专利名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒rt-pcr检测方法和试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术，尤其涉及动物疫病的预防控制。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) ^filtMM^Bf^^'nin^!^ (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸 障碍等为临床特征的疾病。1991年，荷兰学者Terpstra等人在感染猪体内分离到欧洲型 PRRSV，命名为Lelystad病毒(Lv)；同年，美国学者Benfield等人分离到美洲型PRRSV，命 名为VR-2332。目前猪繁殖与呼吸综合征已经在世界范围内流行，每年造成巨大的经济损 失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速蔓延。2006年我国暴发了由猪繁殖与呼吸综 合征高致病性变异毒株(highly pathogenicPRRSV, HP-PRRSV)引起的以体温高、发病率 高、死亡率高为主要临床特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(highly pathogenic PRRS, HP-PRRQ，给我国养猪业造成了极其严重的打击。传统的PRRSV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验 (IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和反转录-聚合酶 链反应试验(RT-PCR)等，目前较为广泛使用的用来检测PRRSV的方法为RT-PCR，但多数方 法在敏感性、特异性等方面存在不足，因此，建立一种特异性强、敏感性高、可靠性好的猪繁 殖与呼吸综合征病毒的检测方法意义重大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的 RT-PCR检测方法。此方法快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好，为猪繁殖与呼吸综合征 病毒疫情的监测、防控提供强有力的技术支持。本申请涉及针对PRRSV美洲型、欧洲型毒株0RF7和3，UTR的引物对，用于检测猪 繁殖与呼吸综合征病毒。引物序列如下上游引物5，-GAATGGCCAGCCAGTCAATC-3，下游引物5，-GTCGCCCTAATTGAATAGGTGAC-3，本申请提供一种能够特异、敏感、省时、省力、低成本地检测出PRRSV的RT-PCR试 剂盒以及一种检测PRRSV的方法。具体的，该试剂盒包括(1) RNA提取试剂由裂解液6mL、洗液12mL和洗脱液ImL组成。(2) RT-PCR反应试剂由RT-PCR反应液200 μ L、酶混合液15 μ L和矿物油300 μ L组成。(3)电泳检测试剂由50 X TAE电泳缓冲液20mL、染色液20 μ L、上样缓冲液50 μ L组成。
(4)阴性对照350 μ L、阳性对照350 μ L。
以上试剂的基本制备方法为
1)裂解液按下列配方配制
异硫氰酸胍11. 82g
氯化钠1. 16g
0. 5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液2mL
灭菌双蒸水加至IOOmL
2)洗液按下列配方配制
磷酸氢二钠71. 6g
磷酸二氢钾31. 2g
氯化钠9g
灭菌双蒸水加至IOOOmL
3)洗脱液按下列配方配制
磷酸氢二钠71. 6g
磷酸二氢钾31. 2g
灭菌双蒸水加至IOOOmL
4) RT-PCR反应液按下列配方配制
A)无菌 DEPC 水 12. 5yL
B) 2. 5mmol/L dNTP 2· 5 μ L (购自 Promega 公司，dATP、dCTP、dGTP、dTTP (统称为
dNTP)浓度均为100mmol/L。将dATP、dCTP、dGTP、dTTP等体积混勻后，再用DEPC水稀释10 倍，即为制备的2. 5mmol/L dNTP)C) IOpmol/ μ L 引物混合液 1. 5 μ LD) 5 X Green Go Taq Reaction Buffer 5 μ L (购自 Promega 公司 5mL/ 管)5)酶混合液按下列配方配制Taq DNA 聚合酶(100U/ 管，5U/ μ L，购自 Promega 公司)IyLRNA 酶抑制剂 Q50 μ L/ 管，50U/ μ L，购自 Promega 公司) 0. 3 μ LAMV 反转录酶(1000 μ L/管，IOU/μ L，购自 Promega 公司) 0. 2 μ L6)上样缓冲液溴酚蓝0. 2g，加双蒸水IOmL过夜溶解。50g蔗糖加入50mL水溶 解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇勻用双蒸馏水定容至lOOmL。7) 50 X TAE电泳缓冲液按下列配方配制三羟甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸7. ImL0. 5mol/L EDTA 溶液(ρΗ8· 0)IOOmL灭菌双蒸水加至IOOOmL8)染色液按下列配方配制溴化乙锭0. 2g灭菌双蒸水加至20mL9)矿物油购自Sigma 公司，500mL/ 瓶
