新型永久人细胞系的利记博彩app

专利名称：新型永久人细胞系的利记博彩app
新型永久人细胞系本发明涉及一种永久人细胞系，其包含腺病毒基因功能ElA和ElB的核酸序列和 SV40大T抗原或埃巴二氏病毒(EBV)核抗原I(EBNA-I)的核酸序列。另外，本发明涉及一种用于在所述永久人细胞系中瞬时表达重组多肽和蛋白质的方法。在细菌之外，使用酵母和植物细胞，特别是动物细胞来生产重组多肽和蛋白质。现今，所有治疗性蛋白质中约60-70%是在哺乳动物细胞中生产的(Wurm，Nat. Biotechnology 22，1393-1398，2004)。用于治疗、诊断或技术目的的重组多肽或蛋白质在细胞培养中(即体外)的生产一般可通过两种不同方式来进行。在稳定的、持久的或永久的已建立细胞系中，使编码期望多肽或蛋白质的核酸以至少一个拷贝整合入细胞的染色体 DNA且在细胞分裂中与细胞染色体集合一起传代给子细胞(所谓的生产细胞系中的稳定表达)。为了生成这些稳定生产细胞系，至少一个通过转染导入细胞的核酸携带可提供在生长期间细胞培养中的选择优势的基因功能是有必要的。具有此类基因功能的核酸不一定与期望多肽或蛋白质的表达盒在同一分子上。所述基因功能或是抗生素抗性基因或是针对培养基中的化疗剂的抗性基因(例如常用于哺乳动物细胞的)(Wurm，Nat. Biotechnology 22， 1393-1398，2004)、具有补足缺陷型代谢途径的基因产物的基因(例如用于酵母细胞的)、 或转化基因功能(在人羊水细胞上显示的)(Schiedner et al. ,BMC Biotechnology 8，13， 2008)。这样，确保了这样具有稳定整合入细胞染色体DNA的转染核酸、且生成所述基因产物的细胞的生长能超过没有此类整合的其它细胞，并能被选择出来。在通过所谓的宿主细胞系中的转染来制备生产细胞时，一方面将编码重组多肽的核酸(所谓的转基因)与必要的转录调节元件一起转染，另一方面转染具有编码选择标志的基因的第二表达盒，其基因产物就选择而言提供某种优势。基因转移后数天内培养细胞(例如在没有选择试剂的培养基中)，然后将一种合适的选择试剂添加至培养基。在所述选择试剂存在下，只有那些整合了用于转染的核酸且表达选择标志的细胞才存活和生长。常用的选择标志有新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和二氢叶酸还原酶(DHFR) (Wurm，Nat. Biotechnology 22,1393-1398,2004 ；Wurm and Jordan,309_333in :Makrides(Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)。因而，在分别含有选择试剂诸如抗生素新霉素或潮霉素和合成糖皮质激素甲氨蝶呤的培养基中进行选择。一般地，随后将具有选择标志和转基因的、经过选择过程存活并扩增的细胞(所谓的转化子)单一化(克隆)，以确保培养物中的所有细胞在遗传上是相同的，并将期望的具有最好生产率的生产细胞系与不太好的生产细胞系分开。相反，为了所谓的瞬时表达，通过转染导入细胞的编码期望多肽或蛋白质的核酸不整合入细胞的染色体DNA且不选择此结果。因此，导入的核酸一般在培养生长期间在细胞分裂过程中稀释并丢失。这预示了这种表达方法的暂时、瞬时的性质。具有较好表达效率的稳定生产细胞系的选择可持续数月且严重提高成本。相反，通过瞬时表达能在几天内生成毫克量的期望多肽或蛋白质。速度和成本是生物药物和诊断产品的工业开发的关键因素。因此，在基础研究之外，小量蛋白质或不同蛋白质变体的瞬时表达被用于早期探索性和临床前开发，例如基因产物的靶物鉴定、测定法开发、生化表征，毒理学及药动学以及药效学调查等(Baldi et al.，Biotechnol. Lett. 29，677-684，2007 ；Pham et al.，Molecular Biotechnology 34，225-237，2006)。相反，蛋白质的克乃至千克规模的工业生产通过稳定生产细胞系来实施，以便进行更大的临床研究和市场供应。例如，在EP 1948789中记载了一种在不使用选择标志的情况下通过转染细胞转化因子来生成永久人羊水细胞细胞系的方法。迄今为止，可通过瞬时基因表达来生成分泌的、膜结合的和胞内的蛋白质。当前， 哺乳动物细胞是许多复杂蛋白质的常用表达系统，特别是如果所述蛋白质会用于治疗目的的话，因为原核和简单真核细胞系统(例如酵母)就翻译后修饰而言显然是不利的。迄今为止，基本上使用四种哺乳动物细胞系来进行瞬时蛋白质表达源自非洲绿猴肾细胞衍生的CV-I细胞系所衍生的C0S-1和C0S-7 ；源自幼仓鼠肾细胞衍生的BHK细胞；源自中国仓鼠卵巢衍生的CHO细胞；和HEK293细胞，一种具有神经元特征的人胚肾细胞系(Wmm et al. ,Molecular Biotechnology 34,225-237,2006 ；ffurm et Bernard,Current Opinion in Biotechnology 10，156-159，1999)。哺乳动物细胞系中的瞬时表达一般基于包含表达盒与编码期望基因产物的序列的质粒的转染。也可使用病毒表达载体诸如塞姆利基森林病毒或腺病毒，但是它们不常用，因为它们高效但费时，并且安全性要求高。已经为培养的哺乳动物细胞中的DNA转移开发了多种物理和化学方法。用于基因转移的物理方法包括电穿孔、 核转染(nucleofection)和显微注射。对于使用化学转染方法，使用无机物质(例如磷酸钙/DNA共沉淀)、阳离子聚合物(例如聚乙撑亚胺、DEAE-右旋糖酐法)或阳离子脂质(所谓的脂转染)。磷酸钙和聚乙撑亚胺是较大规模(可达几升)核酸转移中最常用的转染试剂(Baldi et al.，Biotechnol.Lett. 29，677-684，2007)。基于久为人知的细胞系的已有记载的用于瞬时表达多肽和蛋白质的方法具有多个原因的缺点。低表达效率是与一个与瞬时方法相关的问题。为了改进细胞表达产率，使用不同遗传系统依靠所导入核酸的附加型复制来提高每个细胞的基因拷贝数。COS细胞表达猴病毒40(SV40)的大T抗原，一种能实现附加型复制以达到较高拷贝数的携带SV40复制起点(SV40ori)的质粒的复制因子。所述复制的初始事件是T抗原结合SV40复制起点 (SV40ori)，由此细胞复制因子被募集至DNA/T抗原复合物并由细胞DNA聚合物诱导复制。 HEK293细胞系的两种遗传变体已有记载，它们是在约30年前通过用经过剪切的5型腺病毒 DNA转化人胚肾细胞而生成的，且可较好地转染。所述变体也分别表达所述SV40大T抗原 (HEK293T)和所述埃巴二氏病毒(EBV)核抗原1 (EBNA-I) (HEK293E或^3EBNA_1)。所述细胞系应分别提供具有SV40-ori和EBV-oriP的质粒的附加型复制或扩增。复制因子EBNA-I 在后一种情况下与EBV的复制起点oriP相互作用。至少对于HEK293E细胞，通过使用含有 oriP的表达质粒检测到了表达产率的升高。同与复制起点oriP组合使用EBNA-I相反，一些研究指示在HEK293T细胞中没有发生具有SV40-ori的质粒的强复制(Durocher et al., Nucleic Acid Research 30，e9，2002)。