专利名称：一种采用透明带溶洞法去除小鼠卵母细胞核的方法
技术领域：
本发明涉及一种去除小鼠卵母细胞核的方法，具体的说是一种采用透明带溶洞法 去除小鼠卵母细胞核的方法。
背景技术：
随着生物技术的发展，哺乳动物体细胞核移植技术作为生产转基因动物、制作乳 腺生物反应器、治疗性克隆等前沿领域的一个不可替代的技术平台，虽然在绵羊、牛、猪和 小鼠上取得了巨大进展，但由于体细胞核移植的整个技术体系涉及众多环节，而且各个环 节效率低下，最终导致体细胞克隆技术的总体效率较低，还未超过10 %。通过显微操作构建 重组胚是核移植研究中普遍采用的经典方法，其中卵母细胞的去核是细胞核移植中的重要 步骤之一，也是能否成功完成核移植的一个重要限制因素，直接关系到核移植实验的成败。 一种快速、准确的去核方法将无疑会提高核移植技术的整体效率。小鼠作为是最为常用的 实验动物，然而，小鼠卵母细胞的特性与家畜(牛、羊和猪)差异很大。小鼠卵母细胞的直 径相对较小，透明带薄而软，这种特性使小鼠卵母细胞在显微操作去核时难度增大。传统的核移植技术中，主要是通过显微操作机械性去除卵母细胞中的染色质而获 得受体胞质，但存在耗费时间长、对细胞损伤大等缺点，而且第1极体与核的相对位置易变 动，以致去核率较低。目前，小鼠卵母细胞去核多借助Piezo装置，去核率高达99%，但这种 方法需要昂贵的仪器设备，同时对研究员有很高的技术要求，大多数实验室不易实现。而 且，所用针管也不能吸出极体，极体的存在将影响供体细胞和细胞质体的电融合。另外，还 有化学去核法，透明带穿孔挤压去核法，透明带磨口换平口针两步去核法等。不同的去核方 法有各自的优缺点，在操作时间、去核成功率、成本花费及损伤程度上有所不同。两步法操 作步骤繁琐，耗费时间长，对卵母细胞产生不利影响。穿孔挤压法极易导致细胞变形，胞质 散掉。而且有的去核方法技术要求很高，方法不易掌握，不利推广。
发明内容
本发明主要针对上述问题，而提供一种操作简便，消耗时间少，对细胞膜造成的损 伤小，成本低廉，去核成功率高的方法。本发明为解决上述问题，所采用的技术方案为 步骤一选取基础酸性台氏溶液，备用；
步骤二 酸性台氏溶液的改良利用浓度为36%的HCl调节酸性台氏溶液的pH值，后用 0. 22 μ m的微孔滤器进行过滤，于_20°C冻存，备用；
步骤三损伤微滴制备在规格为35mm的塑料皿中，将皿底均等划分为四个区域，在每 个区域内制作1个30 μ 1的显微操作液微滴，称中心微滴；在每个中心微滴外周滴加2个 20 μ 1的显微操作液和1个酸性台氏溶液微滴，形成周边微滴，后上面覆盖一层矿物油；
步骤四卵母细胞置于微滴中取性成熟的小鼠M II期的卵母细胞置于塑料皿的周边 显微操作液微滴中，在体视显微镜下用吸卵针洗涤5次，放入覆盖有矿物油的中心微滴，使每个中心微滴中至少含有15个含第1极体的卵母细胞；
步骤五调整显微操作针将塑料皿置于倒置相差荧光显微镜的显微操作台上，将固 定管和平口针安装在显微操作仪的固定杆上，调解螺旋，在倒置显微镜的视野中，观察到卵 母细胞、固定管和平口针处于同一水平线的位置；
步骤六去核在视野中找到卵母细胞、固定管和平口针，将卵母细胞置于固定管前 端，利用平口针吸取酸性台氏溶液，后将平口针移至含有卵母细胞的中心微滴中，利用平口 针调整第1极体的位置，使平口针的针口位于第1极体透明带前端，使固定管、卵母细胞第 一极体、平口针针口处于同一水平线位置，吹出平口针管内的酸性台氏溶液与透明带反应， 至透明带变薄变软，胞质向外凸时止，打开显微镜的荧光以指示细胞核位置，回旋平口针注 射器，使其产生负压，吸出第1极体及其周围的胞质，去核结束；