本申请还提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括样品处理组织样品处理采集猪的肺、扁桃体、脑等脏器组织，称取待检组织0. 05g于研磨 器中研磨，加入1. 5mL生理盐水继续研磨，待勻浆后转至1. 5mL灭菌离心管中，8000rmp离心 2min,取上清液100 μ L于1. 5mL灭菌离心管中。细胞培养物处理取细胞培养物100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。血清样品处理取猪血清100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。阳性对照处理取阳性对照100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。阴性对照处理取阴性对照100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。病毒RNA提取取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600 μ L，充分颠倒混勻， 室温静置3 5min。将全部液体吸入吸附柱中，吸附柱要套上收集管，13000rmp离心30s， 弃去收集管中液体，套上收集管。向吸附柱中加入600 μ L洗液，13000rmp离心30s，弃去收 集管中液体，套上收集管。向吸附柱中加入600 μ L洗液，13000rmp离心30s，弃去收集管中 液体，套上收集管，13000rmp离心aiiin。将吸附柱移入新的1. 5mL离心管中，在膜中央加入 洗脱液25 μ L，室温静置lmin，13000rmp离心30s，获得总RNA。RT-PCR操作程序每份总体积20 μ L。取16. 8 μ L RT-PCR反应液(用前混勻)、1. 2 μ L酶混合液， 2 μ L样品RNA0例如:η份样品(η < 10)，配制η+1份16. 8 X (n+1) RT-PCR反应液，再加入 1.2Χ(η+1)酶混合液，混勻，取18yL分装成η份，分别加入2yL样品RNA。作好标记，加 入矿物油20 μ L覆盖(有热盖的PCR扩增仪不用加矿物油)，在PCR扩增仪上进行以下循 环42°C 45min,95°C 3min ；扩增条件为 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；35 个循环后，72°C延 伸 IOmin0电泳称3g琼脂糖放于500mL锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液200mL(取 4mL 50倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至200mL)，于微波炉中熔解，再加入10 μ L染色液 混勻。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物15yL混合3yL 上样缓冲液，点样与琼脂糖凝胶孔中，以(110 120) V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液 中电泳，紫外灯下观察结果。结果判定在阳性对照出现436bp或401bp扩增带、阴性对照无条带带出现(引物带除外) 时，实验结果成立。被检样品出现436bp扩增条带时为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，出 现401bp扩增条带时为欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，否则为阴性。
图1 :PRRSV美洲株扩增序列图2 =PRRSV欧洲株扩增序列图3 =RT-PCR检测PRRSV欧洲株和美洲株电泳结果，注1. NM191株(PRRSV欧洲 株)2. VR2332 株(PRRSV 美洲株)3. Trans2K DNA Marker
图4 =RT-PCR检测部分PRRSV样品电泳结果，注1. NM191株(PRRSV欧洲株)2. DX F5 (PRRSV 欧洲株)3. VR2332 株(PRRSV 美洲株)4. HB2 株(PRRSV 美洲株)5. 09 当阳 毒株(PRRSV美洲株)6. 09阳谷毒株(PRRSV美洲株)7. 06HBB2株(PRRSV美洲株)8. JXAl F90 株(PRRSV 美洲株)9. 09 商丘 F5 (PRRSV 美洲株)10. KT2010009 (PRRSV 美洲株)11. KY20090914 (PRRSV美洲株)12. PRRSV CH-IR疫苗(PRRSV美洲株)13.阴性对照14.阳性对 照(PRRSV 美洲株)15. Trans2K DNAMarker
具体实施例方式实施例1一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，按下表组装
名称(10份/盒)_数量
裂解液6mL
洗液12mL
洗脱液ImL
吸附柱和收集管10套
