Rα抗体或其子序列或片段的核酸的核酸，以及通过体外(例如在溶液中或在固相上)、通过细胞或通过在对象体内来表达被编码的蛋白。此外，载体可用于核酸的操作。对于遗传操作来说，可以使用“克隆载体”在体外 (例如在溶液中或在固相上)、在细胞中或在对象体内对插入的核酸进行转录和翻译。一般来说，载体含有复制原点，用于在细胞中在体外或体内扩增。如果需要，可以包括控制元件例如载体中存在的表达控制元件，以便于转录和翻译。载体可以包括选择标志物。“选择标志物”是允许对含有基因的细胞进行选择的基
2因。“正选择”是指通过正向选择来选择含有选择标志物的细胞的方法。药物抗性是正选择标志物的实例，含有标志物的细胞将在含有药物的培养基中存活，而不含标志物的细胞将死亡。选择标志物的实例包括药物抗性基因，例如提供对G418的抗药性的neo、提供对潮霉素的抗药性的hygr、提供对嘌呤霉素的抗药性的puro等。其他正选择标志物包括能够鉴定或筛选含有标志物的细胞的基因。这些基因的实例包括荧光蛋白(GFP和GFP样发色团、萤光素酶)基因、IacZ基因、碱性磷酸酶基因和表面标志物例如CD8。“负选择”是指通过暴露于适合的负向选择药剂杀死含有负选择标志物的细胞的方法。例如，含有单纯性疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因的细胞(Wigler等，Cell,11 :223(1977))对药物更昔洛韦 (GANC)敏感。类似地，gpt基因使细胞对6-硫代黄嘌呤敏感。病毒载体包括基于下列病毒的载体反转录病毒(不仅感染分裂中的细胞而且感染未分裂细胞的慢病毒)，泡沫病毒(美国专利No. 5，624，820、美国专利No. 5，693，508、 美国专禾Ij No. 5，665，577、美国专利 No. 6，013，516 和美国专利 No. 5，674，703 ；W092/05266 和W092/14829)，腺病毒(美国专利No. 5，700，470、美国专利No. 5，731，172和美国专利 No. 5，928，944)，腺相关病毒(AAV)(美国专利No. 5，604，090)，单纯性疱疹病毒载体(美国专利No. 5，501，979)，细胞肥大病毒(CMV)系统载体(美国专利No. 5，561，063)，呼肠孤病毒，轮状病毒基因组，猿猴病毒40 (SV40)或乳头瘤病毒(Cone等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81 :6349(1984)；《真核病毒载体》(Eukaryotic Viral Vectors), Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman 主编，1982 ；Sarver 等，Mol. Cell. Biol，1 :486(1981)；美国专利No. 5，719，054)。腺病毒有效侵染缓慢复制的和/或终端分化细胞，并可用于靶向缓慢复制的细胞和/或终端分化细胞。可用于表达的病毒载体的其他实例包括细小病毒、诺沃克病毒、冠状病毒、副粘液病毒和杆状病毒、披膜病毒(例如辛德毕斯病毒和Semliki森林病毒)以及疱疹性口腔炎病毒(VSV)。包含核苷酸的载体，当核酸与表达元件相连以发挥作用时，可以被表达。术语“相连以发挥作用”(可操作连接)是指所指称的元件之间的物理或功能关系允许它们以所打算的方式运作。因此，核酸与表达控制元件可操作连接是指控制元件调节核酸转录并在适合情况下调节转录产物的翻译。“表达控制元件”或“表达控制序列”是影响可操作连接的核酸的表达的多核苷酸。 启动子和增强子是表达控制元件和序列的非限制性的具体实例。“启动子”是顺式作用的 DNA调控区，其能够起始下游(3’方向)核酸序列的转录。加速转录起始的核苷酸包含在启动子序列中。增强子也调控核酸的表达，但是在远离与其可操作连接的核酸的转录起始位点处起作用。当增强子存在于核酸的5’或3’末端以及核酸内部(例如内含子或编码序列)时，增强子也起作用。表达控制元件的其他实例包括前导序列和融合配偶体序列、用于制备多基因或多顺反子信使的内部核糖体进入位点(IRES)元件、用于维持基因的正确阅读框以使mRNA能够框内翻译的内含子拼接信号、为目标转录产物产生正确的多腺苷化的多腺苷化信号和终止密码子。表达控制元件的实例包括“组成型”元件，其中可操作连接的核酸的转录不需要信号或刺激物的存在即可发生。对信号或刺激物做出响应而产生表达和增加或降低可操作连接的核酸的表达的表达控制元件是“可调节的”。对信号或刺激物做出响应而增加可操作连接的核酸的表达的可调节元件，被称为“诱导型元件”。对信号或刺激物做出响应而降低可操作连接的核酸的表达的可调节元件，被称为“阻遏型元件”(即信号降低表达；并且当信号被移除或不存在时表达增加)。用于细菌表达的组成型启动子的实例包括例如λ噬菌体的Τ7和pL、plac、ptrp 和ptac(ptrp-lac杂合启动子)等启动子。对于昆虫细胞系统来说，可以使用组成型或诱导型启动子(例如蜕皮激素启动子)。用于酵母的组成型启动子包括诱导的启动子例如ADH、LEU2、GAL等(例如参见Ausubel等，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology), Vol. 2,第 13 章，Greene Publish. Assoc. &ffiley Interscience edition, 1988 ；Grant 等，《酶学方法》(Methods in Enzymology)，153 :516-544 (1987) ffu&Grossman, 1987，Acad. Press, N. Y. ；Glover,《DNA 克隆》(DNA Cloning)，Vol. 11，第 3 Μ, IRLPress, Wash. , D. C. , 1986 ；Bitter,《g| ψ Tj 勸(Methods in Enzymology)，152 673-684(1987)，Berger&Kimmel 主编，Acad. Press, N. Y.；以及 Mrathern 等，《酵母菌的分子生物学〉〉(The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces), Cold Spring Harbor Press, Vol. 1 和 Vol. 11(1982))。对于在哺乳动物中表达来说，可以使用源自于病毒或其他来源的组成型启动子。 例如，可以使用源自于CMV、SV40或病毒长末端重复序列(LTR)，或哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白IIA启动子、热休克蛋白启动子、留体/甲状腺激素/视黄酸响应元件)或哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子、小鼠乳腺癌病毒LTR)的诱导型启动子。表达控制元件的实例包括在特定组织或细胞类型中有活性的元件，这样的元件被称为“组织特异性表达控制元件”。一般来说，组织特异性表达控制元件在特定细胞或组织类型中与其他细胞或组织类型相比更有活性，这是因为该组织特异性表达控制元件，被在特定细胞或组织类型中有活性的转录激活蛋白或其他转录因子所识别。这样的表达控制元件的非限制性的具体实例是己糖激酶II、C0X-2、α -胎蛋白、癌胚抗原、DE3/MUC1、前列腺特异抗原、C-erB2/neU、葡萄糖依赖性胰岛素分泌刺激性多肽(GIP)、端粒酶反转录酶和启动子例如缺氧响应性启动子。根据本发明，提供了用本发明的IL-3RCI核酸或载体转化或转染的宿主细胞。宿主细胞的实例包括但不限于原核细胞和真核细胞，例如细菌、真菌(酵母)和植物、昆虫和动物(例如哺乳动物例如灵长类、人类等)的细胞。被转化的细胞的非限制性实例包括用重组噬菌体核酸、质粒核酸或粘粒核酸表达载体转化的细菌；用重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)感染或用重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞；用重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞；以及用重组病毒表达载体(例如反转录病毒、腺病毒、痘苗病毒)感染的动物细胞或被操作用于稳定表达的转化的动物细胞。CHO细胞是表达IL-3Rci抗体及其子序列和片段的哺乳动物宿主细胞的非限制性实例。宿主细胞可以是来自于原初细胞分离系的多个细胞或细胞群体、分离的次级细胞或传代培养细胞或建立的细胞系或永生化细胞培养物。术语“被转化”或“被转染”当用于指称细胞(例如宿主细胞)或生物体时，是指在将外源分子例如蛋白或核酸(转入基因)引入到细胞中后，细胞中基因的改变。因此，“被转染”或“被转化”的细胞是其中通过人工通过例如重组DNA技术引入了外源分子的细胞或其后代。
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核酸或蛋白可以被稳定或暂时转染或转化(表达)在细胞或其后代中。导入的蛋白可以通过生长细胞或转录核酸来表达。因为在复制期间有可能发生突变，因此存在着被转染或转化的细胞的后代与亲代细胞不同一的情况。一般来说，在细胞转染或转化中使用载体。载体可以包含在病毒粒子或囊泡中，并可以任选地通过将蛋白包含在与靶细胞配体或受体结合的粒子或囊泡的表面上，根据需要定向到特定细胞类型。因此，通过制备用于体外、离体或体内转染或转化目的病毒粒子或囊泡本身或病毒表面蛋白，可以将细胞用作靶。因此，载体包括将病毒和非病毒载体体外、体内和离体递送到细胞、组织或器官中的技术。此外，将核酸引入靶细胞(例如宿主细胞)，也可以通过本技术领域公知的方法来进行，例如渗透冲击(例如磷酸钙)、电穿孔、微注射、细胞融合等。核酸和多肽的体外、离体和体内导入也可以使用其他技术来进行。例如聚合物质例如聚酯、聚酰胺酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或乳酸交酯/乙醇酸交酯共聚物、聚乳酸交酯/乙醇酸交酯共聚物或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物等。 核酸可以通过凝聚技术或通过界面聚合，分别包封在羟甲基纤维素或明胶微胶囊或使用聚甲基丙烯酸甲酯制备的微胶囊或胶体系统中。胶体分散系统包括基于聚合物复合物、纳米粒子、微球、珠子或脂类(水包油类型的乳液、微胶粒、混合的微胶粒、脂质体等)的系统。用于将各种组合物导入细胞的脂质体在本技术领域中是公知的，其中包括例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、Iipofectin和DOTAP(例如美国专利No. 4，844，904、美国专利 No. 5，000, 959、美国专利 No. 4，863，740 和美国专利 No. 4，975，沘2，以及 GIBC0-BRL， Gaithersburg, Md.) 0可用于基因治疗的基于哌嗪的两亲性阳离子脂类(参见例如美国专利No. 5，861，397)也是已知的。阳离子脂类系统也是已知的(参见例如美国专利 No. 5，459，127)。在本说明书中，聚合物质、微胶囊和胶体分散系统(脂质体等)合称为“囊泡”。此外，可使用在生产抗体的方法中的适合技术的实例是亲和纯化、非改性凝胶纯化、HPLC或RP-HPLC、孔径排阻、通过蛋白A柱纯化以及这些技术的任选组合。可以使用 ELISA测定法确定IL-3Ra抗体同种型，并且例如可以使用吸附抗人类Ig的小鼠Ig来鉴定人类Ig。结合亲和性可以通过结合(Ka)和解离(Kd)速率来确定。平衡亲和常数KD 是Ka/Kd的比率。结合(Ka)和解离(Kd)速率可以使用表面等离子共振(SPR)来测量(Rich 禾口 Myszka，Curr. Opin. Biotechnol.，11 :54(2000) :Englebienne，Analyst.， 123:1599(1998))。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是公知的并可商购 (BiaCore2000, Biacore AB, Upsala, Sweden ；以及 Malmqvist, Biochem. Soc. Trans. ,27 335(1999))。KD值可以被定义为饱和IL_3Ra上的一半结合位点(50% )所需的IL_3Ra 抗体浓度。(在灵长类中的交叉性质)目前，尽管在世界上正开发多达500种治疗性抗体，也就是说人类抗体有很大可能性能够避免免疫原性问题。但另一方面，在许多情况下人类抗体的药效完全不能在啮齿动物中表现出来。在这样的情况下，在许多情况下在毒性测试中不得不使用灵长动物，此夕卜，只在黑猩猩中发现反应性，这在许多情况下并不罕见。当只能在黑猩猩中发现药理反应时，毒性测试受到更显著的限制。首先，能够进行黑猩猩试验的场所相当有限，在许多情况下个体感染HIV，并且还存在参与实验的工人的劳动卫生的问题。