已生成CHO细胞的一种稳定变体，其表达多瘤病毒的大T抗原(LT) (Epi-CHO)且可以与携带多瘤病毒的复制起点(PyOri)的质粒组合使用 (Kunaparaju et al. ,Biotechnology and Bioengineering 91,670-677, 2005)。使用此类哺乳动物细胞系统，通过所述重组蛋白瞬时表达生成了平均约10-20mg/l的产率(Baldi et al.，Biotechnol. Lett. 29,677-684,2007)。相反，如上所述，使用稳定永久生产细胞系通常获得几克每升范围的产率，然而要相当显著的更高时间和金钱花费。迄今为止用于重组蛋白表达的细胞系统的另一项缺点在于一些细胞系确实因它们容易转染且容许附加型质粒扩增的能力而适合于瞬时表达(例如HEK293T或HEK293E细胞)，但是其它细胞系因它们在培养和产率方面的特性而优选用于生成稳定细胞系(例如 CHO细胞)。然而，由于细胞系统在翻译后修饰的数个方面彼此不同，所以能够在瞬时表达后(多数在蛋白治疗产品的早期发展阶段)在特定的细胞系统中得到的基因产物结构和功能的数据仅能非常有限地在表达后传递到其他细胞体系的稳定细胞系中(多数在后期发展阶段，医学研究和市场供应)。翻译后修饰，诸如糖基化、磷酸化、羧化、棕榈酰化或特异性切割，对于作为多种治疗性产品候选的表达产物的不同特性是极为重要的。它们能对活性、 溶解度、半衰期、稳定性或免疫原性产生影响。因此，人细胞系统在治疗性蛋白质的生产中日益发挥作用；只有人细胞作为生产设施才提供表达产物的可信人修饰并因此降低产品质量受影响或不期望的副作用的风险。例如对于在治疗上用于人的重组红细胞生成素而言， 已知在CHO细胞中生产的蛋白质(Epoetin Alpha)在它的碳水化合物侧链中展现N-乙醇酰神经氨酸模块，而在人细胞中生产的蛋白质(Epoetin Delta)-就像天然人红细胞生成素一样-则不含此类糖模块。鉴于可证明人体形成针对所述“外来”糖结构的循环抗体的事实，使用人表达系统似乎是有利的(Varki, Am. J. Phys. Anthropol. 33，54-69，2001)。当前还没有这样的人细胞系统可用其较好地适合于瞬时表达和生成稳定生产细胞系，并且因此在基于蛋白质的治疗剂的整个开发过程中提供可再现的产品性质。人细胞特别适合于生产人生物治疗剂，因为相对于其它哺乳动物细胞或动物细胞，它们表达复杂多肽的翻译后修饰样式是真实的。在人细胞中生产的复杂重组蛋白的糖基化样式，即分子中糖模块的结构和排列，相比于非人生产系统中的生产显著更好地再现真实的人多肽的样式。所述糖基化样式对于多肽的重要特性，诸如生物学活性、稳定性、溶解度和免疫学，常常是至关重要的。因此，本发明的目标是提供一种较好地适合于瞬时表达多肽和生成稳定生产细胞系的人细胞系统。权利要求书中限定的主题解决了所述目标。下面的示本发明。

图1示意性显示了用于T抗原永久表达的质粒的装配。在pGS158(图la)中，在人CAG启动子(人巨细胞病毒立即早期增强子与修饰型鸡肌动蛋白启动子及第一内含子的一种杂合启动子)(Niwa et al.，Gene 108 :193_199，1991)控制下表达T抗原，在 pGS159(图 lb)中在 RSV (Rous 肉瘤病毒)启动子(Makrides，9_26in :Makrides (Hrsg.)， Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)控制下表达T抗原，而在pGS 161(图lc)中在人CMV (巨细胞病毒)启动子(Makrides，9_26in Makrides(Hrsg. ), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)控制下表达T抗原。图2示意性显示了分别用于人α 1-抗胰蛋白酶(hAAT)和人红细胞生成素(Epo) 瞬时表达的质粒的装配，二者分别处于在人CMV启动子控制下。质粒pGS116(图2a)和 pGS151(图2b)含有相同的hAAT表达盒，pGS151另外含有猴病毒40的DNA复制起点 (SV40ori)。pGS177在Epo表达盒之外还含有SV40ori。
图3示意性显示了与没有T抗原表达的亲本羊水细胞细胞系(CAP)相比，表达T 抗原的不同羊水细胞细胞系(CAP-T Z582、Z583和Z597)中瞬时表达的培养物上清液中的 hAAT 量。在 Z582 中，T抗原在 CAG启动子(Niwa et al. ,Gene 108 193-199，1991)控制下表达，在 Z583 中，T抗原在 RSV (Rous 肉瘤病毒)启动子(Makrides，9_26in =Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdan,2003) 控制下表达，而在Z597中，T抗原在CMV(巨细胞病毒)启动子(Makrides，9-26in Makrides(Hrsg. ), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)控制下表达。图4示意性显示了转染无SV40ori (hAAT/细胞数_ori，质粒pGS116)和有 SV40ori (hAAT/细胞数+ori，pGS151)的质粒后不同时间点的培养物上清液中瞬时表达的 hAAT的量(柱)和活细胞的细胞数(线)。图5示意性显示了 CAP-T和HEK293T细胞中转染pGS151(有SV40ori)后不同时间点的培养物上清液中瞬时表达的hAAT的量(柱)和活细胞的细胞数(线)。图6示意性显示了 CAP-T和HEK293-T细胞中转染后不同时间点的质粒pGSl 16 (无 SV40ori)和pGS151(有SV40ori)的胞内拷贝数。图7示意性显示了 CAP-T中用聚乙撑亚胺(PEI)作为转染试剂转染pGS151 (有 SV40ori)后不同时间点的培养物上清液中瞬时表达的hAAT的量(柱)和活细胞的细胞数 (线)。如本文中使用的，术语“羊水细胞”以最广义指所有在羊水中存在的，而且可通过羊水穿刺来获得的细胞。它们源自与羊水接触的胎儿组织或羊膜。已记载了三大类羊水细胞可基于形态标准来区分成纤维细胞样细胞(F细胞)，上皮样细胞(E细胞)和羊水细胞 (AF 细胞)(Hohn et al.，Pediat. Res. 8 =746-754,1974)。AF 细胞是占优势的细胞类型。术语“表达盒”特别指如下的核酸分子和核酸分子的区域，其含有位于编码区之前的调节元件或启动子、编码区和可读框、以及位于编码区之后的转录后终止元件。位于编码区之前的调节元件和启动子可以是组成型的，即永久激活转录的启动子(例如CMV启动子)，或者是调节型启动子，即能打开和/或关闭的启动子(例如四环素调节型启动子)。 表达盒的编码区可以是一个连续的可读框，如具有5’端起始密码子和3’端终止密码子的 cDNA。编码区可以由编码外显子和散在的非编码内含子的基因组排列或新组合的排列所组成。然而，表达盒的编码区可以数个由所谓的IRES(内部核糖体进入位点)隔开的可读框组成。