刚性对照350(iL矿物油300μ 50χΤΑΕ电泳缓冲液20mL 染色液20|uL 上样缓冲液50μ 阳性对照350|aL 酶混合液15μ RT-PCR 反应液_200pL1.病毒株病毒株背景高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus, PRRSV)为PRRSV高致病性变异株由中国动物疫病预 防控制中心分离鉴定的NVDC-JXA1毒株，保藏编号为CGMCC No. 1964，涉及的专利号为 ZL200710086549. 7。阴性对照样品的制备，取灭菌的DEPC水，置_20°C冰箱保存。阳性对照样品的制备，将Marc-145细胞培养的NVDC-JXAl毒株，60°C灭活30min， 用合格的本试剂盒检测，出现特异的扩增带，为阳性。其余的培养毒放于_70°C保存备用。2试剂盒中主要成分的制备2. 1裂解液的制备异硫氰酸胍11.82g氯化钠浓度1. 16g0079]
0080] 0081] 0082]
0083]
0084]
0085]
0086]
0087]
0088]
0089]
0090]
0091]
0092]
0093]
0094]
0095]
0096]
0097]
0098]
0099]
0100] 0101] 0102]
0103]
0104]
0105]
0106]
0107]
0108]
0109]
0110] 0111] 0112]
0113]
0114]
0115]
0116] 0117]
0. 5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液 2mL 灭菌双蒸水加至IOOmL
2. 2洗液的制备
磷酸氢二钠71. 6g
磷酸二氢钾31. 2g
氯化钠9g
灭菌双蒸水加至IOOOmL
2. 3洗脱液的制备
磷酸氢二钠71. 6g
磷酸二氢钾31. 2g
灭菌双蒸水加至IOOOmL
2. 4酶混合液的制备 按下列配方配制酶混合液 Taq DNA 聚合酶(100U/管，5U/
μ L，购自Promega公司)
1 μ L
RNA 酶抑制剂(250 μ L/ 管，50U/ μ L，购自 Promega 公司)0. 3 μ L
AMV 反转录酶(1000 μ L/ 管，IOU/ μ L，购自 Promega 公司)0. 2 μ L
2. 5RT-PCR反应液的制备
按下列配方配制RT反应液
无菌 DEPC 水12. 5yL
2. 5mmol/L dNTP2. 5 μ L
IOpmol/ μ L引物混合液1. 5 μ L
5X Green Go Taq Reaction Buffer 5 μ L
混勻后，用0. 22 μ m滤膜过滤。_20°C保存，检验合格后分装，用于成品试剂盒t 2. 650 X TAE电泳缓冲液的制备
0. 5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(ρΗ8· 0)配制
EDTA18.61g
灭菌双蒸水80mL
氢氧化钠调pH至8. 0
灭菌双蒸水加至IOOmL
50 X T AE电泳缓冲液配制
三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242g
冰乙酸57. ImL
0. 5mol/L EDTA 溶液(ρΗ8· 0) IOOmL
灭菌双蒸水加至IOOOmL
使用时灭菌双蒸水稀释50倍。
2. 7染色液的制备
溴化乙锭0. 2g
灭菌双蒸水加至20mL
2. 8上样缓冲液的制备
溴酚蓝0.2g，加双蒸水IOmL过夜溶解。50g蔗糖加入50mL水溶解后，移入已溶解 的溴酚蓝溶液中，摇勻用双蒸馏水定容至100mL。2. 9矿物油的制备购自Sigma 公司，500mL/瓶。实施例2一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR方法，包括1.样品来源中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室(农业部兽医诊断中心)提供如下组织、 血清和PRRSV细胞培养物2006-2010年不同时期高致病性猪繁殖与呼吸综合征野毒细胞 培养物6份；美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株细胞培养物3份、欧洲型猪繁殖与呼吸 综合征病毒细胞培养物2份，各种PRRSV疫苗6份；临床样品7份，包括阳性血清1份，阴性 血清4份、阳性组织2份。2.样品处理组织样品处理称取待检组织0. 05g于研磨器中研磨，加入1. 5mL生理盐水继续研 磨，待勻浆后转至1. 5mL灭菌离心管中，8000rmp离心2min，取上清液100 μ L于1. 5mL灭菌