此外，对于黑猩猩来说，还存在着最终给药后的解剖试验不能进行以及生殖毒性试验也不可能进行等大量限制。因此，从对于开发药物来说必需的高级毒性试验的观点来看，在猴(食蟹猴(Macaca fascicularis)和/或恒河猴(Macaca mulatto))中验证药效的能力是有用的。关于使用猴用来证实猴交叉反应性的方法，它可以通过公知的方法例如免疫化学组织染色方法、固相酶免疫测定法(在后文中称为“ELISA”)流式细胞术(FCM)等来证实。(药物组合物)抗体可以包含在药物组合物中。在实施方案中，抗体包含可药用载体、稳定剂或填充剂，并被制备成水溶液或作为冷冻干燥制剂的形式。典型情况下，使用适量可药用盐使药物制剂等渗。可接受的载体、稳定剂或填充剂的实例包括缓冲溶液例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸等；低分子量(残基数量少于10)多肽；蛋白例如血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白等；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸等；单糖二糖和其他糖类，例如葡萄糖、甘露糖、糊精等；螯合剂例如EDTA等；甜味剂例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、山梨糖醇等；成盐平衡离子例如钠等； 金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；防腐剂(十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟苯甲酸烷基酯例如对羟苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；和/或非离子表面活性剂例如TWEEN 、 PLUR0NICS 、聚乙二醇(PEG)等。(靶向IL-3Rci表达细胞的抗肿瘤物质的治疗应用)对治疗应用进行检验的疾病的实例，包括但不限于被认为可以通过结合或靶向表达IL-3Ra的细胞来治疗的疾病，所述细胞例如血液肿瘤细胞(AML细胞、CML细胞、MDS细胞、ALL细胞、CLL细胞、多发性骨髓瘤细胞等)、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、辅助性T细胞(例如Thl细胞、Thl7细胞)、调节性T细胞(例如⑶4阳性⑶25阳性细胞)、抗原呈递细胞 (例如树突状细胞、单核细胞-巨噬细胞和相关细胞(肝星状细胞、破骨细胞、小神经胶质细胞、表皮内巨噬细胞、尘细胞(肺泡吞噬细胞)等))。对治疗应用进行检验的疾病的实例，包括其中在骨髓或外周血中发现IL-3RCI表达的血液疾病。具体实例可以包括急性骨髓性白血病(AML)。根据能够确定从造血干细胞分化成各种血细胞的过程中细胞中的那个细胞阶段引起致瘤性转化的FAB分类标准(法国-美国-英国标准)，急性骨髓性白血病被分类成MO (微分化类型的成髓细胞性白血病)、 Ml (未分化的成髓细胞性白血病)、M2(已分化的成髓细胞性白血病)、M3(急性早幼粒细胞性白血病)、M4 (髓单核细胞性白血病)、M5 (单核细胞性白血病)、M6 (红白血病)、M7 (巨核细胞性白血病)疾病类型及其亚型。此外，疾病的其他实例包括急性淋巴细胞性白血病、 非典型白血病、慢性淋巴细胞性白血病、成人T细胞白血病、NK/T细胞淋巴瘤、颗粒状淋巴细胞增生(LGL白血病)、真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、高嗜酸性粒细胞综合征、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥散性大 B-细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤和巨大淋巴结增生症。本发明的包含给药或递送靶向表达IL-3R α的细胞的IL_3R α抗体和抗肿瘤物质的方法，可以通过任何可接受的方法来进行。在具体实施方案中，它们被局部、区域性或系统性给药于对象。此外，对于IL-3Rci抗体来说，靶向表达IL_3R α的细胞的用于治疗上面提到的疾病的抗肿瘤物质，也可以考虑与适合于同样疾病的其他治疗药剂(典型为化疗药剂)组合， 或与放疗组合给药。适合的其他治疗药剂的实例包括化疗药剂例如阿糖胞苷(Ara-C)、蒽环系统抗肿瘤药剂(典型为柔红霉素(DNR)、伊达比星(IDA))等、分化诱导治疗药剂例如全反式视黄酸(ATRA)、亚砷酸、Am80 (他米巴罗汀)、吉妥珠单抗-奥唑米星(奥唑米星-抗 CD33抗体偶联物)、托泊替康、氟达拉滨、环孢霉素、米托蒽醌(MIT)、干扰素和伊马替尼，但不限于此，并且还包括与被认为在临床上有效的治疗方法的组合。哺乳动物(例如人类)被包括在可以通过本发明治疗的对象中。在具体实施方案中，对象是血液肿瘤候选者或接受血液肿瘤治疗的对象，有可能引起IL-3Rci介导的细胞应答的对象或接受IL-3RCI介导的细胞应答的治疗的对象，作为髓细胞性恶性肿瘤候选者的对象或接受髓细胞性恶性肿瘤治疗的对象，或作为急性骨髓性白血病候选者的对象或接受急性骨髓性白血病治疗的对象。 更具本说明书，术语“治疗”及其语法变化形式是指对每个希望获得生理效应或在患者上获得良好结果的对象执行的方案、计划、过程或改善方法。因此，本发明的方法包括特别是对给定对象的障碍、疾病、病理、疾病状况或症状产生可测量的改进或有益效果的治疗和治疗方法。可测量的改进或有益效果是障碍、疾病、病理、疾病状况或症状中的任一种的客观或主观的、不适中的、暂时或长期的改进，或与障碍、疾病、生理条件、病理或状态相关或由其引起的不利症状的发作、严重性、持续时间或频率的减少。根据本发明的方法，有可能其效果不总是立即显现，而是随着时间的过去，在较晚些时候发现最终的改进或有益效果，由此在给定对象中将出现稳定或改善。除非另有指明，否则在本说明书中使用的所有技术术语和科学术语，具有与本发明所涉及的技术领域中的专业人员所通常理解的相同的意义。与本说明书中所描述的类似或等效的方法和材料可用于本发明的操作或检验中，但是在本说明书中所描述的是适合的方法和材料。
实施例实施例1 人类、食蟹猴(Macaca fascicularis)或恒河猴(Macaca mulatto) IL-3Ra表达细胞的制备(IL-3R a cDNA的分子克隆和表达载体的制备)使用ExTaq (TAKARA BIO INC.)，通过 PCR 从血细胞来源的 DNA(CL0NTECH Human MTC Panel)扩增了人类 IL-3R α cDNA。作为 PCR 装置，使用了 GeneAmp PCR 系统 9700 (Applied Biosystems，在后文中，在本说明书中PCR装置是相同的)。对于PCR来说， 在94°C 5分钟的变性步骤后，将94°C 30秒-55°C 30秒-72°C 2分钟的三步反应执行40个循环，然后执行99°C 30秒的反应。使用的PCR引物如下IL-3Ra_Fw :5，-CGGCAATTGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCAC-3，(SEQ ID NO 3)IL-3Ra_Re 5，-ATTGCGGCCGCTCAAGTTTTCTGCACGACCT-3，(SEQ ID NO 4)对由此获得的PCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。 DNA通过溴乙锭染色进行可视化。切下约1. 2kb的条带，并用JetSob (Genomed)提取。将提取到的DNA用MfeI和NotI消化，与用EcoRI和NotI消化过的pEGFP-Nl载体(Clontech) 或pEF6/MyC-His载体混合，并使用TaKaRa连接试剂盒进行连接。对于转化来说，将连接样品与DHlOB感受态细胞混合，铺于LB平板(含卡那霉素)上。使用LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，通过直接菌落PCR进行pEGFP-Nl载体的插入检查。对于PCR来说，在94 °C 5分钟的变性步骤后，将94°C 30秒-55°C 30秒_72°C 2分钟的三步反应执行40个循环，然后执行99°C 30秒的反应。关于所用的引物，使用了 IL-3Ra-Fw和IL_3Ra-Re。对由此获得的PCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。 DNA通过溴乙锭染色进行可视化。使用可以从其获得约1. 21Λ扩增产物的菌落，通过直接测序方法测定核苷酸序列。在测序样品的反应中，使用了 BigDyeOOTerminator v3. 1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)和 GeneAmp PCR 系统 97OO (Applied Biosystems)(它们用于本说明书中所有的DNA序列分析中)。关于引物，使用了 IL-3Ra-Fw、IL-3Ra-Re和下列引物。IL-3Ra_seqFl :5，-GTCTTCACTACAAAACGGAT-3，(SEQ ID NO 5)使用ABI 3700XL DNA分析仪(Applied Biosystems)作为序列分析装置。选择与 GenBank关联号NP-002174. 1的编码区具有相同序列的克隆，并通过Minipr印方法提取质粒 DNA。载体名分别是 pEGFR-m/hCD123 和 pEF6/Myc_His/hCD123。插入片段的序列(MfeI至NotI)如下。CAATTGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCACGCTGCTCCTGATCGCCCTGCCCTGTCTCCTGCAAACGAAGGAAGATCCAAACCCACCAATCACGAACCTAAGGATGAAAGCAAAGGCTCAGCAGTTGACCTGGGACCTTAACAGAAATGTGACCGATATCGAGTGTGTTAAAGACGCCGACTATTCTATGCCGGCAGTGAACAATAGCTATTGCCAGTTTGGAGCAATTTCCTTATGTGAAGTGACCAACTACACCGTCCGAGTGGCCAACCCACCATTCTCCACGTGGATCCTCTTCCCTGAGAACAGTGGGAAGCCTTGGGCAGGTGCGGAGAATCTGACCTGCTGGATTCATGACGTGGATTTCTTGAGCTGCAGCTGGGCGGTAGGCCCGGGGGCCCCCGCGGACGTCCAGTACGACCTGTACTTGAACGTTGCCAACAGGCGTCAACAGTACGAGTGTCTTCACTACAAAACGGATGCTCAGGGAACACGTATCGGGTGTCGTTTCGATGACATCTCTCGACTCTCCAGCGGTTCTCAAAGTTCCCACATCCTGGTGCGGGGCAGGAGCGCAGCCTTCGGTATCCCCTGCACAGATAAGTTTGTCGTCTTTTCACAGATTGAGATATTAACTCCACCCAACATGACTGCAAAGTGTAATAAGACACATTCCTTTATGCACTGGAAAATGAGAAGTCATTTCAATCGCAAATTTCGCTATGAGCTTCAGATACAAAAGAGAATGCAGCCTGTAATCACAGAACAGGTCAGAGACAGAACCTCCTTCCAGCTACTCAATCCTGGAACGTACACAGTACAAATAAGAGCCCGGGAAAGAGTGTATGAATTCTTGAGCGCCTGGAGCACCCCCCAGCGCTTCGAGTGCGACCAGGAGGAGGGCGCAAACACACGTGCCTGGCGGACGTCGCTGCTGATCGCGCTGGGGACGCTGCTGGCCCTGGTCTGTGTCTTCGTGATCTGCAGAAGGTATCTGGTGATGCAGAGACTCTTTCCCCGCATCCCTCACATGAAAGACCCCATCGGTGACAGCTTCCAAAACGACAAGCTGGTGGTCTGGGAGGCGGGCAAAGCCGGCCTGGAGGAGTGTCTGGTGACTGAAGTACAGGTCGTGCAGAAAA
