专利名称：用于分离生物或化学靶标的装置和方法
用于分离生物或化学靶标的装置和方法
技术领域：
本发明涉及在取得液体样品的基础上对生物或化学靶标进行检测的领域。
更特别地，本发明的一个目的是满足这样的需要，即收集和/或浓缩生物或化学靶标，从而将其用于检测样品(例如河水、家用和饮用水供应网中冷却塔中的流体等)中不期望成分(如病原性微生物或化学污染物)的情形中。生物或化学靶标在样品中可以以很少的量存在，因而仅在取得大体积(大于50ml)时才可以进行检测。
术语“生物或化学靶标”旨在表示微生物，即包膜或无包膜病毒、革兰氏阳性和革兰氏阴性营养体细菌(vegetative bacteria)、芽孢形式的细菌、原生动物、微观真菌和酵母、微观浮游生物、花粉、动物细胞和植物细胞；其还旨在表示化学分子(肥料、药物、污染物化学分子如化学工业的副产物、植物检疫产物等)或生物分子(抗原、蛋白质、激素或内分泌系统干扰化合物等)。
使用功能化磁珠(即在其表面具有能与期望靶标结合之分子的磁珠)作为分离和 /或检测生物或化学靶标的捕获系统是已知技术，并且已经描述了用磁珠捕获靶标的多种方法；的确，使用功能化磁珠的优势是它们有大的捕获表面积，以及它们可以用磁体容易地回收并且任选地在洗脱所捕获靶标后重新使用。
特别地，专利申请US 2003/015028描述了一种特异性不很高的微生物捕获方法， 其使用连接有所述微生物的营养物(尤其是碳水化合物)的固体支持物；该固体支持物优选为磁珠。该方法作用的发挥在于选择用于捕获微生物的营养物。
专利申请US 2006/0141450描述了捕获存在于生理来源样品中的细胞、细胞器或病毒的方法，其利用了磁珠的特异性不很高的顺磁吸附特性。
上述方法旨在处理体积约Iml的样品；它们不适于处理体积大于50ml的样品。
国际申请WO 2008/1315M描述了适于用食物样品检测病原微生物的装置；该装置包含500ml的Erlenmeyer烧瓶，其放置在配置了磁场的搅拌支持物上。该装置的使用提供了在适于目的微生物生长的选择培养基中培养样品的起始步骤；然后，通过磁颗粒捕获这些微生物，所述磁颗粒上具有与目的微生物结合的移植抗体。这种非常特异的检测微生物的方法通过培养步骤解决了样品中生物靶标量少的问题，使得可以扩增目的微生物从而便于其检测。尽管可适于处理体积为几十毫升的样品，但由于产生了如何使磁珠在样品中分散良好的问题，其应用仍在样品体积方面受限制；最后，这样的装置难以自动化；它不允许依次处理几个样品。
专利申请US 2005/0013741中描述的用于搅拌和分离磁珠的装置有相同的局限； 该装置在包含磁珠的容器两侧放置的两个永磁体；这些磁体可以垂直移动；根据对其进行的移动，它们可以搅拌珠以放置它们或将它们保持在悬液中，或者重新聚集它们以将它们从样品中分离。该装置用于最大体积为几十毫升的容器。在处理大体积时遇到的问题是难以获得磁珠的良好分散，并且之后难以将它们回收。
最后，Matrix Microscience的Pathatrix装置通过在管状线路的环路中循环样品来提供250ml样品中靶标(如病原微生物)的捕获，其中功能化磁捕获珠固定在平磁体上。由于珠被固定，该装置产生低捕获得率，这尤其使得无法检测以低浓度存在的靶标。
因此，由上述可见现有技术中没有装置允许这样的灵敏检测，即通过自动化处理在大体积液体样品中检测少量存在的靶标。
本发明的主题涉及用于处理体积V大于或等于IOml (优选大于或等于50ml，更优选大于或等于500ml)的液体样品的自动化装置，所述自动化装置包含其中放置功能化磁珠的体积ν为10 μ 1至5ml的反应室，允许捕获生物或化学靶标的所述珠的量使珠的捕获表面积与反应室体积的比值为0. 2至200m2/l，优选0. 2至20m2/l，甚至更优选0. 2至IOm2/ 1，所述反应室配备有
-使所述珠能均勻分散的非侵入式搅拌系统；
-可以被启动(打开位置)或关闭(关闭位置)的磁场；