步骤七去核后卵母细胞活性鉴定将去过核的卵母细胞置于0. 3%台盼蓝染色液中， 染色3—4分钟，后用M2液洗涤4一6次，在体视显微镜下查检染色情况，蓝染者判定为死亡， 不着色者判定为存活。所述的酸性台氏溶液由NaCl、KCl、CaCl2 · H2CKMgCl2 · H20、葡萄糖、聚乙烯基吡咯 烷酮和超纯水组成，各成份的重量百分比为NaCl 0. 8%,KCl 0. 02% ,CaCl2 ·Η20 0. 024%、 MgCl2 · H2O 0. 01%、葡萄糖0. 1%、聚乙烯基吡咯烷酮0. 4%，余量为超纯水。所述的超纯水为去除水中的导电介质、不离解的胶体物质、气体及有机物，其电阻 率大于18ΜΩ*ο 。所述的礼液的主要成分为在IOml的超纯水中加入0. 5533g的NaCl, 0. 0356g的 KCl, 0.4969g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0. 0036g的丙酮酸钠，0. 261g的乳酸钠，0. 4g的
牛血清白蛋白，余量为超纯水。所述的0.3%台盼蓝染色液为称取0.03g台盼蓝，将其溶于IOml的M2液中， 0. 22 μ m的微孔滤器过滤除菌，-20°c冻存备用。所述的显微操作液为基础的M2液添加5 μ g/ml的细胞松弛素Β、5 μ g/ml Hoechst 33；342、10%的胎牛血清、0. 01%的聚乙烯醇。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛，是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有各种 血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等细胞生长必须的营养成份，对 动物细胞体外生长发育具有极为重要。Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低，常用 于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。本发明的有益效果
1.设备简易无需昂贵的Piezo装置，在显微操作仪下即可完成去核操作；
2.试剂(酸性台氏溶液)成份简单绝大部分为无机试剂，易于购买，配置简单，成本低
廉；
3.操作难度低，易掌握只需将去核针口对准透明带，轻轻释放少许酸性台氏溶液，将 其溶解出一个小孔洞，再将去核针顺势插入这个孔洞吸出极体及细胞核即可，操作难度比 其它去核方法小得多，初学者就能很快掌握；
4.去核操作轻柔，机械损伤小在卵母细胞相对安静状态下既能完成去核损伤，克服 了其它去核方法将卵母细胞挤压变形去核时对细胞骨架及细胞膜所带来的机械损伤；5.去核快，效率高平均每个卵母细胞去核所用时间为1一6秒，卵母细胞的去核后存 活率均在97%以上，去核成功率在99%以上；
6.去核液细胞毒性小，缓冲能力强去核操作在M2液中进行，不需加入专用的去核试 剂，细胞毒性小；另外，M2液里面的缓冲成分能中和酸性台氏溶液中多余的H+,稳定去核过 程中操作液的PH值不发生剧烈变化，从而保护卵母细胞活性免受酸碱度变化的侵害。
图1显微操作微滴图2透明带溶洞前卵母细胞图； 图3透明带溶洞后卵母细胞图； 图4去核卵母细胞图； 图5去核卵母细胞台盼蓝染色图。
具体实施例方式实施例一
步骤一选取基础酸性台氏溶液，备用；
步骤二 酸性台氏溶液的改良利用浓度为36%的HCl调节酸性台氏溶液的pH值为 1. 5，后用0. 22 μ m的微孔滤器进行过滤，于-20°C冻存，备用；
步骤三损伤微滴制备在规格为35mm的塑料皿中，将皿底均等划分为四个区域，在每 个区域内制作1个30 μ 1的显微操作液微滴，称中心微滴；在每个中心微滴外周滴加2个 20 μ 1的显微操作液和1个酸性台氏溶液微滴，形成周边微滴，后上面覆盖一层矿物油；
步骤四卵母细胞置于微滴中取性成熟的小鼠M II期的卵母细胞置于塑料皿的周边 显微操作液微滴中，在体视显微镜下用吸卵针洗涤5次，放入覆盖有矿物油的中心微滴，使 每个中心微滴中含有17个含第1极体的卵母细胞；
步骤五调整显微操作针将塑料皿置于倒置相差荧光显微镜的显微操作台上，将固 定管和平口针安装在显微操作仪的固定杆上，调解螺旋，在倒置显微镜的视野中，观察到卵 母细胞、固定管和平口针处于同一水平线的位置；