如本文中使用的，术语“永久细胞系”指遗传上经过修饰，使得它们可以在合适培养条件下在细胞培养中持续永久生长的细胞。此类细胞也称作永生化细胞。如本文中使用的，术语“多肽”或“重组多肽”指由至少2个氨基酸组成的肽。多肽可以经过共翻译修饰和/或翻译后修饰，例如糖残基的搭接或对氨基酸残基的修饰。多肽可以是线性的、环状的或分支的。另外，多肽可以由超过一条氨基酸链组成，其中通过分子内和/或分子间键，各链可采取或多或少复杂的三维结构(例如二级、三级、四级结构)。如果多肽由一条氨基酸链组成的话，它也可通过分子内键而采取或多或少复杂的三维结构。 多肽可以是药理学或免疫学活性多肽或用于诊断目的的多肽。如本文中使用的，术语“原代细胞”指通过直接自生物体或组织取出并置于培养中而获得的细胞。原代细胞只展现非常有限的寿命。如本文中使用的，术语“生产细胞系”指通过导入编码要生产的期望多肽的转基因从而在遗传上得到稳定修饰的永久细胞系。如本文中使用的，术语“CAP”指通过用腺病毒基因功能ElA和ElB使原代人羊水细胞永生化而生成的永久人羊水细胞细胞系。如本文中使用的，术语“CAP-T”指另外经包含SV40大T抗原序列的核酸分子稳定转染的CAP细胞。如本文中使用的，术语“转染”指任何适合于将所述核酸导入细胞的方法。可列举经典的磷酸钙、电穿孔、任何种类的脂质体系统及这些方法的组合作为例子。如本文中使用的，术语“瞬时表达”指任何在没有通过合适选择方法来选择稳定细胞系的条件下通过转染将核酸导入细胞的方法，所述稳定细胞系可以在细胞培养中继续永久培养。如本文中使用的，术语“稳定表达”指转基因在生产细胞系中的表达。如本文中使用的，术语“转基因”指编码重组多肽的核酸序列。本发明的一个主题涉及一种用于生成永久人细胞系的方法，包括下述步骤a)用包含编码腺病毒基因功能ElA和ElB的核酸序列的核酸分子转染原代人细胞，所谓的1.转染；并b)随后用包含编码SV40大T抗原的核酸序列的核酸分子转染该永久人细胞系，所谓的2.转染。优选地，用于依照本发明生成永久人细胞系的方法中的步骤b)的所述核酸分子包含编码非分泌形式的SV40大T抗原的核酸序列。在依照本发明的方法的步骤b)中的转染期间，可以替代地用包含编码埃巴二氏病毒(EBV)核抗原I(EBNA-I)的核酸序列的核酸分子转染该永久人细胞系，所谓的2.转染。优选地，所述核酸分子包含编码非分泌形式的埃巴二氏病毒(EBV)核抗原I(EBNA-I) 的核酸序列。通过依照本发明的方法中实施的转染，所述原代人细胞优选被稳定转染，即转染的DNA整合入细胞的基因组。通过用包含编码ElA和ElB的核酸序列的核酸分子转染所述原代人细胞使细胞永生化。用于永生化所述原代人细胞的核酸分子包含ElA和ElB的核酸序列，优选衍生自人腺病毒，特别是人腺病毒血清型5的。在一个优选的实施方案中，用于永生化的核酸分子在编码ElA和ElB的核酸序列之外还包含编码腺病毒基因功能pIX的核酸序列。PlX多肽，一种病毒结构蛋白，作为转录激活物作用于不同病毒和细胞启动子诸如胸苷激酶和珠蛋白启动子。一种例示性序列可见于GenBank登录号Χ(^996。特别地，核酸分子包含人腺病毒血清型5的核苷酸1至4344 (SEQ ID NO 1包含编码Ε1Α、ElB和pIX的核酸序列)、505 至；3522 (SEQ ID NO 2包含编码ElA和ElB的核酸序列)或核苷酸505至4079 (SEQ ID NO 3包含编码E1A、ElB和pIX的核酸序列)。特别地，用表达盒形式的编码要表达的期望基因功能的核酸序列转染人细胞。所述表达盒包含核酸分子，其含有位于编码区之前的调节元件或启动子、编码区和可读框、以及位于编码区之后的转录终止元件。
特别地，在一个实施方案中，该表达盒或核酸分子含有SV40大T抗原的核酸序列 (SEQ ID NO 4)、选自 CMV 启动子(SEQ ID NO 5)、CAG 启动子(Niwa et al.，Gene 108 193-199，1991)和RSV启动子(GenBank登录号DQ075935)的启动子的核酸序列、SV40SD/ SA(内含子)的序歹Ij (SEQ ID NO:6)和 SV40polyA(SEQ ID NO:7)的核酸序列。在另一个实施方案中，该表达盒或核酸分子特别含有埃巴二氏病毒(EBV)核抗原 1 (EBNA-I)的核酸序歹Ij (SEQ ID N0:8)、选自 CMV 启动子(SEQID NO :5)、CAG 启动子(Niwa et al.，Gene 108 193-199，1991)和 RSV 启动子(GenBank 登录号 DQ075935)的启动子的核酸序列、SV40SD/SA (内含子)的核酸序列(SEQ ID NO 6)和 SV40polyA(SEQ ID NO 7) 的核酸序列。通过直接从生物体或取自生物体的组织取出并置于培养中而获得原代人细胞。优选的是此类原代人细胞，其能通过表达腺病毒ElA和ElB较好地转变成永久人细胞系，特别是羊水细胞、胚胎视网膜细胞和神经元起源的胚胎细胞。优选地，通过依照本发明的方法生成永久人羊水细胞细胞系。作为步骤a)的替代，本发明的方法还可用已存在的永生化人细胞系，特别是用已存在的在其基因组中具有腺病毒基因功能ElA和ElB的核酸序列的永生化人羊水细胞细胞系来实施。优选地，该永生化人细胞系在它们的基因组中包含腺病毒基因功能E1A、ElB和 PlX的核酸序列。根据需要用上文所述含有编码SV40大T抗原或埃巴二氏病毒(EBV)核抗原I(EBNA-I)的表达盒的核酸分子转染该已有永生化人细胞系，特别是永生化人羊水细胞细胞系。本领域技术人员会认识到，2.转染在时间方面只依赖于原代人细胞的1.转染， 因其必须在1.转染之后实施。2.转染不必在1.转染之后立即进行。因此，也可以根据需要在用ElA和/或ElB永生化的永生化人细胞系确立几年时候，用上文所述的核酸分子在 2.转染中转染。优选地，永生化人羊水细胞、永生化人胚胎视网膜细胞(特别是PER. C6细胞)、或神经元起源的永生化人胚胎细胞(特别是HEK 293细胞)可用于此。本发明的一个主题涉及包含腺病毒基因功能ElA和ElB的核酸序列和SV40大T 抗原或埃巴二氏病毒(EBV)核抗原I(EBNA-I)的核酸序列的永久人细胞系。优选地，本发明涉及包含腺病毒基因功能E1A、ElB和pIX的核酸序列和SV40大T抗原或埃巴二氏病毒 (EBV)核抗原I(EBNA-I)的核酸序列的永久人细胞系。更优选地，本发明涉及包含腺病毒基因功能ElA和ElB的核酸序列和SV40大T抗原或埃巴二氏病毒(EBV)核抗原1 (EBNA-I) 的核酸序列的永久人羊水细胞细胞系。最优选地，本发明涉及包含腺病毒基因功能E1A、E1B 和PlX的核酸序列和SV40大T抗原或埃巴二氏病毒(EBV)核抗原1 (EBNA-I)的核酸序列的永久人羊水细胞细胞系。特别地，本发明的另一个主题涉及使用依照本发明的方法获得的永久人细胞系， 优选永久人羊水细胞细胞系。本发明的另一个主题涉及一种使用依照本发明的永久人细胞系来瞬时表达重组多肽或蛋白质的方法，其中所述方法包括下述步骤a)用包含编码期望的重组多肽或蛋白质的核酸序列和SV40大T抗原或埃巴二氏病毒(EBV)核抗原I(EBNA-I)的识别或结合位点的核酸分子转染所述永久人细胞系；b)在容许所述期望的重组多肽或蛋白质表达的条件下培养步骤a)中获得的经过转染的永久人细胞系；并随后