-用于填入和排出反应室内含物的部分或全部的流体移动系统。
图1是本发明装置的示意图，该装置包含其中放置功能化磁珠O)的反应室(1)、 搅拌系统如超声浴(3)、可被启动(打开位置)或关闭(关闭位置)的磁场(4)和用于填入 (51)和排出(52)部分或全部反应室内含物的流体移动系统(5)。
反应室的体积优选为50至500 μ 1。甚至更优选100 μ 1。
反应室可以是容器形式或者为管状系统如毛细管。
优选地，反应室包被有疏水表面以防止捕获珠粘附至其内壁；该疏水表面选自 Teflon, ETFE (乙烯三氟乙烯)、PFA(全氟代烷氧基共聚物树脂)和PTFE (聚四氟乙烯)。
术语“液体样品”旨在表示从工业水(例如源自冷却回路)、环境水(水路等)或者从供人或动物摄入的饮用水中取得的样本，并且延伸至其中在溶液或悬液中有待检测的生物或化学靶标的任何样品。该样品本身可以获得自样本或能包含目的生物或化学靶标的其他样品(如食物产品、体液、空气样本)，它们根据可被本领域技术人员适用的任何方法通过物理和/或化学和/或生物方法获得。
本发明装置具有对极低浓度靶标的捕获能力，因此它尤其适于处理可仅包含极少量生物或化学靶标的液体样品；特别地，对于生物靶标，本发明装置因此能检测以小于或等于100单位/升样品的量(优选小于或等于10单位/升样品的量，更优选等于1单位/升样品的量)存在的生物靶标。
为了避免任何外源污染，优选在极清洁条件下用无菌仪器取得或制备液体样品。
在分析空气中微生物质量的情况下，液体样品可以根据本领域技术人员已知技术 (Stachowiak JC 等，Anal. Chem. 2007 ;79 (15) :5763-70)制备。
理论上对所述液体样品的最大体积没有限制；在实际应用中其通常不超过101。
用于填入和排出部分或全部反应室内含物的流体移动系统使得可以将液体样品级分填入反应室以捕获生物或化学靶标，然后在捕获步骤后排出该液体样品的级分。该系统还使得可以在开始时填入功能化磁珠并且在液体样品处理结束时排出它们。
具体而言，该流体移动系统优选由压力调节系统(Fluigent)或泵(53)(如活塞泵、膜式泵或蠕动泵)组成。
使珠均勻分散的搅拌系统是非侵入式的，即它不需要将搅拌配件引入反应室，从而避免污染液体样品的危险。
搅拌功能性磁珠的系统可以采用移动磁场的方式，它通过一个或更多个旋转磁体实现；通过流体移动系统使反应室内含物来回移动以使珠运动；或者通过超声搅拌。
搅拌系统优选为超声搅拌(其弹性波频率为15kHz至几百MHz)，它通过在超声浴中以水传递超声来实现，或直接通过超声换能器(Borttwick等^)0 Journal of microbiological methods 60,207-216 ；Belgrader 等(1999)Analytical chemistry 71(19),4232-4236)实现。
超声浴的功率为5至100W/1 (优选40W/1)，有效功率为50至400W。可用于本发明装置的超声浴是Fisher Scientific公司的S-Iine超声清洗器。
本发明装置可任选地包含超声搅拌系统和其他用于搅拌功能化磁珠的非侵入式系统。
磁场由永磁体或电磁体产生。
作为非限制性实例，可以使用大小为IXwXd = 20X13X10mm并且规格为钕-铁-硼(NdFeB)磁化级别N38并且具有镍/铜/镍涂层的磁体。
电磁体的规格为例如以下电磁输出12Vcc IOff和行程1. 8mm。
当使用永磁体时，它必须能被置于靠近反应室(以吸引功能化磁珠(打开位置)) 和与反应室保持足够的距离(以不对珠产生任何吸引力(关闭位置))的两个位置；这两个位置之间的传送可以通过移动永磁体的多种方式实现。
当使用电磁体时，其被置于贴靠或靠近反应室的位置，并且它处于运行(开)模式以吸引功能化磁珠，或者关闭(关)，则其不再对功能化磁珠产生任何吸引力。