步骤六在视野中找到卵母细胞、固定管和平口针，将卵母细胞置于固定管前端，利用 平口针吸取PH值为1.5的酸性台氏溶液，后将平口针移至含有卵母细胞的中心微滴中，利 用平口针调整第1极体的位置，使平口针的针口位于第1极体透明带前端，使固定管、卵母 细胞第一极体、平口针针口处于同一水平线位置，吹出平口针管内的酸性台氏溶液与透明 带反应，至透明带变薄变软，胞质向外凸时止，打开显微镜的荧光以指示细胞核位置，回旋 平口针注射器，使其产生负压，吸出第1极体及其周围的胞质，去核结束；
步骤七去核后卵母细胞活性鉴定将去过核的卵母细胞置于0. 3%台盼蓝染色液中， 染色4分钟，后用M2液洗涤6次，在体视显微镜下查检染色情况，蓝染者判定为死亡，不着 色者判定为存活，去核成功率为99. 8%，去核后存活率为97. 3%。实施例二
步骤一选取基础酸性台氏溶液，备用；
步骤二 酸性台氏溶液的改良利用浓度为36%的HCl调节酸性台氏溶液的pH值为2. 0，后用0. 22 μ m的微孔滤器进行过滤，于_20°C冻存，备用；
步骤三损伤微滴制备在规格为35mm的塑料皿中，将皿底均等划分为四个区域，在每 个区域内制作1个30 μ 1的显微操作液微滴，称中心微滴；在每个中心微滴外周滴加2个 20 μ 1的显微操作液和1个酸性台氏溶液微滴，形成周边微滴，后上面覆盖一层矿物油；
步骤四卵母细胞置于微滴中取性成熟的小鼠M II期的卵母细胞置于塑料皿的周边 显微操作液微滴中，在体视显微镜下用吸卵针洗涤5次，放入覆盖有矿物油的中心微滴，使 每个中心微滴中含有16个含第1极体的卵母细胞；
步骤五调整显微操作针将塑料皿置于倒置相差荧光显微镜的显微操作台上，将固 定管和平口针安装在显微操作仪的固定杆上，调解螺旋，在倒置显微镜的视野中，观察到卵 母细胞、固定管和平口针处于同一水平线的位置；
步骤六在视野中找到卵母细胞、固定管和平口针，将卵母细胞置于固定管前端，利用 平口针吸取PH值为2. 0的酸性台氏溶液，后将平口针移至含有卵母细胞的中心微滴中，利 用平口针调整第1极体的位置，使平口针的针口位于第1极体透明带前端，使固定管、卵母 细胞第一极体、平口针针口处于同一水平线位置，吹出平口针管内的酸性台氏溶液与透明 带反应，至透明带变薄变软，胞质向外凸时止，打开显微镜的荧光以指示细胞核位置，回旋 平口针注射器，使其产生负压，吸出第1极体及其周围的胞质，去核结束；
步骤七去核后卵母细胞活性鉴定将去过核的卵母细胞置于0. 3%台盼蓝染色液中， 染色3. 5分钟，后用M2液洗涤5次，在体视显微镜下查检染色情况，蓝染者判定为死亡，不 着色者判定为存活，去核成功率为99. 3%，去核后存活率为97. 4%。
实施例三
步骤一选取基础酸性台氏溶液，备用；
步骤二 酸性台氏溶液的改良利用浓度为36%的HCl调节酸性台氏溶液的ρΗ值为 2. 5，后用0. 22 μ m的微孔滤器进行过滤，于-20°C冻存，备用；
步骤三损伤微滴制备在规格为35mm的塑料皿中，将皿底均等划分为四个区域，在每 个区域内制作1个30 μ 1的显微操作液微滴，称中心微滴；在每个中心微滴外周滴加2个 20 μ 1的显微操作液和1个酸性台氏溶液微滴，形成周边微滴，后上面覆盖一层矿物油；
步骤四卵母细胞置于微滴中取性成熟的小鼠M II期的卵母细胞置于塑料皿的周边 显微操作液微滴中，在体视显微镜下用吸卵针洗涤5次，放入覆盖有矿物油的中心微滴，使 每个中心微滴中含有15个含第1极体的卵母细胞；
步骤五调整显微操作针将塑料皿置于倒置相差荧光显微镜的显微操作台上，将固 定管和平口针安装在显微操作仪的固定杆上，调解螺旋，在倒置显微镜的视野中，观察到卵 母细胞、固定管和平口针处于同一水平线的位置；
步骤六在视野中找到卵母细胞、固定管和平口针，将卵母细胞置于固定管前端，利用 平口针吸取PH值为2.5的酸性台氏溶液，后将平口针移至含有卵母细胞的中心微滴中，利 用平口针调整第1极体的位置，使平口针的针口位于第1极体透明带前端，使固定管、卵母 细胞第一极体、平口针针口处于同一水平线位置，吹出平口针管内的酸性台氏溶液与透明 带反应，至透明带变薄变软，胞质向外凸时止，打开显微镜的荧光以指示细胞核位置，回旋 平口针注射器，使其产生负压，吸出第1极体及其周围的胞质，去核结束；