c)自该细胞或自该培养物上清液分离所述期望的重组多肽或蛋白质。本发明的一个优选实施方案涉及一种使用依照本发明的永久人羊水细胞细胞系来瞬时表达重组多肽或蛋白质的方法，其中所述方法包括下述步骤a)用包含编码期望重组多肽或蛋白质的核酸序列和SV40大T抗原或埃巴二氏病毒(EBV)核抗原I(EBNA-I)的识别或结合位点的核酸分子转染所述永久人羊水细胞细胞系，b)在容许所述期望重组多肽或蛋白质表达的条件下培养步骤a)中获得的经过转染的永久人羊水细胞细胞系，并随后c)自该细胞或自该培养物上清液分离所述期望重组多肽或蛋白质。如果依照本发明的永久人细胞系含有包含编码SV40大T抗原的核酸序列的核酸分子的话，例如用含有如下的表达盒或核酸分子的表达质粒转染该细胞系，该表达盒或核酸分子包含编码要表达的转基因和SV40复制起点(SV40ori)的核酸序列。在该细胞系中稳定胞内表达的SV40大T抗原结合通过转染导入该细胞系的表达质粒的SV40复制起点， 并引起该表达质粒的附加型复制，从而导致要表达的转基因的拷贝数的扩增。将该细胞培养几天后，可自该细胞或自该培养物上清液获得由该转基因编码的期望基因产物。这样，所述转基因得到了瞬时表达。如果依照本发明的永久人细胞系含有包含编码埃巴二氏病毒(EBV)核抗原 1 (EBNA-I)的核酸序列的核酸分子的话，例如用包含如下的表达盒或核酸分子的表达质粒转染该细胞系，该表达盒或核酸分子包含编码要表达的转基因和EBV复制起点(EBV oriP) (Durocher et al. , Nucleic Acids Research Vol. 30Nr. 2e9,2002 ；Tuvesson et al. Cytotechnology 56 =123-136,2008)的核酸序列。在该细胞系中稳定胞内表达的EBV EBNA-I结合通过转染而导入该细胞系的表达质粒的oriP复制起点并引起该表达质粒的附加型复制，由此导致要表达的转基因的拷贝数的扩增。将该细胞培养几天后，可自该细胞或自该培养物上清液获得由该转基因编码的期望基因产物。由此，所述转基因得到瞬时表达。可以在用于真核细胞培养的常规条件下以约37°C、95%湿度和8% CO2培养依照本发明的细胞。依照本发明的细胞可以在含有血清或不含血清的培养基中、以贴壁培养或以悬浮培养来培养。悬浮培养可以在多种发酵容器中进行，例如搅拌釜反应器、“摇袋式”反应器(wave reactors)、振动容器或旋转容器或所谓的滚瓶。因此，该细胞适合于放大到工业规模。用于瞬时表达的细胞转染可以用上文所述多种转染方法来进行。转染和瞬时表达也可以分别以高通量格式和筛选来实施，例如96或384孔格式。猴病毒40 (SV40)的T抗原是一种多功能磷蛋白，其控制感染后的病毒复制和细胞功能二者。T抗原是一种转化剂，它通过与肿瘤抑制蛋白p53的相互作用来干扰细胞周期。 在病毒基因组的复制时需要T-抗原作为DNA解旋酶来解旋双链基因组。T抗原是复制必需的唯一病毒蛋白。其它功能由细胞蛋白来履行。在DNA复制的第一步中，12个T抗原分子作为两个六聚物结合SV40基因组中的DNA复制起点(ori)。随后，必需的细胞蛋白诸如 DNA聚合酶结合所述螺旋酶复合物，并解旋和复制DNA。所谓的“最小限度ori”由长度为 63bp的核心序列组成。环状质粒瞬时转染入靶细胞的过程中，不发生进入宿主基因组的整合。这导致质粒浓度在细胞分裂后稳定降低，且位于编码质粒上的基因的表达只是暂时的。 将SV40ori片段导入表达质粒和在生产细胞系中表达SV40T抗原导致质粒的拷贝数增多，
9从而提高表达效率。依照本发明瞬时表达多肽和蛋白质的方法具有如下的优点，即与迄今为止使用的方法相比，它在重组基因产物的数量和质量方面更加有效率，因此它在基于蛋白质的治疗剂的工业开发的整个过程中也更加划算。特别地，它具有如下的优点，即提供了基于人细胞系的一种高度有效率的瞬时表达系统，其首先真实地(相对于非人哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞)翻译后修饰人蛋白质，其次相当好地适合于在工业生产过程中建立稳定生产细胞系。由此它能确保在开发诊断和治疗产品的过程中，在早期开发阶段中瞬时表达之后，以及在晚期阶段和工业生产中在永久生产细胞系中稳定表达之后，基因产物的质量特征具有最大可能的同一性，特别是就可能由细胞系统的性质引起的特征差异而言。本发明的另一个优点在于依照本发明的永久人细胞系在瞬时表达中有高的表达产率。因此，具有编码期望基因产物的序列以及SV40复制起点(SV40ori)的质粒载体转染之后，意外地发现在产生SV40T抗原的羊水细胞细胞系的瞬时表达培养物上清液中的产率非常高，达60mg/l。所述产率比不表达T抗原的羊水细胞细胞系中的瞬时表达高超过70 倍。依照本发明的所述永久人细胞系的另一个优点在于提供了人细胞系统，优选基于永生化人羊水细胞的，其适合于在永久生产细胞系中稳定表达蛋白质和瞬时表达蛋白质二者(Schiedner et al.，BMC Biotechnology 8，13，2008)。与使用不同细胞系统来进行瞬时表达(例如HEK293或HEK293变体)和稳定表达(例如CH0)相比，瞬时生产与稳定生产的表达产物的结构和功能特性彼此不同的风险被最小化-如果所述结构和功能特性是基于表达系统的性质的话。由此，开发工艺的规划更完善，开发工艺费时更少，且更加划算。用于表达至少一种重组多肽的核酸序列包含在至少一种表达盒中。所述表达盒含有启动子和转录终止序列。例如，CMV(巨细胞病毒)启动子(MakrideS，9-26 in: Makrides(Hrsg.), Gene Transfer and Expression inMammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)、EF-I α 启动子(Kim et al.，Gene91 :217-223,1990)、CAG 启动子(人巨细胞病毒立即早期增强子和经修饰鸡肌动蛋白启动子及第一内含子的一种杂合启动子)(Niwa et al.，Genel08 193-199，1991)、人或鼠pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子 (Adra et al.，Gene60 :65-74,1987), RSV(Rous 肉瘤病毒)启动子(Makrides,9-26in Makrides(Hrsg. ), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)或 SV40 (猴病毒 40)启动子(Makrides，9_26in =Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)可充当启动子。例如，SV40大T抗原(GenBank登录号J0M00)或人G-CSF (粒细胞集落刺激因子)基因(Mizushima und Nagata, Nucl. Acids Res. 18 :5322,1990)的聚腺苷酸化序列可充当聚腺苷酸化位点。本发明的另一个主题涉及使用依照本发明的方法获得的多肽或蛋白质。