可通过在反应室中添加美国专利6 159 378中所述的泡沫金属(优选镍泡沫金属)来增强磁体或电磁体对功能化磁珠的磁吸引效力。
磁珠通常是直径为1纳米至几微米的微球；优选地，用于本发明装置的功能化磁珠的直径为0. 5至10 μ m，更优选直径为1 μ m。注意选择大小大于或等于生物或化学靶标大小的珠。
珠的磁性使得可以用磁体在容器中控制它们。不存在外界磁场时珠不具有磁特性，从而避免聚集体的形成并允许对其再利用。
本领域技术人员已知的任何类型的磁珠均可用于本发明的装置中；对此，可提及 Dynal或Chemicell公司销售的功能化磁珠。
还可提及美国专利4 628 037中所述的用于捕获生物靶标的功能化磁珠。
磁珠是功能化的，即它们的外表面包被有分子，所述分子具有与一种或多种生物或化学靶标或多或少特异地结合的特性；这些分子被称为捕获材料。包被有捕获材料的珠的表面积构成捕获表面积。优选地，该捕获表面积为1\10-3至10\10_2!112。
捕获材料和靶标之间的多种类型的键可包括
-静电相互作用根据其表面所带电荷来捕获靶标。捕获表面包含作用力或大或小的阴离子交换或阳离子交换末端基团。它们可以是羧基、砜、磷酸类、二乙基氨基-乙基 (diethylaminoethyl, DEAE)、聚赖氨酸、聚乙亚胺(PEI)，更一般地为带电聚合物(D印onte 等· Anal. Bioanal. Chem. 2004 ；379 :419-426)；
-疏水相互作用根据表面疏水性差异捕获靶标。例如含水基质中的靶标(如蛋白质、肽或核酸)的疏水区优先与疏水捕获材料(如包含1个(甲基)至18个(十八烷基) 碳原子的烃基链)结合；
-共价键移植到珠上的功能化末端基团使得可以共价键合靶标配体，它们特别是胺基、羟基、巯基、聚戊二醛基团等；
-亲合键珠包被有允许高特异性和选择性键合的配体，例如抗原和抗体之间的相互作用、两个核苷酸片段之间的杂交、生物素和链亲和素之间的作用等(Ergin 等.Microbial Cell Factories 2007 ；6 18 ；Steingroewer 等，J. Magnetism Magnet. Material 2007 ;311 :295-299 ;Aim 等，J. of Virology 200579(1) :622-625)。
根据目的生物或化学靶标选择捕获材料。
根据本发明装置的一种变化形式，用允许捕获两种或更多种靶标的两种或更多种不同捕获材料对磁珠进行功能化。使用包被有几种不同捕获材料的磁珠，或者使用几种类型的磁珠，每种类型的磁珠包被有不同的捕获材料。
填入反应室的功能化磁珠的量使捕获表面与样品体积的比例为0.2至200m2/l，优选0. 2至20m2/l，更优选0. 5至10m2/l，最优选1至5m2/l，例如2. 8m2/l。
例如，在珠直径为1 μ m并用PEI (Chemicell)功能化的情况下，可以使用的珠的数量为 9 X IO8 至 9 X IO9，代表 2. 83 X l(T3m2 至 2. 83 X l(T2m2 的捕获表面。
本发明装置的优势是允许处理大体积(大于或等于10ml，优选大于或等于50ml， 更优选大于或等于500ml)的液体样品而同时保持小体积的反应室(最大几毫米)，从而使得可以保留在小体积中捕获生物或化学靶标的优势，即
-由于体积小而占用较小空间并且装置成本低；
-更容易并更快地回收磁珠；
-更便于分散和混合磁珠；
-减少所需试剂的体积和用于在捕获后处理磁珠的时间；
-提高靶标检测敏感性；
-所捕获靶标的浓度高。
该装置的优势还在于其提供捕获表面与反应室体积的良好比例以及根据目的生物或化学靶标选择的多种捕获材料；最后，可以回收并再利用功能化磁珠。
本发明装置对大体积液体样品的自动化处理替代了处理该类样品的常用技术，如过滤或超滤。
因此该装置使得可以取得可包含生物或化学靶标的样品级分、捕获所述靶标并浓缩，从而处理它们以确认或甚至定量它们的存在。
在这样自动化情况下，该装置可放置在取样位置以取得定期样品并进行定期分析。