CTTGAGCGGCCGC(SEQ ID NO :6)通过PCR方法，使用LA Taq (TAKARA BIO INC)，从食蟹猴骨髓来源的cDNA或恒河猴骨髓来源的cDNA扩增了食蟹猴和恒河猴cDNA样品。使用GeneAmp PCR系统9700 (Applied Biosystems)作为PCR装置。对于PCR来说，在95 °C 1分钟的变性步骤后，将95 °C 15 秒-56°C 15秒-72°C 70秒的三步反应执行40个循环，然后执行72°C 2分钟的反应。根据 hIL-3Ra cDNA序列，通过对恒河猴基因组的公共数据库(http://www. hgsc. bnm. tmc. edu/ blast, hgsc)进行BLAST检索获得了子序列，用于设计引物。所使用的引物序列如下。Rhel23Fwl CGGCAATTGCCACCATGACCCTCCTTTGGCTGACGCTG (SEQ ID NO 7)Rhel23Rvl :TATATTGCGGCCGCTCAAGTTTTCTCCACCACCTGCAC(SEQ ID NO :8)对由此获得的PCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。 DNA通过溴乙锭染色进行可视化。切下约1. 2kb的条带，并用凝胶提取试剂盒01IAGEN)提取。将如此提取到的DNA与pGEM-T fesy载体(ftOmega)混合，并使用TaKaRa连接试剂盒进行连接。对于转化来说，将连接样品与DHlOB感受态细胞混合，铺于LB平板(含卡那霉素)上。使用LA Taq (Takara Shuzo Co.，Ltd.)，通过直接菌落PCR进行pGEM_T Easy载体的插入检查。对于PCR来说，在95 °C 1分钟的变性步骤后，将95 °C 15秒_56°C 15秒_72°C 1 分钟的三步反应执行35个循环，然后执行72°C 2分钟的反应。使用了下列引物T7 :TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO 9)SP6 :GATTTAGGTGACACTATAG(SEQ ID NO :10)对由此获得的PCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。 DNA通过溴乙锭染色进行可视化。使用可以从其获得约1. 21Λ扩增产物的菌落，通过直接测序方法测定核苷酸序列。作为PCR引物，使用了 T7和SP6。选择通过PCR显示出没有突变的菌落，并通过Minipr印方法提取其质粒DNA。将由此获得的DNA用MfeI和NotI消化， 与用EcoRI和NotI消化过的pEGFP-Nl载体^lontech)混合，并使用TaKaRa连接试剂盒进行连接。对于转化来说，将连接样品与DHlOB感受态细胞混合，铺于LB平板(含卡那霉素)上。使用La Taq (Takara Shuzo Co.，Ltd.)，通过直接菌落 PCR 进行 pEGFP-Nl 载体的插入检查。对于PCR来说，在94°C 5分钟的变性步骤后，将94°C 30秒_55°C 30秒_72°C 2 分钟的三步反应执行40个循环，然后执行99°C 30秒的反应。关于所用的PCR引物，使用了 Rhel23Fwl和 Rhel23Rvl。对由此获得的PCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。 DNA通过溴乙锭染色进行可视化。使用可以从其获得约1. 21Λ扩增产物的菌落，通过直接测序方法测定核苷酸序列。在测序样品的反应中，使用了 BigDyeOOTerminator v3. 1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)和 GeneAmp PCR 系统 9700 (Applied Biosystems)(它们用于本说明书中所有的DNA序列分析中)。关于引物，使用了 I he123FWl和I he123RVl。载体分别命名为 pEGFR-Nl/cyCD123 和 pEGFR_m/rhCD123。食蟹猴IL-3Ra的插入片段的序列(MfeI至NotI)如下。CAATTGCCACCATGACCCTCCTTTGGCTGACGCTGCTCCTGGTCGCCACGCCCTGTCTCCTGCAAACGAAGGAGGATCCAAATGCACCAATCAGGAATCTAAGG
ATGAAAGAAAAGGCTCAGCAGTTGATGTGGGACCTGAACAGAAACGTGACCGACGTGGAGTGTATCAAAGGCACCGACTATTCTATGCCGGCAATGAACAACAGCTATTGCCAGTTCGGAGCCATTTCCTTATGTGAAGTGACCAACTACACCGTCCGAGTGGCCAGTCCCCCGTTCTCCACGTGGATCCTCTTCCCTGAGAACAGTGGGACGCCTCAGGCAGGCGCGGAGAATCTGACCTGCTGGGTTCATGACGTGGATTTCTTGAGCTGCAGCTGGGTGGCAGGCCCGGCGGCCCCCGCTGACGTCCAGTACGACCTGTACTTGAACAATCCCAACAGCCACGAACAGTACAGGTGCCTTCACTACAAAACGGATGCTCGGGGAACACAGQATCGGGTGTCGGTTCGATGACATCGCTCGACTCTCCCGCGGTTCTCAAAGTTCCCACATCCTGGTGAGGGGCAGGAGCGCAGCCGTCAGTATCCCCTGCACAGATAAGTTTGTCTTCTTTTCACAGATTGAGAGATTAACTCCACCCAACATGACTGGAGAGTGTAATGAGACACATTCCTTCATGCACTGGAAAATGAAAAGTCATTTCAATCGCAAATTCCGCTATGAGC
TTCGGATCCAAAAGAGAATGCAGCCTGTAAGGACAGAACAGGTCAGAGACACAACCTCCTTCCAGCTACCCAATCCTGGAACGTACACAGTGCAAATAAGAGCCCGGGAAACAGTGTATGAATTCTTGAGTGCCTGGAGCACCCCCCAGCGCTTCGAGTGCGACCAGGAGGAGGGCGCGAGCTCGCGTGCCTGGCGGACGTCGCTGCTGATCGCGCTGGGGACGCTGCTGGCCTTGCTCTGTGTGTTCCTCATCTGCAGAAGGTATCTGGTGATGCAGAGGCTGTTTCCCCGCATCCCACACATGAAAGACCCCATCGGTGACACCTTCCAACAGGACAAGCTGGTGGTCTGGGAGGCGGGCAAAGCCGGCCTGGAGGAGTGTCTGGTGTCTGAAGTGCAGGTGGTGGAGAAAACTTGAGCGGCCGC(SEQ ID NO :11)恒河猴IL_3Ra的插入片段的序列(MfeI至NotI)如下。
CAATTGCCACCATGACCCTCCTTTGGCTGACGCTGCTCCTGGTCGCCACGCCCTGTCTCCTGCAAACCAAGGAGGATCCAAATGCACCAATCAGGAATCTAAGGATGAAAGAAAAGGCTCAGCAGTTGATGTGGGACCTGAACAGAAACGTGACCGACGTGGAGTGTATCAAAGGCACCGACTATTCTATGCCGGCAATGAACGACAGCTATTGCCAGTTCGGAGCCATTTCCTTATGTGAAGTGACCAACTACACCGTCCGAGTGGCCAGTCCTCCGTTCTCCACGTGGATCCTCTTCCCTGAGAACAGTGGGACGCCTCGGGCAGGCGCGGA TTGACCTGCTGGGTTCATGACGTGGATTTCTTGAGCTGCAGCTGGGTGGTAGGCCCGGCGGCCCCCGCTGACGTCCAGTACGACCTGTACTTGAACAATCCCAACAGCCACGAACAGTACAGGTGCCTTCGCTACAAAACGGATGCTCGGGGAACACAGATCGGGTGTCGGTTCGATGACA
TCGCTCGACTCTCCCGCGGTTCTCAAAGTTCCCACATCCTGGTGAGGGGCAGGAGCGCAGCCGTCAGTATCCCCTGCACAGATAAGTTTGTCTTCTTTTCACAGATTGAGAGATTAACTCCACCCAACATGACTGGAGAGTGTAATGAGACACATTCCTTCATGCACTGGAAAATGAAAAGTCATTTCAATCGCAAATTCCACTATGAGCTTCGGATCCAAAAGAGAATGCAGCCTGTAAGGACAGAACAGGTCAGAGACACAACCTCCTTCCAGCTACCCAATCCTGGAACGTACACAGTGCAAATAAGAGCCCGGGAAACAGTGTATGAATTCTTGAGTGCCTGGAGCACCCCCCAGCGCTTC
GAGTGCGACCAGGAGGAGGGCGCGAGCTCGCGTGCCTGGCGGACGTCGCTGCTGATCGCGCTGGGGACGCTGCTGGCCTTGCTCTGTGTGTTCCTCATCTGCAGAAGGTATCTGGTGATGCAGAGGCTGTTTCCCCGCATCCCACACATGAAAGAC
CCCATCGGTGACACCTTCCAACAGGACAAGCTGGTGGTCTGGGAGGCGGGCAAAGCCGGCCTGGAGGAGTGTCTGGTGTCTGAAGTGCAGGTGGTGGAGAAAACTTGAGCGGCCGC(SEQ ID NO :12)(IL-3Rci强制表达细胞系的制备)使用电穿孔(BTX)，用pEGFP-Nl 载体 /hCD123 或 pEF6/Myc_His 载体 /hCD123 感染 L929细胞(由ATCC制造)和Colon-26细胞(由ATCC制造)。具体来说，将10至20 μ g DNA与10万个细胞混合，并使其在300V和950 μ F反应。关于细胞，对pEGFP-Nl/h⑶123来说使用新霉素(Calbiochem)或对于pEF6/Myc_His/hCD123来说使用灭瘟素(Invitrogen) 来筛选药物抗性细胞。对于由此选择到的细胞，使用流式细胞仪(FAC SVantage,FACSAria 等，BD Biosciences)通过分拣进一步选择GFP阳性细胞或高表达IL-3R α (0)12 的细胞， 并分别命名为 L9^/hCD123 和 Colon46/hCD123。对于食蟹猴IL-3Rci和恒河猴IL_3Ra强制表达细胞的制备来说，它们也以与人类IL-3Rci强制表达细胞的情况相同的方式，使用和Colon-沈来制备，并命名为 L929/cyCD 123、Colon_26/cyCD123、L929/rhCD123 和 Colon_26/rhCD123。实施例2制备IL-3Rα细胞外区域的可溶形式(制备人类IL-3Rα细胞外区域表达载体的可溶形式)通过PCR方法扩增编码人类IL-3R α细胞外区域的cDNA，并将FLAG标签连接到它的下游。具体来说，使用pEF6/Myc-His/hCD123质粒DNA作为模板，使用Platinum Pfu聚合酶anvitrogen)，通过PCR扩增编码人类IL-3Ra细胞外区域的cDNA。对于PCR来说， 在96°C 2分钟的变性步骤后，将96°C 20秒_55°C 30秒_68°C 65秒的三步反应执行30个循环。所使用的引物是IL-3R a -Fw和下列引物。hIL-3Ra sol-FLAG-Notl 5’ -ATTGCGGCCGCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAGTCCCGCCAGGCACGTGTGTTTG-3， (SEQ ID NO 13)对由此获得的PCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。 DNA通过溴乙锭染色进行可视化。将DNA用JetSorb (Genomed)提取。将如此纯化的DNA用 MfeI和NotI消化，并再次进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。切下约1. Okb的条带，并用JetSorb (Genomed)提取。将获得的DNA和已用与纯化DNA相同的切开的pTracer-CMV/Bsd载体混合，并使用TaKaRa连接试剂盒进行连接。对于转化来说，将连接样品与DHlOB感受态细胞混合，铺于LB平板(含氨苄青霉素)上。使用LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，通过直接菌落PCR进行插入检查。对于PCR来说，在95 °C 1分钟的变性步骤后，将95°C 15秒-56°C 15秒_72°C 40秒的三步反应执行35个循环，然后执行72°C 2 分钟的延伸反应。所用的PCR引物是IL-3Ra -Fw和IL_3Ra sol-FLAG-Notl。对由此获得的PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。通过Minipr印方法从其中获得了约1.01Λ扩增产物的菌落提取质粒DNA。通过DNA序列分析发现纯化的质粒DNA具有与GenBank登记号NP-002174. 1的相应区域同一的序列。插入片段的序列(MfeI至NotI)如下。CAATTGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCACGCTGCTCCTGATCGCCCTGCCCTGTCTCCTGCAAACGAAGGAAGATCCAAACCCACCAATCACGA ACCTAAGGATGAAAGCAAAGGCTCAGCAGTTGACCTGGGACCTTAACAGAAATGTGACCGATATCGAGTGTGTTAAAGACGCCGACTATTCTATGCCGGCAGTGAACAATAGCTATTGCCAGTTTGGAGCAATTTCCTTATGTGAAGTGACCAACTACACCGTCCGAGTGGCCAACCCACCATTCTCCACGTGGATCCTCTTCCCTGAGAACAGTGG