依照本发明的方法获得的重组多肽可以是治疗性蛋白质，诸如人α 1-抗胰蛋白酶或生长因子诸如红细胞生成素或白介素-2。人α -抗胰蛋白酶(hAAT)是一种蛋白酶抑制剂，其抑制弹性蛋白酶和其它蛋白酶且在导致重度肺和肝损伤的遗传性hAAT缺陷的场合有治疗活性。红细胞生成素是红细胞(红血球)的一种重要的生长因子，其在贫血的情况下以及在移植患者中具有血液形成活性。白介素-2 (11- 是免疫系统的一种细胞信使，在细胞免疫应答的激活中有重要意义，例如在肿瘤疾病中。凝血因子，诸如因子VIII和 IX(在具有凝血障碍的血友病患者中使用的)也属于治疗活性多肽。依照本发明的方法获得的重组多肽可以是激素。生物技术工程化激素被用于具有激素紊乱的患者的替代疗法。 例子有许多糖尿病患者依赖的降血糖激素胰岛素、用于治疗侏儒症的生长素(生长激素)、 和用于治疗生育病症的促性腺因子诸如促卵泡激素(FSH)或黄体化激素(LH)。另外，重组多肽可以是翻译后修饰胞内或培养物上清液中同时表达的其它重组多肽的酶，例如涉及糖基化的酶。依照本发明的永久人细胞系中表达的基因产物E1A、ElB和pIX以及SV40大T 抗原和埃巴二氏病毒(EBV)核抗原I(EBNA-I)不属于要生成的期望多肽。依照本发明的方法获得的重组多肽可以是重组抗体，其可用于治疗或诊断目的。 针对肿瘤坏死因子α (TNF-α)的抗体用于类风湿性关节炎患者，针对表皮生长因子的细胞受体(EGFR)的抗体用于癌症患者。用于诊断目的的抗体可以是例如基于诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA)或放射免疫吸附测定法(RIA)等方法的商业性诊断试剂盒的成分。在这些检验测定中，抗体被用来检测感染原诸如人乙型肝炎病毒的抗原。抗体或免疫球蛋白(Ig)由重链和轻链组成，重链和轻链各自由可变和恒定区或域组成。用于表达抗体的转染核酸分子的核酸序列可含有两个分开的表达盒，其中一个编码免疫球蛋白分子的轻链，另一个编码免疫球蛋白分子的重链。当这两种链在依照本发明的细胞中表达时，这些链装配形成活性抗体分子。两种链的表达盒可存在于分开的核酸分子或同一核酸分子上。然而，轻链和重链的编码序列可存在于同一表达盒内且由IRES序列 (内部核糖体进入位点)隔开，从而提供重链和轻链二者的表达。轻链和重链的编码序列原则上亦可存在于同一表达盒内且由编码蛋白酶(例如凝血酶)的酶促切割位点的序列隔开，该蛋白酶在该细胞内同时表达且将由轻链和重链序列组成的前体多肽切割成活性轻链和重链。由依照本发明的细胞的核酸序列编码的重组抗体也可由抗体片段代替完整轻链和重链来组成。所谓的单链抗体(scFv，单链可变片段)由通过氨基酸序列(所谓的接头) (其提供两个域的自由活动性)连接的重链和轻链可变域组成。两种域的分子内装配形成抗原结合结构，该结构对应于免疫球蛋白分子的可变区。双特异性单链抗体(bis-scFv)由两种此类单链装配物组成，所述单链装配物由重链和轻链可变域构成，所述重链和轻链可变域通过连接序列而连接且彼此能活动；此类分子可同时结合两个抗原结合位点(表位)， 由此以非共价方式连接两个分子结构。双特异性双抗体由两条单链组成，所述两条单链分开表达，且各自由轻链和重链可变域组成，所述轻链和重链可变域只由很短的接头隔开或它们根本没有接头。短接头或缺少接头抑制分子内装配；通过重链和轻链可变域的分子内装配，再次形成具有两个结合效价的活性分子。由在本发明方法中转染的核酸分子编码的重组多肽可以是要生产用来作为预防性或治疗性疫苗的病毒、细菌或寄生物蛋白。由此，此蛋白质可以是来自病毒、细菌或寄生物的结构多肽和调节性或酶活性多肽二者。病毒蛋白可以是例如乙型肝炎病毒表面抗原(HBV表面抗原)或来自人乳头瘤病毒的结构蛋白Li。考虑用于在生产细胞系中表达后生产疫苗的细菌蛋白有例如来自肠毒性大肠杆菌(Escherichia coli) (ETEC)的肠毒素亚基或来自淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)的运铁蛋白结合蛋白(Tbp A和B)。 由在本发明方法中转染的核酸分子编码的，来自寄生物的多肽有例如疟疾病原恶性疟原
11虫(Plasmodium falciparum)的裂殖子表面蛋白(MSP)或来自日本血吸虫(Schistosoma japonic·)的谷胱甘肽S转移酶(GST)。由在本发明方法中转染的核酸分子编码的重组多肽还可以是病毒蛋白，其容许在细胞系内生成重组病毒基因转移载体。此病毒蛋白，也称作互补因子，在细胞系内表达且是生成基因转移载体所必需的酶性或结构性成分，该成分不在基因转移载体的核酸分子上编码。在此类基因转移载体中，通常因安全考虑而删除某些病毒基因功能。基因转移载体，其互补因子可由通过所述方法导入的转基因编码，有例如基于腺病毒、腺病毒伴随病毒 (AAV)、逆转录病毒或慢病毒或疱疹病毒的载体。在细胞系内表达的互补因子也可在删除型或重组型病毒产生的过程中补足所述病毒，这样的病毒不含要转移的基因，由此不起基因转移载体的作用，而是用作例如疫苗。通过本发明方法瞬时表达的多肽还可以是受体多肽，其特别是位于细胞表面上， 并负责病毒感染细胞和病毒基因转移载体转导细胞。鉴定了所谓的柯萨奇病毒和腺病毒受体 CAR (Berge Ison et al. ,Science 275 :1320-1323,1997)是腺病毒血清型 2 或 5 (大多数常规腺病毒载体都是从它们衍生的)感染细胞的初始步骤的病毒受体。CAR在表面上的充分表达是细胞适合成为腺病毒基因转移载体的生产细胞的一个前提条件。在一个优选的实施方案中，重组多肽是柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)。受体多肽的过表达能显著改善这些细胞对腺病毒载体的易感染性，从而改善这些细胞对腺病毒载体的生产效率。另外，核酸分子除CAR之外还可编码第二受体或内化受体，诸如某些整联蛋白，其介导细胞对病毒和基因转移载体的摄取，且其额外表达对于腺病毒载体的生产细胞的生成是有利的。所述方法可用于生产治疗性多肽、凝血因子和生长因子、激素和抗体以及用作疫苗的病毒、细菌或寄生物多肽等。此外，依照本发明的细胞可用于生产诊断有关蛋白，诸如病毒、细菌或寄生物抗原或其特异性抗体。另外，依照本发明的细胞可用于生产技术或工业有关蛋白，诸如用于催化技术合成工艺或用于降解有害物质的酶。依照本发明的细胞可表达一种或多种不同重组多肽。可表达多肽的数目取决于用依照本发明的方法将多少种编码重组多肽的不同核酸序列瞬时转染入细胞。另外，本发明涉及通过依照本发明的方法生成的永久人细胞系，特别是永久人羊水细胞细胞系用于生产多肽或蛋白质的用途。下面的实施例例示本发明且不应认为是限制。除非另外指明，使用分子标准方法， 诸如例如 Sambrook et al. , 1989,Molecular cloning :A Laboratory Manual, 2. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 中记载的。1.克隆规程a.