本发明装置可补充有液体样品收集系统，其由取得样品的流体系统(61)(如泵) 和用于反应室上游样品的储存容器(62)组成(图2)。液体样品收集系统与流体移动系统直接连接或经一个或更多个中间容器连接，使液体样品级分可填入反应室(51)。
本发明还涉及使用本发明装置捕获体积V大于或等于IOml (优选大于或等于 50ml，更优选大于或等于500ml)的样品中可存在的生物或化学靶标的方法，其包括以下步骤
a)取得所述液体样品的体积为ν的级分；
b)在磁场被关闭的情况下，将所述级分与所述装置反应室中的功能化磁珠相接触；
c)通过非侵入式搅拌系统均勻分散珠至少5秒，优选15秒至10分钟，更优选约 30秒；
d)通过开启磁场对珠进行捕获；
e)排出所述级分；
f)重复步骤a)至e) η次，使η为1至V/v，优选η = V/v。
本发明方法的自动化由合适的计算机系统编程并控制。
功能化磁珠上捕获的生物或化学靶标的处理可以在本发明装置的反应室中进行， 或者在与流体移动系统连接的容器中进行以允许排出反应室(5 的内含物。
在生物靶标的情况下，该处理由以下组成
-通过本领域技术人员根据所述靶标的洗脱缓冲液来洗脱生物靶标，然后
-对这样洗脱的靶标进行生物或生物化学分析。
生物或生物化学分析可以例如，包括当洗脱的生物靶标为微生物时在选择培养基中对它们进行培养和表征；或者用生物靶标的抗体进行检测等。
根据一个优选的变化形式，裂解所洗脱的生物靶标以释放它们的核酸。裂解方法是本领域技术人员公知的；其可以是使用包含去污剂(如十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂(LiDS)或十二烷基肌氨酸)或离液剂(如盐酸胍(GHCl)、硫氰胍(GTC)、碘化钠 (NaI)、高氯酸盐等)的裂解缓冲液进行的化学裂解，使用蛋白酶K或溶菌酶等进行的酶裂解，或机械裂解(如通过将珠和超声的作用联合或通过热梯度)。然后分析获得的核酸，例如通过PCR或杂交。
根据该变化形式，还可使用包含采用核酸捕获材料之功能化磁珠的本发明装置进行所得核酸的第二步纯化和浓缩。
在化学靶标的情况下，处理由以下组成
-使用本领域技术人员根据所述靶标的洗脱缓冲液来洗脱化学靶标，然后
-用常规化学技术(如核磁共振、层析、UV或顶光谱术、电化学分析等)分析所回收靶标。
当靶标具有生物化学性质时，通过本领域技术人员所掌握的根据生物化学靶标所选择的技术进行检测，例如将靶标与放射性或荧光标记的抗原偶联等。
因此，本发明还涉及检测生物或化学靶标的方法，其包括以上捕获方法的步骤a) 至f)，其特征在于还包括以下步骤g)洗脱所述靶标；和h)检测在步骤g)中洗脱的所述靶标。
当本发明的检测方法用于生物靶标时，步骤h)可包括裂解所述靶标并且检测在裂解中释放的核酸。
除上述配置外，本发明还包括从以下对实施本发明的实施例和附图的描述中可见的另一些配置，在附图中
图1是本发明装置的示意图。
图2是本发明装置的示意图，其还包含液体样品收集系统。
图3显示用于以下实施例的本发明装置的组件，所述装置包含并排的两个相同组件，每个均由以下组成反应室(1)；两个反应室放置在配备有磁体的超声浴(3)中； 它们的一端经泵(5 连接至废料容器(7)，另一端连接至包含样品的容器(9)，通过电磁阀(8)向反应室填入样品。
图4至7显示并比较由本发明方法鉴定的样品基因组单元数(N)或样品中起初存在的基因组单元数(NO)。
实施例河水样品中细菌的捕获
在并排通道中放置两个相同的装置(图3)。
流体的循环由与PFA软管(外径1. 6mm,内径Imm)连接的Ismatec IPC-N蠕动泵提供。这些软管作为反应室，其中储存磁珠。
珠由磁体控制。磁体的位置由电磁体的臂控制；在打开位置时，磁体与软管接触； 在关闭位置时，磁体与其分离。
软管中作为反应室并放置的区域被浸没在超声浴中，其功能是在磁场捕获珠后分散它们形成的聚集体。