GAAGCCTTGGGCAGGTGCGGAGAATCTGACCTGCTGGATTCATGACGTGGATTTCTTGAGCTGCAGCTGGGCGGTAGGCCCGGGGGCCCCCGCGGACGTCCAGTACGACCTGTACTTGAACGTTGCCAACAGGCGTCAACAGTACGAGTGTCTTCACTACAAAACGGATGCTCAGGGAACACGTATCGGGTGTCGTTTCGATGACATCTCTCGACTCTCCAGCGGTTCTCAAAGTTCCCACATCCTGGTGCGGGGCAGGAGCGCAGCCTTCGGTATCCCCTGCACAGATAAGTTTGTCGTCTTTTCACAGATTGAGATATTAACTCCACCCAACATGACTGCAAAGTGTAATAAGACACATTCCTTTATGCACTGGAAAATGAGAAGTCATTTCAATCGCAAATTTCGCTATGAGCTTCAGATACAAAAGAGAATGCAGCCTGTAATCACAGAACAGGTCAGAGACAGAACCTCCTTCCAGCTACTCAATCCTGGAACGTACACAGTACAAATAAGAGCCCGGGAAAGAGTGTATGAATTCTTGAGCGCCTGGAGCACCCCCCAGCGCTTCGAGTGCGACCAGGAGGAGGGCGCAAACACACGTGCCTGGCGGGACTACAAGGATGACGACGATAAGTGAGCGGCCGC(SEQ ID NO 14)(可溶形式的人类IL-3RCI蛋白的制备)使用QIAGEN质粒大提试剂盒纯化含有可溶形式IL-3R α序列的pTracer CMV表达载体的质粒DNA。使用CHOrasl细胞作为用于表达的宿主细胞。CHOrasl细胞使用SFMII 培养基(Invitrogen)振摇培养(37°C，5% CO2)。在基因导入中使用PEI方法。将MW 25，000的直链聚乙烯亚胺(Polysciences) 称重并溶解在PBS中，同时用HCl调整到pH7. 0左右(lg/Ι)。将获得的溶液搅拌1小时，然后通过经孔径为0. 22 μ m的膜滤器MILLEX-GV (Millipore)过滤进行除菌。然后将Img纯化的质粒DNA与20ml Opti-Pro SFM(Invitrogen)混合以获得溶液Α。通过将2. 5ml PEI 溶液(lg/D与20ml Opti-Pro SFM(Invitrogen)混合，制备了溶液B。在将溶液A和溶液 B混合后，将其静置10分钟，并将获得的溶液加入到CHOrasl细胞(每Iml 1，000, 000个细胞)中。6天后，回收细胞上清液并用于蛋白纯化。可溶形式人类IL-3RCI蛋白的纯化通过下列方法进行。在基因导入后6天通过离心回收含有可溶形式IL-3Ra蛋白的培养上清液，并通过滤器。将获得的溶液用Tris缓冲的盐水(TBQ稀释5倍，使用抗FLAGM2琼脂糖亲和凝胶(Sigma)制备抗FLAG柱，并使用 HiLoad泵P-50 (Pharmacia Biotech)向其施加溶液。使用FLAG肽(Sigma)并按照手册进行洗脱。将洗脱液分级成几个级分，将每个级分在还原条件下进行SDS-PAGE(MultiGel II Mini 10/20%梯度胶；Cosmo Bio Co.，Ltd.)，然后进行银染和Western印迹。银染使用银染试剂“Daiichi” (Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd·)。将抗 FLAG M2 抗体(Sigma)禾口碱性磷酸酶标记的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体用于Western印迹。将其中发现了目标蛋白的级分使用 Amicon Ultra_410K (Millipore)浓缩，并使用 Superdex 200gp (GE Healthcare) 进行凝胶过滤层析。在分级后，将每个级分在还原条件下进行SDS-PAGE (MultiGel II Mini 10/20%梯度胶；Cosmo Bio Co.，Ltd.)，然后进行银染和flfestern印迹。银染使用银染试剂“Daiichi” (Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd·)。将抗 FLAG M2 抗体(Sigma)和碱性磷酸酶标记的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体用于Western印迹。将其中发现了目标蛋白的级分使用Amicon Ultra_410K(Millipore)浓缩，并用PBS洗涤。通过使用孔径为0. 22 μ m的膜滤器MILLEX-GV(Millipore)过滤来进行除菌，获得了可溶形式的人类IL-3Rα蛋白。作为使用 Limulus ES-II Kit Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)进行 Limulus 试验的结果，没有检测到内毒素。对于可溶形式的人类IL-3Ra蛋白的浓度来说，测量^Onm 处的吸光度，并将lmg/ml计算为1. 40D。实施例3使用产人类抗体的小鼠制备抗人类IL-3RCI人类抗体(产人类抗体的小鼠)在免疫接种中使用的小鼠具有内源Ig重链和κ轻链破坏两者的纯合的遗传背景，并且还同时保持含有人类Ig重链基因座(SC20)和人类Ig κ链转入基因(KCc^)的第 14号染色体片段。该小鼠通过将具有人类Ig重链基因座的株系A小鼠与具有人类Ig κ 链转入基因的株系B小鼠进行杂交来制备。株系A对内源Ig重链和κ轻链破坏两者是纯合的，是维持了可以传递给后代的第14号染色体片段(SC20)的小鼠株系，并描述在例如 Tomizuka 等的报道中[iTomizuka 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97 :722]。株系 B 也对内源Ig重链和κ轻链破坏两者是纯合的，是维持了人类Ig κ链转基因(KCc^)的小鼠株系(转基因小鼠)，并描述在例如Fishwild等的报道中[Nat. Biotechnol (1996) ,114 845]。 在下面的免疫试验中使用了通过株系A雄性小鼠与株系B雌性小鼠的杂交或株系 A雌性小鼠与株系B雄性小鼠的杂交获得的在血清中同时检测到人类Ig重链和κ轻链的个体[Ishida&Lonberg，IBC' sll' Antibody Engineering，摘要 2000]。就此而言，上面提到的产人类抗体的小鼠(被称为KM小鼠)，可以通过订立合同从Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.获得。(针对人类IL-3Rα的人类单克隆抗体的制备)对于本实施例中单克隆抗体的制备来说，它按照在《单克隆抗体实验操作指南》 (A Guide to Monoclonal Antibody Experimental Operations)(用日文书写)(由 Tamie Ando等主编，Kodansha出版，1991)等中描述的通用方法来制备。对于IL_3Ra来说，作为免疫原，使用了表达IL-3Ra的细胞(CCL-1，ATCC)、表达IL-3Ra的Colon-26 细胞(Tohoku大学发育、衰老和癌症研究所生物医学研究细胞资源中心(Cell Resource Center for Biomedical Research Institute of Development，Aging and Cancer Tohoku University)或可溶形式的人类IL_3R α Fc融合蛋白。作为待免疫的动物，使用了上面提到的KM小鼠。为了制备针对人类IL-3RCI的人类单克隆抗体，将KM小鼠用实施例1中制备的表达IL-3R α的细胞或表达IL-3R α的Colon-沈细胞，以每1周至2周每只动物IxlO7 个细胞的剂量进行腹膜内免疫接种，总共接种4次。在如下所述提取脾脏前三天，通过尾静
33脉向每只小鼠个体给药20 μ g可溶形式的人类IL-3R α蛋白。在从被免疫小鼠通过手术获得脾脏后，将脾脏放入PBS中，并使用注射器活塞将其在筛网(细胞滤网，FALCON)上切碎。在将细胞悬液通过筛网并离心后，将获得的沉淀细胞重悬浮在红细胞裂解缓冲液(Sigma)中。在室温下温育5分钟后，向其加入含有350mg/ ml碳酸氢钠、50单位/ml青霉素和50 μ g/ml链霉素的无血清DMEM培养基(Invitrogen) (在后文中称为“无血清DMEM培养基”)以沉淀细胞。通过再次悬浮在无血清DMEM培养基中，测量细胞数量。另一方面，使用含有10 % FCS(Invitrogen)、50单位/ml青霉素和50 μ g/ml链霉素的DMEM培养基(Invitrogen)(在后文中称为“含血清DMEM培养基”)，在37 °C下， 在5%二氧化碳存在下培养骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC No. CRL-1581)。将SP2/0细胞用无血清DMEM培养基清洗。采用同样方式，将细胞悬浮在无血清DMEM培养基中以测量细胞数量。在将回收的源自脾脏的细胞悬液与小鼠骨髓瘤悬液以5 1的细胞数量比例混合后，将混合的悬液离心，然后完全移除上清液。作为融合试剂，将50% (w/v)聚乙二醇 1500 (Boehringer-Mannheim)缓慢加入到获得的细胞沉淀中，同时用移液器头搅拌沉淀，然后向其缓慢加入预先加热到37°C的无血清DMEM培养基。此外，向其缓慢加入适量的无血清DMEM培养基。然后将获得的溶液在5%二氧化碳存在下在37°C下静置5分钟。在离心后，除去上清液，并将由此获得的融合细胞悬浮在含有10% FCSanvitrogen)、青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Sigma)、IL-6 (5ng/ml)和2-巯基乙醇(Invitrogen)的DMEM培养基 (Invitrogen)中(在后文中称为“含IL-6的DMEM培养基”)，并在5%二氧化碳存在下在 37°C下培养。第二天，通过吸取回收细胞并通过离心进行沉淀。将获得的细胞沉淀重新悬浮在含有IL-6的DMEM培养基中。将悬浮的细胞在96孔板上进行有限稀释，并培养约7天至14天。将培养上清液用于下面的实施例中描述的杂交瘤筛选。(筛选产生与人类IL-3Rα结合的人类单克隆抗体的杂交瘤)杂交瘤的筛选使用在上述实施例中制备的细胞上清液来进行。简而言之，方法通过流式细胞术来进行，其中使用了稳定表达人类IL-3RCI的细胞。具体来说，将表达人类IL-3R α的细胞与亲代细胞系细胞的组合或表达人类IL-3R α的Colon-沈细胞与亲代细胞系Colon-沈细胞的组合，与杂交瘤的上清液混合，并将其在4°C下静置30分钟。在将获得的细胞用染色培养基(Dulbecco的PBS，含有 2%胎牛血清、2mM EDTA.0. 05% NaN3)清洗两次后，向其加入作为第二抗体的山羊F(ab，)2 抗人类IgG-PE(Southern Biotech)，并将其在4°C下静置30分钟。在用染色培养基清洗两次后，将获得的细胞通过FACSCalibur (BD Biosciences)进行分析。收集只与表达人类 IL-3Ra的细胞反应的杂交瘤。将所选的杂交瘤进行有限稀释，并使用其培养上清液进行筛选。具体来说，将每个表达人类IL-3Rci的细胞和亲代细胞系细胞与杂交瘤的上清液混合，并将其在 4°C下静置30分钟。在用染色培养基清洗两次后，向其加入作为第二抗体的山羊F(ab’ )2 抗人类κ-PE (Dako)，并将其在4°C下静置30分钟。在用染色培养基清洗两次后，将细胞通过FACSCalibur (BD Biosciences)进行分析。收集只与表达人类IL-3R α的细胞反应的杂交瘤。实施例4重组抗人类IL-3R α人类抗体的制备