用于转化原代羊水细胞的质粒pSTK146，pGS119，pGS122质粒pSTK146详细记载于EP 1230354B1且包含鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子、 腺病毒血清型5 (Ac^)序列核苷酸(nt. )505至3522和SV40的剪接和聚腺苷酸化信号。 PSTK146中的腺病毒序列包含编码ElA和ElB的区，其中ElA的表达受pgk启动子调节。质粒pGS119详细记载于WO 2007/056994且含有鼠pgk启动子、Ad5序列 nt. 505-3522(包含ElA和ElB区)、SV40的剪接和聚腺苷酸化信号，接着是pIX区即Ad5的 nt. 3485-4079。质粒pGS122详细记载于WO 2007/056994且含有腺病毒序列nt. 1-4344,其包含E1A、ElB和pIX区，包括各自调节性启动子和聚腺苷酸化序列。PGS122中的腺病毒序列侧翼为RiieI限制性位点。b.用于 T 抗原的表达质粒pGS158，pGS159，pGS161质粒pGS158、pGS159和pGS161都含有SV40的T抗原的表达盒(SEQ IDNO :4)，侧翼为SV40的内含子(SEQ ID NO 6)和聚腺苷酸化位点(SEQ IDNO 7)。另外，pGS158含有 CAG启动子(由CMV增强子和鸡β -肌动蛋白启动子组成的杂合启动子)(Niwa et al.， Gene 108 193-199，1991)，pGS159 含有 RSV 启动子(Rous 肉瘤病毒的启动子)(GenBank 登录号DQ075935)，而pGS161含有CMV启动子(人巨细胞病毒的早期启动子)(SEQ ID NO :5)。 为了生成稳定细胞系，质粒pGS158、pGS159和pGS161含有带有遍在蛋白启动子的杀稻瘟素表达盒(pUB/Bsd, Invitrogen#V512-20)。第一步，将含有编码T抗原的序列的2.61Λ片段导入质粒pGS140。质粒pGS 140 含有人CMV启动子(SEQ ID NO 5)、带有剪接供体/剪接受体位点的SV40内含子区(SEQ ID NO :6)、单一 NotI限制性位点和SV40PolyA序列(SEQID NO :7)。为了导入T抗原片段， 用NotI将pGS140线性化，将5'悬突补平并与分离的片段连接。将通过此规程生成的质粒命名为pGS149。对于质粒pGS158，用^CbaI消化pGS149并分离含有内含子序列、T抗原和PolyA序列的约31Λ片段。将此片段导入PGS152的NotI限制性位点(5'悬突已补平)。pGS152 是通过将具有1. Ikb大小的CAG启动子片段(Niwa et al.，Genel08 193-199，1991)插入 pUB/Bsd的EcoRV限制性位点而生成的。对于质粒PGS159，将pGS149的具有31Λ大小且含有T抗原的XbaI片段导入PGS153的补平的NotI限制性位点。pGS153含有具有约0. 6kb 大小的RSV启动子片段，导入到pUB/Bsd的EcoRV限制性位点。对于质粒pGS161，用SphI消化pGS149，将3'悬突补平，分离含有CMV启动子、 SV40内含子、T抗原序列和PolyA的3. 6kb片段并导入pUB/Bsd的EcoRV限制性位点。c.用于 hAAT 的表达质粒pGS116，pGS151质粒pGS116详细记载于EP1948789且含有人CMV启动子，接着是SV40剪接供体 /剪接受体位点、MAT-cDNA(SEQ ID NO :12)和SV40聚腺苷酸化位点。质粒pGS 151 (图2b)含有所述hAAT表达盒和SV40的DNA复制起点(ori)。 依靠 SV40DNA 和弓丨物 ori 1 (CCGGAATTCTTTGCAAAAGCCTAGGCCTC)(SEQ ID NO 9)和 ori 2(CCGGAATTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCT) (SEQID NO 10)，通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增 SV40序列，用EcoRI消化(每一种引物中包含一个EcoRI限制性位点)并导入pGS116的 EcoRI限制性位点。d.用于Epo的表达质粒pGS177质粒pGS127详细记载于EP1948789且含有人CMV启动子，接着是SV40剪接供体 /剪接受体位点、人红细胞生成素(Epo)的cDNA和SV40聚腺苷酸化位点。对于质粒pGS177，如上所述用引物ori 1和ori 2扩增SV40的ori片段并导入 PGS127。2.构建物的核实a.序列分析通过限制性消化检验了所有上文所述质粒的完整性。另外，通过序列分析确认T PGS151和PGS177中SV40ori片段的正确序列和取向。通过序列分析测定了 pSTK146、 PGS119和pGS122中的腺病毒序列，而且与Ad5野生型序列完全匹配。b.瞬时表达的检测将质粒pSTK146、pGS119和pGS122转染入HeLa细胞并使用单克隆抗体(Merck Bioscience)经 Western 印迹分析 ElA 和 ElB 蛋白的表达。将质粒 pGS158、pGS159、pGS161 转染入HEK293细胞并使用Wfestern印迹和单克隆抗体(Abcam，Cambridge, UK)检测T抗原的表达。将质粒PGS 116和pGS 151转染入CAP细胞并使用ELISA检测人α 1-抗胰蛋白酶(hAAT)的表达和进入培养物上清液的分泌(见6)。以相同方式，将质粒PGS127和pGS177转染入CAP细胞并使用ELISA检测人Epo 的表达(见6)。3.细胞的培养a.细胞系在^3SFMII 培养基(Invitrogen #11686-029)、0.5%抗霉菌药/抗生素 (Invitrogen#15240-062) ,4mM L-谷氨酰胺(Invitrogenii25O3O-O24)中于 37°C、95%湿度、8% CO2培养经过转化的羊水细胞(CAP和CAP-T)。CAP-T细胞的培养基另外含有5 μ g/ml 杀稻瘟素(InvitrOgen#R210-01)。通常在摇瓶中在12ml体积中以起始密度2- IO5细胞/ ml接种细胞并在振动式温箱中以IOOrpm培养3-4天。在1- IO6细胞/ml密度时通过离心来收获细胞，并进一步在新鲜的培养基中以上文所述的起始密度培养。在细胞培养皿中在含10%胎牛血清的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(高级D-MEM，hvitrogen#lM91_015) 中贴壁培养HEI^93、HEK293-T(ATCC#CRL-1U68)和HeLa细胞。使HEK293-T细胞逐步适应 293-SFMII培养基中的无血清悬浮生长并在摇瓶中以100rpm、37°C、95%湿度和8% CO2培养。b.原代羊水细胞遵循各例行方法，在羊膜穿刺过程中获得原代羊水细胞。将ι-aiii的此穿刺液在6cm Primaria细胞培养皿(Falcon)中用5ml Ham氏FlO培养基 (Invitrogen#31550-023)、10%胎牛血清、2% Ultroser G(CytoGen GmbH)、Ix 抗生素 / 抗霉菌(Invitrogen#15M0-062)于37°C、95%湿度和5% CO2培养。