软管的下游连接至六通阀(Upchurch V_1471_DC)，使得可以选择进入的液体。
全部这些组件的控制是自动化的，并且通过Nation Instrument公司的LabView 软件实施。
将体积V为20ml的完整样品储存在容器中。
将等价于10 μ 1体积的量(即直径为Iym的1.8Χ108个珠)填入软管中打开位置的磁体所处的水平上。
用泵从样品中取得体积ν为100 μ 1的级分。
将该体积ν放置在软管中珠所处水平上，然后将磁体放置在关闭位置；开启超声并使珠在体积ν的级分中分散。
然后关闭超声；移动软管中的样品，其目的是重悬可能因超声作用沉积在壁上的珠。
珠与样品接触45秒以捕获靶标。
然后将磁体放置在打开位置，珠因而被磁场捕获并聚集在软管的内壁上。泵将样品向废料容器的方向以300 μ 1/分钟的速度推进，并将体积ν的新样品级分放置在反应室中珠所在处。
重复捕获循环50至100次。
靶标洗脱
由于系统包含几个阀，可以选择连接至含有洗脱缓冲液(或者如果需要甚至含有裂解缓冲液)的容器的新入口。该缓冲液经泵的作用被放置在珠储存区域的水平上。
磁体置于关闭位置，施加超声以分散缓冲液中的珠。然后从珠表面洗脱靶标并任选地裂解。
然后将磁体置于打开位置；珠聚集并被保留，而包含靶标的洗脱(和任选地裂解) 缓冲液样品被泵回收。
详细方案
对两种液体样品施用该捕获原理，一种是20ml的IOmM Tris-HCl缓冲液(pH 8)， 另一种是当天取得的IOmi河水(Rhone);在这两种样品中掺入靶标约 ο6基因组单元的大肠杆菌(Escherichia coll)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞(对应于约IO6 个细菌)。
所用磁珠为包被有聚乙烯亚胺层的超顺磁珠(SiMAG-PEI Chemicell)，它允许与靶标(细菌细胞)发生静电型相互作用；这是由于细菌具有总负电荷并且PEI是强阴离子交换剂。珠表面/样品级分体积的比值为2. 8m2/l。
为了处理20ml的IOmM Tris-HCl(pH 8)，需要在并排安装的两个装置上运行100 个100 μ 1的循环。基于相同的计算，为了处理IOml的河水需要运行50个循环。
为了评价该捕获系统的效率，在所制备的100μ 1样品中添加106个基因组单元， 对其处理一个循环以获得参照捕获效率。
在捕获循环结束时，用100 μ 1 IOmM Tris-HCl回收珠。然后直接在珠上进行DNA 提取于37°C在裂解缓冲液(5M胍-HC，20mM Tris,pH 8，1 %十二烷基肌氨酸)中进行细胞裂解。孵育10分钟后，将混合物置于37°C的超声浴中2分钟。用磁体将珠汇聚在一起，回收上清液并放置于4倍其体积的溶液(包含3M盐酸胍，20mM Tris-HCl,80% (ν/ν)乙醇， pH 4)中；然后用2. 5μ 1硅烷醇功能化磁珠(SiMAG-SiIanol，Chemicell)捕获DNA。用2mM NaCl, IOmM Tris-HCl,75% (ν/ν)乙醇溶液润洗2次后，将纯化的DNA洗脱在10 μ 1 IOmM Tris-HCKpH 8)中之前进行2分钟的超声浴。
还可以使用之前捕获步骤所用仪器装置来自动化地进行DNA提取和纯化方案。
通过定量PCR测定所提取的DNA量(N)并表示为基因组单元。为此，将5μ1提取得DNA悬液与5 μ 1以下PCR试剂混合0. 3 μ M引物，2. 5U Gold Taq聚合酶，BSA (1. 4mg/ ml)，IX 缓冲液(补充有 Applied Biosystems 的 AmpliTaqGold DNA 聚合酶)，3M MgCl2, 200 μ M dNTP，0. 65mM 甜菜碱。
所用引物序列为
大肠杆菌(16S核糖体RNA基因)
ColiTQF 正向 5，-CATGCCGCGTGTATGAAGAA