(从杂交瘤获得抗人类IL-3Rα人类抗体基因和表达载体的制备)从实施例3中获得的杂交瘤，使用含lOng/ml IL-6 (R&DSystems)和10%胎牛血清(SIGMA)的 eRDF 培养基(Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co. , Ltd·)，对克隆名 01d4、01d5、01dl7、01dl9、Newl02和01d6进行培养，然后通过离心收集细胞。然后向获得的细胞加入TRIZOL (GIBCO)，并按照说明书提取总RNA。抗体可变区cDNA的克隆，使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)按照其随附的说明书来进行。此外，从产生抗人类IL-3Ra小鼠抗体7G3的杂交瘤ATCC，HB12009克隆可变区，并用作对照。通过将如此获得的cDNA与编码人类IgGl恒定区的DNA相连，制备了嵌合抗体表达载体。具体来说，从低温保存的杂交瘤通过离心收集细胞，然后向其加入 TRIZOL(GIB⑶)，按照说明书提取总RNA。抗体可变区cDNA的克隆使用小鼠IgG抗体特异性引物以及SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)，按照其随附的说明书来进行。使用5 μ g总RNA作为模板，制备了第一链cDNA。1)第一链cDNA的合成总 RNA 5 μ gm/3 μ L5，CDS 1 μ LSMART 寡聚物 1 μ L在将包含上述组分的反应混合物在72°C下温育2分钟后，向反应混合物加入5x 缓冲液 2yLDTT 1 μ LDNTP 混合物 1 μ L 禾口SuperscriptII 1 μ L并在42 °C下温育1. 5小时。向获得的混合物进一步加入100 μ 1 Tricine缓冲液，并在72°C下温育7分钟。2)通过PCR扩增重链基因和轻链基因并构建重组抗体表达载体为了扩增cDNA，使用了由Takara公司制造的Ζ-Taq。cDNA 2μ LIOxZ-Taq 缓冲液 5 μ LdNTP 混合物 4yLZ-Taq 1 μ L引物1引物2使用重蒸水将包含上面提到的组分的反应溶液调整到50 μ 1的终体积，以进行 PCR。为了扩增重链，使用UPM(SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由Clonetech公司制造) 和 hh-6 引物(5，-GGTCCGGGAGATCATGAGGGTGTCCTT-3，) (SEQ ID NO 15)，并将 98 °C 1 秒和68°C 30秒的反应循环重复30次。此外，使用1 μ 1获得的反应溶液作为模板，并使用 NUP (SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由 Clonetech 制造)和 hh_3 引物(5，-GTGCACGCCGCTGGT CAGGGCGCCTG-3，) (SEQ ID NO 16)作为引物，将98°C 1秒和68°C 30秒的反应循环重复20 次。然后使用PCR纯化试剂盒01IAGEN)纯化扩增的PCR产物，并使用hh-4 (5’-GGT GCC
35AGGGGG AAG ACC GAT GG_3’)(SEQ ID NO 17)作为引物测定核苷酸序列。根据序列信息合成了下列特异性引物，并也使用下列引物从相反方向测定了序列。01d4重链特异性引物Fw(5，-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGT-3，) (SEQ ID NO 18)01d4重链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3，) (SEQ ID NO 19)01d5重链特异性引物Fw(5，-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCT TTGT-3，) (SEQIDN0 20)01d5重链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3，) (SEQ ID NO 21)01dl7重链特异性引物Fw(5‘-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCT TTGT-3，)(SEQ ID NO 22)01dl7重链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACAAGGGTTCCC-3，) (SEQ ID NO 23)01dl9重链特异性引物Fw(5‘-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCT TTGT-3，)(SEQ ID NO 24)01dl9重链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTC-3，) (SEQ ID NO 25)Newl02重链特异性引物Fw(5，-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGT-3，) (SEQ ID NO 26)Newl02重链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT-3，) (SEQ ID NO 27)01d6重链特异性引物Fw(5，-AGAGAGAGAGGTCGACCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTG-3，) (SEQ ID NO 28)01d6重链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTC-3，) (SEQ ID NO 29) 为了扩增小鼠抗体7G3的重链，使用UPM (SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由 Clontech 公司制造)和mH-Rvl 引物(5，-ATTTTG TCGACC KYG GTS YTG CTG GCY GGGTG-3，) (SEQ ID NO 30)，并将98°C 1秒和68°C 30秒的反应循环重复30次。此外，使用1 μ 1获得的反应溶液作为模板，并使用NUP (SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由Clontech制造)和 mH-Rv2 引物(5，-GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3，) (SEQ ID NO :31)，将 98°C 1 秒和 680C 30秒的反应循环重复20次。然后使用PCR纯化试剂盒OiIAGEN)纯化扩增的PCR产物，并使用mH-Rv2引物(SEQ ID NO 31)作为引物的定重链可变区的核苷酸序列。根据序列信息合成了下列特异性引物，并也使用下列引物从相反方向测定了序列。7G3重链特异性引物Fw(5，-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTC-3，) (SEQ ID NO 32)7G3重链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3，) (SEQ ID NO 33)使用上面提到的特异性引物进行PCR(98°C 1秒，60°C 30秒，72°C 30秒)，并将重链扩增cDNA片段用Mil和NheI消化，插入到已用相同酶切开的N5KGl_Val Lark载体[N5KG1 的修饰的载体(US6，001，358，Idec Pharmaceuticals)]中。通过使用载体作为模板测定序列，发现插入的序列与通过直接测序测定的序列同一。轻链的扩增使用UPM(SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由Clontech公司制造)禾口 hk-2 引物(5，-GTT GAAGCT CTT TGT GAC GGGCGA GC-3，) (SEQ ID NO :34)，并将 98°C 1 秒和 680C 30秒的反应循环重复30次。此外，使用1 μ 1该溶液作为模板，并使用NUP (SMARTRACE cDNA扩增试剂盒；由 Clonetech 制造)和 hk-6(5，-TGGCGGGAAGATG AAG ACA GAT GGT G-3，) (SEQ IDNO :35)，将98°C 1秒和68°C 30秒的反应循环重复20次。然后使用PCR纯化试剂盒OiIAGEN)纯化扩增的PCR产物，并使用hk-6引物测定核苷酸序列。根据序列信息合成了下列特异性引物，并也从相反方向测定了序列。01d4轻链特异性引物Fw(5，-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGC-3，) (SEQ ID NO 36)01d4轻链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTG-3，) (SEQ ID NO 37)01d5轻链特异性引物Fw(5‘-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCG CTC AGC-3，)(SEQ ID NO 38)01d5轻链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTG-3，) (SEQ ID NO 39)01dl7轻链特异性引物Fw(5，-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCG CTC AG-3，) (SEQ ID NO 40)01dl7轻链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCT G_3，) (SEQ ID NO 41)01dl9轻链特异性引物Fw(5，-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCG CTC AG-3，) (SEQ ID NO 42)01dl9轻链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTT GGC-3，) (SEQ ID NO 43)Newl02轻链特异性引物Fw(5，-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCG CTC AG-3，) (SEQIDN0 44)Newl02轻链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGG TCCCCT G_3，) (SEQ ID NO 45)01d6轻链特异性引物Fw(5 ‘-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGC-3，)(SEQ ID NO 46)01d6轻链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC-3，) (SEQ ID NO 47)小鼠抗体7G3的轻链使用UPM (SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由Clontech公司制造)JPmK-Rvl 引物 mK Rvl (5，-TT GAA GCTCTT GAC AAT GGG TGA AGT TGAT-3，) (SEQ ID NO 48)扩增，并将98°C 1秒和68°C 30秒的反应循环重复30次。此外，使用1 μ 1该反应溶液作为模板，并使用NUP (SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由Clontech制造)和mK-Rv2 (5，-GTAGGTGCTGTCTTTGCTGTCCTGATCAGT-3，) (SEQ ID NO :49)，将 98°C 1 秒和 68°C 30 秒的反应循环重复20次。然后使用PCR纯化试剂盒^IAGEN)纯化扩增的PCR产物，并使用mK-Rv2 引物测定核苷酸序列。根据序列信息合成了下列特异性引物，并也从相反方向测定了序列。7G3轻链特异性引物Fw(5 ‘-AGAGAGAGAGAGATCTCACCATGGAATCACAGACTCAGGTCCTC-3，)(SEQIDN0 50)7G3轻链特异性引物Rv(5，-AGAGAGAGAGCGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC-3，) (SEQ ID NO 51)使用上面提到的特异性引物进行PCR(98°C 1秒，60°C 30秒，72°C 30秒)，并将轻链扩增cDNA片段用BglII和BsiWI消化，插入到已用相同酶切开的N5KGl_Val Lark载体中。通过使用载体作为模板测定序列，发现插入的序列与通过直接测序测定的序列同一。下面显示了每个编码01d4的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。<01d4重链可变区>GACCCGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGCT ACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCATGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCACCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTATAGTAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGTACAGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAGGGGGGGGCTCGGGCCCAGATGTTCTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCTAGCACCAA(SEQ ID NO 52)<01d4重链可变区>MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLLQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSTYAI
SffVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIVNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGSGPDVLDIffGQGTMVTVSSASTX(SEQ ID NO 53)重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 52的5，端起第16位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第432位的腺嘌呤(A) 与第433位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID NO :53的 N-端起第139位的丝氨酸⑶残基，恒定区从第140位的丙氨酸㈧开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID N0:53的N-端起第 19位的丝氨酸⑶。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO 53的第20位的谷氨酰胺(Q)。<01d4轻链可变区>CACAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGTCATCTGGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGATGAGTCAGGGCATTAGGAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTGAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCT
GCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTSCTGTCAACAGTATTSTSGTTTCCCGTA
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CACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGG(SEQ ID NO :54)<01d4轻链可变区>MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCVIWMTQSPSLLSASTCDRVTISCRMSQGIRSYLAWYQQKPGKAPELLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFATYYCQQYYSFPYTFGQGTKLEIKRTVX(SEQ ID NO :55)轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 54的5，端起第16位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第402位的腺嘌呤(A) 与第403位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID NO :55的 N-端起第1 位的赖氨酸⑷残基，恒定区从第130位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID N0:55的N-端起第 22位的半胱氨酸(C)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO 55的第23位的缬氨酸(V)。下面显示了每个编码01d5的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。<01d5重链可变区>GTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCT
ACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCATGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCACCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGCTCATCCCTATCTTTGATATAGAAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGTCTATATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGAGAGGGGGGGGTTCGGGCCCTGATGTTCTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCTAGC(SEQ ID NO 56)<01d5重链可变区>MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYAI
SWVRQAPGQGLEWMGGLIPIFDIENYYAQKFQGRVTITADESTSTVYMELSSLRSEDTAMYYCARGGGSGPDVLDIffGQGTMVTVSSAS(SEQ ID NO 57)重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 56的5，端起第16位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第427位的腺嘌呤(A) 与第4 位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID N0:57的 N-端起第139位的丝氨酸⑶残基，恒定区从第140位的丙氨酸㈧开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID N0:57的N-端起第 19位的丝氨酸⑶。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO 57的第20位的谷氨酰胺(Q)。<01d5轻链可变区〉CACAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGTCATCTGGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGATGAGTCAGGGCATTAGGAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTGAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAA
GGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCT
GCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTTTCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGG(SEQ ID NO :58)<01d5轻链可变区>MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCVIWMTQSPSLLSASTCDRVTISCRMSQGIRSYLAWYQQKPGKAPELLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFATYYCQQYYSFPYTFGQGTKLEIKRTVX(SEQ ID NO :59)轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 58的5，端起第16位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第402位的腺嘌呤(A) 与第403位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID NO :59的 N-端起第1 位的赖氨酸⑷残基，恒定区从第130位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID N0:59的N-端起第 22位的半胱氨酸(C)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO 59的第23位的缬氨酸(V)。下面显示了每个编码01dl7的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。<01dl7重链可变区>GACCCGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAG
CAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGACTTCTGGAGGCACCTTCAGCAACTTTGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTTCAACAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTAACGCGGACGGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGTCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGGGTGGAGACAAATATGGTCCTTACTACTTTCACTACTGGGGCCAGGGAACCCTTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC(SEQ ID NO 60)<01dl7重链可变区>MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGGTFSNFAI
SffVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGSTNYAQKFQGRVTINADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGGDKYGPYYFHYWGQGTLVTVSSAS(SEQ ID NO :61)重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 60的5，端起第16位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第432位的腺嘌呤(A) 与第433位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID NO 61的 N-端起第139位的丝氨酸⑶残基，恒定区从第140位的丙氨酸㈧开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID N0:61的N-端起第 19位的丝氨酸⑶。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO 61的第20位的谷氨酰胺(Q)。<01dl7轻链可变区>AGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGTG ACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTC
AGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA
GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTACCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGT(SEQ ID NO :62)<01dl7轻链可变区>MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSffLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIKRTX(SEQ ID NO :63)轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 62的5，端起第19位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第399位的腺嘌呤(A) 与第400位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID N0:63的 N-端起第1 位的赖氨酸⑷残基，恒定区从第130位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID N0:63的N-端起
第22位的半胱氨酸(C)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO 63的第23位的天冬氨酸 ⑶。下面显示了每个编码01dl9的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。<01dl9重链可变区>TCGACCCCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGG
ACACAAATATGGCCCCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTC
ACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAG(SEQ ID NO 64)<01dl9重链可变区>MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAI
SffVRQAPGQGLEffVGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGHKYGPYYFDYWGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO :65)重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 64的5，端起第9位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第425位的腺嘌呤(A) 与第似6位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID N0:65的 N-端起第139位的丝氨酸⑶残基，恒定区从第140位的丙氨酸㈧开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID N0:65的N-端起第 19位的丝氨酸⑶。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO 65的第20位的谷氨酰胺(Q)。<01dl9轻链可变区>
AGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA
GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTACCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCT(SEQ ID NO :66)<01dl9轻链可变区>MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSffLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPRTFGQGTKVEIKRTVA(SEQ ID NO :67)轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 66的5，端起第13位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第399位的腺嘌呤(A) 与第400位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID N0:67的 N-端起第1 位的赖氨酸⑷残基，恒定区从第130位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID N0:67的N-端起
第22位的半胱氨酸(C)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO 67的第23位的天冬氨酸 ⑶。下面显示了每个编码Newl02的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。<Newl02重链可变区>TCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGATCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCATGGCTTCAGGAGGCACCGTCAGCAGCTACGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGAGATCATCCCTATCTTTGGTATAGTAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCATATATTACTGTGCGAGAGAGACAGCAGTGGCTGGTATTCTTGGTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAG(SEQ ID NO 68)<Newl02重链可变区>MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCMASGGTVSSYA
ISWVRQAPGQGLEWMGEIIPIFGIVNYAQKFQGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAIYYCARETAVAGILGYWGQGTLVTVSSASTK (SEQ ID NO 69)重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 68的5，端起第9位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第423位的腺嘌呤(A) 与第似4位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID N0:69的 N-端起第138位的丝氨酸( 残基，恒定区从第139位的丙氨酸(A)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID N0:69的N-端起第 19位的丝氨酸⑶。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO 69的第20位的谷氨酰胺(Q)。<Newl02轻链可变区>AGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTACCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCA(SEQ ID NO :70)<Newl02轻链可变区>MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSffLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIKRTVAA(SEQ ID NO 71)轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 70的5，端起第13位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第399位的腺嘌呤(A) 与第400位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID N0:71的 N-端起第1 位的赖氨酸⑷残基，恒定区从第130位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID N0:71的N-端起
第22位的半胱氨酸(C)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO 71的第23位的天冬氨酸 ⑶。下面显示了每个编码01d6的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。<01d6重链可变区〉CGACCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGA
AGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCCATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATATTATGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAAACGCCAAGAACTCA CTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGACTGGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC (SEQ ID NO 72)<01d6重链可变区>MELGLRWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSHNMN
WVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREDWGYFDYWGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO :73)重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 72的5，端起第10位的
43腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第417位的腺嘌呤(A) 与第418位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID NO :73的 N-端起第136位的丝氨酸(S)残基，恒定区从第137位的丙氨酸(A)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID N0:73的N-端起第19位的丝氨酸⑶。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO 73的第20位的谷氨酸(E)。<01d6轻链可变区>AGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA
GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGGT(SEO ID NO :74)<01d6轻链可变区>MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQGISSDLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPFTFGPGTKVDIKRTVAA(SEQ ID NO 75)轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 74的5，端起第13位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第399位的腺嘌呤(A) 与第400位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID N0:75的 N-端起第1 位的赖氨酸⑷残基，恒定区从第130位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID N0:75的N-端起第 23位的半胱氨酸(C)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO 75的第M位的丙氨酸㈧。下面显示了每个编码7G3的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。<7G3重链可变区>GTCGACCACCATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTTCTCGTGTCAGGAACT
GGAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTAAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTACTACATGAAGTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTATTCCTAGCAATGGTGCCACTTTCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTTTGACTGTGGACAGATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTACAAGATCGCATTTACTGCGGGCCTCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTAGC(SEQ ID NO 76)<7G3重链可变区>MGWSWIFLFLVSGTGGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYY
MKWVKQSHGKSLEWI⑶IIPSNGATFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLT
SEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSAAS(SEQ ID NO :77)重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 76的5，端起第16位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第427位的腺嘌呤(A) 与第4 位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID N0:77的 N-端起第139位的丙氨酸㈧残基，恒定区从第140位的丙氨酸㈧开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID N0:77的N-端起第19位的丝氨酸⑶。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO ,11的第20位的谷氨酸(E)。<7G3轻链可变区>AGATCTCACCATGGAATCACAGACTCAGGTCCTCATGTCCCTGCTGTTCTGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACTTTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCTAGTCAGAGTCTGCAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTATCTGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAATTGTTGATCTATTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCA
GCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGT(SEQ IDNO :78)<7G3轻链可变区>MESQTQVLMSLLFWVSGTCGDFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO 79)轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO 78的5，端起第11位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第409位的腺嘌呤(A) 与第410位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID N0:79的 N-端起第133位的赖氨酸(K)残基，恒定区从第134位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver. 2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID N0:79的N-端起第 22位的甘氨酸(G)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO 79的第23位的天冬氨酸⑶。(重组类型抗体的制备)通过将每个构建的6个重组抗体表达载体导入宿主细胞，制备了表达重组抗体的细胞。HEK293Fanvitrogen)被用作用于表达的宿主细胞。使用293Fectin (Invitrogen)将每个表达载体导入 HEK293F。将 HEI^93F 在 5 % CO2和37°C的条件下使用摇床进行培养，并在培养后约5天回收培养上清液。将回收的培养上清液使用rpm蛋白A(Amersham-Pharmacia Biotech)进行亲和纯化。使用PBS作为吸附缓冲液，0. 02M甘氨酸缓冲液(pro)作为洗脱缓冲液，根据用于纯化的量使用0. 8x40cm柱子(Bio-Rad Laboratories)等。通过加入IM Tris (pH9. 0)将洗脱级分调整到约pH 7.2。 使用透析膜(截留分子量10，000，Spectrum Laboratories)将如此制备的抗体溶液更换成 PBS,并使用孔径为0. 22 μ m的膜滤器MILLEX-GV (Millipore)通过过滤进行除菌，由此获得纯化的人类抗IL-3Rci单克隆抗体。通过在280nm处测量吸光值并将lmg/ml视为1. 40D 来计算纯化抗体的浓度。每个人类抗体⑶R(补性决定区)的氨基酸序列和SEQ ID NOs的概述显示在表1
4权利要求
1.一种针对人类IL-3Ra链的抗体，所述抗体不抑制IL-3信号传导并与人类IL-3Ra 链的B结构域结合，但是不结合人类IL-3Ra链的C结构域。
2.权利要求1的抗体，其进一步具有高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
3.权利要求1或2的抗体，其中通过使用用IL-2培养的PBMC的Colonj6/hCD123ADCC 测定法，高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)在0.01yg/ml的抗体浓度下显示出10%的特异的裂解率。
4.权利要求1至3任一项的抗体，其包含选自下列(a)至(e)的重链CDR和轻链CDR 的氨基酸序列(a)重链的⑶R1至3分别为SEQ ID NO :113至115的氨基酸序列，轻链的⑶R 1至3 分别为SEQ ID NO :131至133的氨基酸序列，(b)重链的⑶R1至3分别为SEQ ID NO :116至118的氨基酸序列，轻链的⑶R 1至3 分别为SEQ ID NO :134至136的氨基酸序列，(c)重链的⑶R1至3分别为SEQ ID NO :119至121的氨基酸序列，轻链的⑶R 1至3 分别为SEQ ID NO :137至139的氨基酸序列，(d)重链的⑶R1至3分别为SEQ ID NO :122至124的氨基酸序列，轻链的⑶R 1至3 分别为SEQ ID NO 140至142的氨基酸序列，以及(e)重链的⑶R1至3分别为SEQ ID NO :125至127的氨基酸序列，轻链的⑶R 1至3 分别为SEQ ID NO 143至145的氨基酸序列。
5.权利要求1至4任一项的抗体，其包含选自下列(a)至(f)的重链可变区和轻链可变区(a)包含SEQID NO 53的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸⑶的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 55的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V)至 1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；(b)包含SEQID NO 57的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸⑶的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 59的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V)至 1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；(c)包含SEQID NO 61的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸⑶的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 63的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D) 至1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；(d)包含SEQID NO 65的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸⑶的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 67的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D) 至1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；(e)包含SEQID NO 69的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至138位丝氨酸⑶的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 71的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D) 至1 位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；以及(f)重链可变区和/或轻链可变区，其包含在上述(a)至(e)所显示的重链可变区和/ 或轻链可变区中缺失、取代、添加或插入1至3个氨基酸残基的氨基酸序列。
6.一种用于预防或治疗血液肿瘤的组合物，在所述血液肿瘤中在对象的骨髓或外周血中发现了表达IL-3Rci的细胞，所述组合物包含权利要求1至5任一项的IL-3Rci抗体作为活性成分。
7.一种用于治疗血液肿瘤的方法，在所述血液肿瘤中在骨髓或外周血中发现了表达 IL-3Ra的细胞，所述方法包含向对象给药包含权利要求1至5任一项的IL-3R α抗体作为活性成分的组合物。
8.一种用于检测血液肿瘤的组合物，在所述血液肿瘤中在来自对象的生物样品的骨髓或外周血中发现了表达IL-3R α的细胞，所述组合物包含权利要求1至5任一项的IL-3R α 抗体。
9.权利要求1至5任一项的组合物或方法，其中血液肿瘤是急性骨髓性白血病(AML)。
全文摘要
本申请提供了针对人类IL-3Rα链的抗体，其不抑制IL-3信号传导并与人类IL-3Rα链的B结构域结合，但是不结合人类IL-3Rα链的C结构域；用于预防或治疗血液肿瘤的组合物，在所述血液肿瘤中在对象的骨髓或外周血中发现了表达IL-3Rα的细胞，所述组合物的特征在于包含人类IL-3Rα抗体作为活性成分；以及用于治疗血液肿瘤的方法，在所述血液肿瘤中在骨髓或外周血中发现了表达IL-3Rα的细胞，所述方法的特征在于包含向对象给药包含人类IL-3Rα抗体作为活性成分的组合物。
文档编号C12N15/09GK102459342SQ20108002738
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月27日 优先权日2009年4月27日
发明者俵知纪, 稻垣好昌, 高柳晋一郎 申请人:协和发酵麒麟株式会社