4-6天后，羊水细胞开始贴壁，添加3ml加添加剂的新鲜培养基(见前述组合)。细胞一旦完全贴壁就除去培养基并更换5ml加添加剂的新鲜培养基。为了进一步传代，用PBS清洗汇合的细胞，用胰蛋白酶 (TrypleSelect, Invitrogen#12563011)解离并分别转移入10和25ml加添加剂的新鲜培养基，分别在IOcm和15cm皿中。4.原代羊水细胞的转化a.转染通过用质粒pSTK146、pGS119或pGS122转染来转化每一份培养的原代羊水细胞(见北)。预先通过用合适的限制酶消化使各质粒线性化(pSTK146，pGS119 =ScaI ； PGS122 =PmeI)。在转染之前，使羊水细胞逐步适应含2 % Ultroser的Opti-Pro培养基 (Invitrogen#12309-019) 为此目的，每 2-3 天将每种细胞用 75 25 %,50 50%、 25 75%和O 100%比例的新鲜Ham氏FlO培养基(含添加剂，见3b)加Opti-Pro培养基 (含2% Ultroser)置换(spike)。为了转染，将一个大约80%汇合的15cm皿的细胞分配到
146cm皿上，相当于每个皿5-7x105个细胞的细胞数。次日，使用转染试剂Effectene (Qiagen) 依照制造商的方案用线性化的pSTK146、pGS119或pGS122每种2 μ g转染5个皿上的细胞。一个皿不进行转染，进一步培养。次日，用PBS清洗细胞，用Trypleklect解离并转移至15cm皿。将细胞再培养10-15天，其中每3-4天用新鲜培养基更换培养基。在此期间， Ultroser添加量降低至1%。约10-15天后，细胞汇合，如上所述将其转移至15cm皿。b.经转化的细胞克隆的分离转染后几周，在所有转染中均观察到在形态上与未转染羊水细胞显著不同的克隆细胞岛。挑取这些细胞岛并转移到M孔皿上(对应于第1代)。另外，繁殖细胞并首先转移至6cm皿，稍后至15cm皿。在使用单克隆抗体的^iestern印迹分析中检测到每种克隆细胞系中El蛋白的表达(见2b)。基于转染羊膜细胞细胞系的T-抗原-表达细胞系的制备在下文中示例性通过用 PGS119转染形成的细胞系(下面称为CAP-细胞系)来描述。分离和扩增克隆细胞岛后， 经“有限稀释法”通过单细胞克隆自细胞克隆生成遗传上一致的细胞系。概括地说，将要克隆一个细胞分配入96孔板，并在下面几天的过程中在显微镜下控制实际只有一个细胞的扩增。将自单细胞获得的系逐步扩增至15cm皿。通过用^3SFMII培养基逐步稀释培养液 Opti-Pro/1% Ultroser，使细胞适应无血清培养基中的悬浮生长。对单细胞系分析稳定和瞬时蛋白质表达和高生长密度，选择具有最好特性的一个克隆并继续用于后面的程序。5.表达T抗原的细胞池的生成用线性化pGS158、pGS159和pGS161质粒DNA各5 μ g转染每份IxlO7个CAP细胞(通过用质粒PGS119转染适应了无血清培养基中的悬浮生长而获得的原代羊水细胞)， 并在上文所述条件下摇瓶培养。为了选择稳定的经转染细胞，转染后48小时添加5μ g/ml 杀稻瘟素并进一步培养细胞直至约3-4周后获得稳定生长细胞池。将所述细胞池命名为 Z582(用pGS158转染，通过CAG启动子表达T抗原)、Z583(用pGS159转染，通过RSV启动子表达T抗原)和Z597 (用pGS161转染，通过CMV启动子表达T抗原)。由于不知道升高的T抗原浓度是否对CAP细胞潜在有毒性，试图依靠具有不同强度的启动子来表达T抗原。 结果能够表明，参照蛋白在CAP细胞中的表达在使用CMV启动子时最高，在使用CAG启动子时略低些，而在使用RSV启动子时明显更低。有可能所有三种启动子都生成稳定生长细胞池且所有三种细胞池都表达胞内T抗原。6. CAP和CAP-T细胞中的瞬时蛋白质表达与长度为63bp的最小限度ori相比，本文中使用的359bp ori片段除所述核心之外还含有21bp和72bp重复序列(SEQ ID NO :11)。这两种重复序列主要对于与ori重叠的启动子的功能确实是重要的，但是有线索提示它们还提高SV40DNA的复制 (Chandrasekharappa and Subramanian, J. Virol. 61, 2973-2980,1987).为了检验T抗原在细胞中的浓度是否对参照蛋白的表达有影响，检验了三种细胞池，Z582、Z583和Z597，其中T抗原在不同强度的启动子下表达，并与不表达T抗原的CAP 细胞中的瞬时表达比较。因此，依靠核转染技术(Amaxa/Lonza，程序X-001，缓冲液V)用环状质粒PGS151转染每种IxlO7个细胞并在起始体积12ml中培养。转染后3天和6天更换培养基，其中在第6天还将体积增大至15ml。自第3天开始直至并包括转染后第7天及在转染后第9天取出等份小样，测定细胞数并使用多克隆抗hAAT抗体(未偶联和偶联有HRP的；ICN Biomedicals)通过ELISA (酶联免疫吸附测定法)方法测定hAAT的表达。使用自人血浆纯化的hAAT(ICN Biomedicals)作为对照。此实验的结果图示于图3。在CAP-T的所有细胞池中获得了与CAP细胞相比更高的瞬时表达。Z582、Z583和Z597中的瞬时表达依次比CAP细胞高8倍、25倍和70倍。而且，通过CMV启动子来表达T抗原的第二个CAP-T细胞池显示了与用Z597获得的表达相当的高表达。所述数据证明了 T抗原在CAP细胞中的永久表达和T抗原表达的水平二者对瞬时表达的水平都有影响。在另一项实验中，测定了分别瞬时转染质粒pGS116和pGS151后细胞池Z597中 hAAT的瞬时表达水平。两个质粒的区别仅在于PGS151中存在SV40-ori片段。如上所述实施hAAT的转染和定量分析，其中测定了 9天时间范围里hAAT的表达水平和活细胞的细胞数的发展二者。所述检验的结果图示于图4。表达质粒中SV40-ori片段的存在导致瞬时表达升高30倍。IxlO7个CAP-T细胞在40ml体积里在9天内通过转染能表达总共2. 5mg hAAT。这对应于约60mg/L和多至40pg/细胞/天的表达效率。细胞生长在转染后约3天开始，细胞的生活力在检验的整个时间范围里继续保持在80%以上。为了证明所述瞬时表达效率不是hAAT特异性的，在CAP-T细胞中瞬时表达另一种高糖基化蛋白质红细胞生成素(Epo)。如关于hAAT所述，用质粒pGS177(含有Epo的表达盒和SV40-ori片段)转染IxlO7个Z597细胞池的CAP-T细胞并经ELISA (R&D Systems, Quantikine IVD,人Epo免疫测定法，DEP00)对细胞上清液中的Epo量化。能在7天的检验时间范围里以32mg/L的表达效率表达0. 73mg Epo。7.与其它细胞系统中的瞬时表达的比较一种先前早有记载的人细胞系，所谓的HEK293-T细胞系，稳定表达SV40T抗原且基于经腺病毒转化的人 HEK293 细胞系(DuBridge et al.，Mol. Cell. Biol. 7，379-387， 1987)。