Col i TQR 反向 5，-CGGGTAACGTCAATGAGCAAA
探针5，-TATTAACTTTACTCCCTTCCTCCCCGCTGAA
枯草芽孢杆菌(16S核糖体RNA基因)
BacFbis 正向 bis 5，-ACGTGGGTAACCTGCCTGTAAG
BacRbis 反向 bis 5，-TAGCCGAAGCCACCTTTTATGT
探针5，-TACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGT
将5 μ 1初始液体样品(之前进行超声10分钟)与5 μ 1上述PCR试剂的混合物混合，通过PCR测定样品中起初存在的基因组单元数(NO)。
MM
-检测TriS-HCl缓冲液样品中的靶标
所得结果(图4和5)显示观察到的本发明装置捕获的DNA量(N)与相应初始样品中存在的DNA量(NO)之间的差异小于0.4 log 10，这表明几乎所有起初存在的细胞都被捕获。
-检测河水样品中的靶标
同样地，所得结果(图6和7)显示观察到的本发明装置捕获的DNA量(N)与相应初始样品中存在的DNA量(NO)之间的差异小于0.2 log 10，这再次表明几乎所有起初存在的细胞都被捕获。
权利要求
1.用于处理体积V大于或等于IOml的液体样品的自动化装置，所述自动化装置包含其中置有功能化磁珠的体积ν为10 μ 1至5ml的反应室，允许捕获生物或化学靶标的所述珠的量使得珠捕获表面积与所述反应室体积的比值为0. 2至200m2/l，所述反应室配备有-能使所述珠均勻分散的非侵入式搅拌系统； -可以被启动或关闭的磁场；-用于填入和排出所述反应室的部分或全部内含物的流体移动系统。
2.权利要求1的装置，其特征在于所述反应室的体积优选为50至500μ 1，优选约 100 μ 1。
3.权利要求1或2的装置，其特征在于所述反应室包被有选自Teflon、ETFE,PFA和 PTFE的疏水表面。
4.前述权利要求中任一项的装置，其特征在于所述非侵入式搅拌系统是超声搅拌系统。
5.前述权利要求中任一项的装置，其特征在于所述磁场由永磁体或电磁体产生。
6.前述权利要求中任一项的装置，其特征在于所述功能化磁珠的直径为0.5至10 μ m。
7.前述权利要求中任一项的装置，其特征在于其还包含液体样品收集系统，所述液体样品收集系统由用于取得所述样品的流体系统如泵以及所述反应室上游的储存容器组成。
8.用权利要求1至7中任一项的装置捕获体积V大于或等于IOml的液体样品中可存在的生物或化学靶标的方法，其包括以下步骤a)取得所述液体样品的体积为ν的级分；b)在所述磁场被关闭的情况下，将所述级分与所述装置的反应室中的功能化磁珠相接触；c)通过所述非侵入式搅拌系统均勻分散所述珠至少5秒；d)通过开启的磁场捕获所述珠；e)排出所述级分；f)将步骤a)至e)重复η次，使得η为1至V/v。
9.权利要求8的捕获方法，其特征在于η= V/v。
10.检测生物或化学靶标的方法，其包括权利要求8或9的捕获方法的步骤a)至f)， 其特征在于其还包括以下步骤g)洗脱所述靶标和h)检测在步骤g)中洗脱的所述靶标。
11.权利要求10的检测生物靶标的方法，其特征在于步骤h)包括裂解所述靶标和检测在所述裂解中释放的核酸。
全文摘要
本发明涉及用于收集和浓缩生物或化学靶标以对其进行检测的装置，其中所述装置包含其中放置功能化磁珠(2)的反应室(1)、超声搅拌系统(3)、可被启动(打开位置)或关闭(关闭位置)的磁场(4)和用于填入(51)和排出(52)反应室内含物的部分或全部的流体移动系统(5)。本发明还涉及使用所述装置捕获生物或化学靶标的方法。
文档编号C12Q1/24GK102498402SQ201080027260
公开日2012年6月13日 申请日期2010年5月17日 优先权日2009年5月19日
发明者多萝泰·雅里, 纪尧姆·迪兰, 西尔瓦伊内·沙博, 齐里尔·德拉特 申请人:原子能与替代能源委员会