离心管中。细胞培养物处理取细胞培养物100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。血清样品处理取猪血清100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。阳性对照处理取阳性对照100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。阴性对照处理取阴性对照100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。3.病毒RNA提取取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600 μ L，充分颠倒混勻， 室温静置3 5min。将全部液体吸入吸附柱中，吸附柱要套上收集管，13000rmp离心30s， 弃去收集管中液体，套上收集管。向吸附柱中加入600 μ L洗液，13000rmp离心30s，弃去收 集管中液体，套上收集管。向吸附柱中加入600 μ L洗液，13000rmp离心30s，弃去收集管中 液体，套上收集管，13000rmp离心aiiin。将吸附柱移入新的1. 5mL离心管中，在膜中央加入 洗脱液25 μ L，室温静置lmin，13000rmp离心30s，获得总RNA。4. RT-PCR 操作程序每份总体积20 μ L。取16. 8 μ L RT-PCR反应液(用前混勻)、1. 2 μ L酶混合液， 2 μ L样品RNA0例如:η份样品(η < 10)，配制η+1份16. 8 X (n+1) RT-PCR反应液，再加入 1.2Χ(η+1)酶混合液，混勻，取18yL分装成η份，分别加入2yL样品RNA。作好标记，加 入矿物油20 μ L覆盖(有热盖的PCR扩增仪不用加矿物油)，在PCR扩增仪上进行以下循 环42°C 45min,95°C 3min ；扩增条件为 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；；35 个循环后，72°C延 伸 IOmin05.电泳称3g琼脂糖放于500mL锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液200mL(取 4mL 50倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至200mL)，于微波炉中熔解，再加入10 μ L染色液 混勻。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物15yL混合3yL 上样缓冲液，点样与琼脂糖凝胶孔中，以(110 120) V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。6.结果判定在阳性对照出现436bp或401bp扩增带、阴性对照无条带带出现(引物带除外) 时，实验结果成立。被检样品出现436bp扩增条带时为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，出 现401bp扩增条带时为欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，否则为阴性。7.结果所有样品的判断结果均与样品背景相符合。PRRSV阳性样品的RT-PCR扩增产物经 琼脂糖凝胶电泳可见特异性扩增片段的条带；PRRSV阴性样品的RT-PCR扩增产物经琼脂糖 凝胶电泳后除弓I物带外，无其他条带。实施例3敏感度试验1.材料PRRSV 分离株 PRRSV/JXAl F5 (TCID50 = 5. 25)2.方法将PRRSV 分离株 PRRSV/JXAl F5 稀释成 10人 1(Γ2、1(Γ3、1(Γ4、1(Γ5、1(Γ6、1(Γ7，用猪繁 殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒检测每个稀释度样品。3.结果试剂盒对不同浓度的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV/JXAl F5 (TCID50 = 5. 25)) 的检测结果见表2。表2敏感性试验结果实施例4特异性试验1.材料其它猪源或异源病毒毒株马动脉炎病毒(EAV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎 病毒(JEV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、PRRSV标准株(VR2332毒株)，由本单位保存。2.方法用猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒检测4株其它猪源或异源病毒毒 株4份，1份PRRSV标准株VR2332毒株，以考查试剂盒检测不同样品的特异性。3.结果用猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒其它猪源或异源病毒毒株，结果 均为阴性，结果见表3。表3特异性试验结果
权利要求
1.一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对，其特征在于引物序列如下上游引物5，-GAATGGCCAGCCAGTCAATC-3，下游引物5’ -GTCGCCCTAATTGAATAGGTGAC-3，
2.一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于包括如权利要求1所 述的引物对。
3.如权利要求2所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于上述 试剂盒还包括RNA提取试剂、RT-PCR反应试剂、电泳检测试剂、阴性对照、阳性对照。