与Z597相当，依靠Amaxa nucleofektor技术依照制造商的方案(程序X-001，缓冲液V)用5 μ g环状质粒pGS151转染IxlO7个HEK293-T细胞(无血清培养基，悬浮培养) 并培养。所述实验的结果图示于图5。虽然第9天时^3-T的细胞数明显多于CAP-T的细胞数，但是CAP-T中的瞬时表达比293-Τ中的瞬时表达高约40倍。8.复制测定法在复制测定中应当显示CAP-T-细胞中T-抗原的表达是否导致含有ori的表达质粒的拷贝数升高，并因此解释显著提高的瞬时蛋白表达。因此，分别用质粒PGS116和 PGS151转染Z597T细胞和HEK293T细胞，并如上所述培养。6、12、24、48、72和96小时后， 取出每份IxlO5个细胞，离心，置于PBS中并通过添加相同体积的0. 8N NaOH来裂解。将细胞溶胞物在SlotBlot装置中在带正电荷的尼龙膜(GE Healthcare, Hybond-N+)上印迹。 将渐增量的质粒PGS116和pGS151添加至IxlO5个Z597细胞作为对照，如上所述裂解和印迹。所述标准对应于1000、2500、5000、10000和15000个拷贝每个细胞。通过将膜于120°C 温育30分钟来固定DNA并依靠由hAAT-cDNA构成的非放射性PCR探针依照制造商的方案 (AlkPhos Direct Labeling and Detection System,GE Healthcare,RPN 3680禾口3682)来显现。依靠标准质粒的已知浓度来定量经PGS116和pGS151转染的细胞中的拷贝数。所述复制测定法的结果图示于图6。正如预期的，只有PGS151在CAP-T Z597中复制，但是pGS116
16不复制。PGS151的拷贝数从转染后6小时的约1500个拷贝/细胞增多至转染后72小时的几乎7000个拷贝/细胞，而细胞数保持相同。与此相反，PGS151的拷贝数在HEK293-T中在96小时里保持恒定。由于293-T细胞的细胞数在所述时间跨度中已经加倍，因此可假设 PGS151在所述细胞中的复制低，然而，它明显低于Z597的复制速率。通过^festern印迹分析来检测对T抗原在羊水细胞细胞系和HEK293-T细胞中的表达。从三种CAP-T细胞池和HEK293-T细胞各取出IxlO6个细胞置于50 μ 1 50mM Tris/ HCl pH 8,140mM NaCl,0. 5%NP40,4mM EDTA, 2mMEGTA,0. 5mM PMSF，5%甘油中，并在冰上温育30分钟。将蛋白质混合物以13000rpm离心10分钟并用蛋白质检测试剂盒(Coomassie， Bradford, Thermo Life Science#23200)测定上清液中的蛋白质浓度。在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶上，将每种IOyg蛋白分开，并转移到硝酸纤维素膜(Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech)上并依靠T抗原特异性抗体(Abcam，抗SV40T抗原abl6879)来显现。 通过此实验可显示Z597中表达的T抗原比其它两个池和ΗΕΚ493-Τ细胞多。9.用聚乙撑亚胺转染由于上文所述转染方法只能有限地缩放规模，因此检验了另一种转染试剂，聚乙撑亚胺(PEI，P0lySCiences，#23966)，其据记载特别适合于大规模转染。依照制造商的方案以lmg/ml的浓度溶解线性PEI (MW = 25, 000)并以DNA PEI = 1 3的比例使用。为了转染，将10 μ g pGS151与30 μ g PEI混合，于室温温育10分钟并添加至6ml FreeStyle培养基(Invitrogen#12338-018)中的 IxlO7CAP-T Z597 细胞。5 小时后添加 6ml 293-SFMII 培养基并将细胞温育7天。转染后3天，用^3-SFMII更换培养基，同时鉴于细胞强力生长， 将体积增大至30ml。所述实验的结果显示于图7。通过用PEI转染，在CAP-T中实现了蛋白质的高瞬时表达。然而，蛋白质的最大产率比用核转染实现的表达低约2倍。值得注意的是用PEI转染后细胞生长明显更快且更强且在7天后实现比核转染高约10倍的细胞数。
权利要求
1.用于生成永久人羊水细胞细胞系的方法，包括a)用包含编码腺病毒基因功能ElA和ElB的核酸序列的核酸分子转染原代人羊水细胞，并b)随后用包含编码SV40大T抗原或埃巴二氏病毒(EBV)核抗原I(EBNA-I)的核酸序列的核酸分子转染步骤a)中获得的该永久人羊水细胞细胞系。
2.依照权利要求1的方法，其中编码腺病毒基因功能ElA和ElB的核酸序列是从人腺病毒，特别是人腺病毒血清型5衍生的。
3.依照权利要求2的方法，其中编码腺病毒基因功能ElA和ElB的核酸序列包含人腺病毒血清型5的核苷酸1至4344、505至3522或核苷酸505至4079。
4.依照权利要求1的方法，其中编码SV40大T抗原的核酸序列进一步包含选自CMV启动子、CAG启动子和RSV启动子的启动子的核酸序列，SV40SD/SA(内含子)的核酸序列和 SV40polyA的核酸序列，而编码埃巴二氏病毒(EBV)核抗原1 (EBNA-I)的核酸序列进一步包含选自CMV启动子、CAG启动子和RSV启动子的启动子的核酸序列，SV40SD/SA(内含子) 的核酸序列和SV40polyA的核酸序列。
5.依照前述权利要求中任一项的方法，其中使用已经永生化的人羊水细胞细胞系来代替步骤a)。
6.通过依照前述权利要求任一项的方法获得的永久人羊水细胞细胞系。
7.使用依照权利要求6的永久人羊水细胞细胞系来瞬时表达重组多肽和蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤a)用包含编码期望重组多肽或蛋白质和SV40大T抗原或埃巴二氏病毒(EBV)核抗原 1 (EBNA-I)的识别或结合位点的核酸序列的核酸分子转染所述永久人羊水细胞细胞系，b)在容许所述期望重组多肽或蛋白质表达的条件下培养步骤a)中获得的经过转染的永久人羊水细胞细胞系，并随后c)从该细胞或从该培养物上清液分离所述期望重组多肽或蛋白质。
8.依照权利要求7的方法，其中该重组多肽或蛋白质是激素、血浆因子、凝血因子、生长因子、细胞受体、融合蛋白、柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)、抗体、病毒、细菌或寄生物抗原或用于生成重组病毒的互补因子。
9.依照权利要求6的细胞用于生产多肽或蛋白质的用途。
10.通过依照权利要求7或8的方法可获得的多肽或蛋白质。
全文摘要
本发明涉及一种永久人细胞系，其包含腺病毒基因功能E1A和E1B的核酸序列和SV40大T抗原或埃巴二氏病毒(EBV)核抗原1(EBNA-1)的核酸序列。另外，本发明涉及一种用于在所述永久人细胞系中瞬时表达重组多肽和蛋白质的方法。
文档编号C12N5/079GK102369279SQ201080014527
公开日2012年3月7日 申请日期2010年2月5日 优先权日2009年2月5日
发明者C.沃尔珀斯, G.希德纳 申请人:塞维克制药有限责任公司