步骤七去核后卵母细胞活性鉴定将去过核的卵母细胞置于0. 3%台盼蓝染色液中，染色3分钟，后用M2液洗涤4次，在体视显微镜下查检染色情况，蓝染者判定为死亡，不着 色者判定为存活，去核成功率为99. 1%，去核后存活率为97. H
权利要求
1.一种采用透明带溶洞法去除小鼠卵母细胞核的方法，其特征在于去核方法为 步骤一选取基础酸性台氏溶液，备用；步骤二 酸性台氏溶液的改良利用浓度为36%的HCl调节酸性台氏溶液的PH值，后用 0. 22 μ m的微孔滤器进行过滤，于_20°C冻存，备用；步骤三损伤微滴制备在规格为35mm的塑料皿中，将皿底均等划分为四个区域，在每 个区域内制作1个30 μ 1的显微操作液微滴，称中心微滴；在每个中心微滴外周滴加2个 20 μ 1的显微操作液和1个酸性台氏溶液微滴，形成周边微滴，后上面覆盖一层矿物油；步骤四卵母细胞置于微滴中取性成熟的小鼠M II期的卵母细胞置于塑料皿的周边 显微操作液微滴中，在体视显微镜下用吸卵针洗涤5次，放入覆盖有矿物油的中心微滴，使 每个中心微滴中至少含有15个含第1极体的卵母细胞；步骤五调整显微操作针将塑料皿置于倒置相差荧光显微镜的显微操作台上，将固 定管和平口针安装在显微操作仪的固定杆上，调解螺旋，在倒置显微镜的视野中，观察到卵 母细胞、固定管和平口针处于同一水平线的位置；步骤六去核在视野中找到卵母细胞、固定管和平口针，将卵母细胞置于固定管前 端，利用平口针吸取酸性台氏溶液，后将平口针移至含有卵母细胞的中心微滴中，利用平口 针调整第1极体的位置，使平口针的针口位于第1极体透明带前端，使固定管、卵母细胞第 一极体、平口针针口处于同一水平线位置，吹出平口针管内的酸性台氏溶液与透明带反应， 至透明带变薄变软，胞质向外凸时止，打开显微镜的荧光以指示细胞核位置，回旋平口针注 射器，使其产生负压，吸出第1极体及其周围的胞质，去核结束；步骤七去核后卵母细胞活性鉴定将去过核的卵母细胞置于0. 3%台盼蓝染色液中， 染色3—4分钟，后用M2液洗涤4一6次，在体视显微镜下查检染色情况，蓝染者判定为死亡， 不着色者判定为存活。
2.根据权利要求1所述的一种采用透明带溶洞法去除小鼠卵母细胞核的方法，其特征 在于所述的酸性台氏溶液由NaCl、KC1、CaCl2 · H2O, MgCl2 · H20、葡萄糖、聚乙烯基吡咯烷 酮和超纯水组成，各成份的重量百分比为NaCl 0. 8%, KCl 0. 02%、CaCl2 · H2O 0. 024%、 MgCl2 · H2O 0. 01%、葡萄糖0. 1%、聚乙烯基吡咯烷酮0. 4%，余量为超纯水。
3.根据权利要求1所述的一种采用透明带溶洞法去除小鼠卵母细胞核的方法，其特征 在于所述的改良后的酸性台氏溶液的PH值为1. 5或2. 0。
全文摘要
一种采用透明带溶洞法去除小鼠卵母细胞核的方法，在塑料皿中做中心微滴和周边微滴，显微镜下用酸性台氏溶液与透明带反应，在1—6秒后使透明带上溶解出一个孔洞，至透明带变薄变软，胞质向外凸时止，吸出第1极体及周围胞质，释放卵母细胞，去核后用台盼蓝染色观察完整性，去核成功率大于99.1%。本发明的制备方法所用设备简易，在显微操作仪下即可完成去核操作；试剂成份简单，配置简单，成本低廉，操作难度低，易掌握，去核操作轻柔，机械损伤小，去核快，效率高平均每个卵母细胞去核所用时间为1—6秒，卵母细胞的去核后存活率均在97％以上，去核成功率在99％以上；本方法适用于无Piezo实验室的小鼠核移植研究及其胚胎发育相关的早期事件研究。
文档编号C12N5/075GK102127521SQ20101060499
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月25日 优先权日2010年12月25日
发明者付祥龙, 刘凤军, 张玉玲, 禹学礼, 翟小伟, 陈晓丽, 靳丽军 申请人:河南科技大学