4.如权利要求2-3之一所述的试剂盒，其特征在于(1)RNA提取试剂由裂解液6mL、洗液12mL和洗脱液ImL组成(2)RT-PCR反应试剂由RT-PCR反应液200 μ L、酶混合液15 μ L和矿物油300 μ L组成(3)电泳检测试剂由50X TAE电泳缓冲液20mL、染色液20 μ L、上样缓冲液50 μ L组成(4)阴性对照350μ L、阳性对照350 μ L。
5.权利要求2-4任一项所述的试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的用途。
6.利用权利要求2-4任一项的试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括(1)样品处理组织样品处理采集猪的肺、扁桃体、脑等脏器组织，称取待检组织0. 5g于研磨器中研 磨，加入1. 5mL生理盐水继续研磨，待勻浆后转至1. 5mL灭菌离心管中，8000rmp离心anin， 取上清液100 μ L于1. 5mL灭菌离心管中。细胞培养物处理取细胞培养物100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。血清样品处理取猪血清100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。阳性对照处理取阳性对照100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。阴性对照处理取阴性对照100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。(2)病毒RNA提取取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600 μ L，充分颠倒混勻，室温 静置3 5min。将全部液体吸入吸附柱中，吸附柱要套上收集管，13000rmp离心30s，弃去 收集管中液体，套上收集管。向吸附柱中加入600 μ L洗液，13000rmp离心30s，弃去收集管 中液体，套上收集管。向吸附柱中加入600 μ L洗液，13000rmp离心30s，弃去收集管中液体， 套上收集管，13000rmp离心aiiin。将吸附柱移入新的1. 5mL离心管中，在膜中央加入洗脱 液25 μ L，室温静置lmin, 13000rmp离心30s,获得总RNA0(3)RT-PCR操作程序每份总体积20 μ L。取16. 8 μ L RT-PCR反应液(用前混勻)、1. 2 μ L酶混合液，2 μ L 样品RNA。例如η份样品(η < 10)，配制η+1份16. 8 X (n+1) RT-PCR反应液，再加入 1.2Χ(η+1)酶混合液，混勻，取18μ L分装成η份，分别加入2μ L样品RNA。作好标记，加 入矿物油20 μ L覆盖(有热盖的PCR扩增仪不用加矿物油)，在PCR扩增仪上进行以下循 环42°C 45min,95°C 3min ；扩增条件为 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；35 个循环后，72°C延 伸 IOmin0(4)电泳称3g琼脂糖放于500mL锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液200mL (取4mL 50 倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至200mL)，于微波炉中熔解，再加入IOyL染色液混勻。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物15 μ L混合3 μ L上样缓 冲液，点样与琼脂糖凝胶孔中，以(110 120) V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳， 紫外灯下观察结果。 (5)结果判定在阳性对照出现436bp或401bp扩增带、阴性对照无条带带出现(引物带除外)时， 实验结果成立。被检样品出现436bp扩增条带时为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，出现 401bp扩增条带时为欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，否则为阴性。
7.权利要求6所述的方法在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测的方法，以及该方法在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。本发明的方法克服了其他同类检测技术中存在的不足，具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，适于猪繁殖与呼吸综合征美洲型毒株和欧洲型毒株的快速检测，为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。
文档编号C12Q1/70GK102140525SQ20101060208
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者倪建强, 孙明, 宁昆, 曲萍, 田克恭, 翟新验, 陈西钊, 韩雪 申请人:中国动物疫病预防控制中心