专利名称：绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA及其克隆方法和重组应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及绵羊IFN-Y诱导的溶酶体巯基还原酶 cDNA及其克隆、表达技术。
背景技术：
GILT ( Y-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶)是1988年由Luster等人发现的。 GILT是以可溶性糖蛋白前体的形式被甘露糖-6-磷酸受体传递到胞吞途径后，N-和C-端 前肽被切割形成30KDa成熟形式。以II型组织相容性抗原复合物(MHC class II)为基础的 抗原呈递需要将天然蛋白加工成短肽以适合MHC的结合和T细胞受体(TCR)的识别。抗原 呈递细胞中进行的抗原抗原的变性、去折叠、二硫键还原及蛋白水解。在整个加工途径中， 二硫键的还原是关键步骤。30kDa GILT具有催化二硫键还原的活性，因此能够促进天然蛋 白抗原的去折叠和进一步的蛋白酶解。GILT在抗原呈递细胞组成型表达，在成纤维细胞、内 皮细胞和角蛋白细胞等细胞中可被IFN-Y诱导表达。在专门的抗原呈递细胞如B细胞和 巨噬细胞中，GILT在较低的pH条件下有较高的活性，并且被证明在抗原加工及免疫显性 表位的显示中起着重要的作用。此外，GILT在中和胞外的病原体和清除感染的细胞碎片方 面也有作用。GILT的缺失可能影响到对病毒、肿瘤、细菌、寄生虫抗原的免疫应答，并且可 能影响自身免疫变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic enc印halomyelitis)、糖 尿病的发生发展。
目前国内对GILT的研究较少，只获得了猪、文昌鱼、石斑鱼、大黄鱼、珍珠贝的GILT基 因并对用real-time PCR技术对GILT的表达分布进行鉴定，通过LPS刺激检测GILT表达 量的变化情况。国外关于人、鼠GILT的研究进展
(I)Patrick等人研究表明人的黑色素瘤细胞中GILT的表达依赖于STATl而不依赖于 CIITA。表达MHC classll的肿瘤细胞不总是与GILT的表达相偶联，这是因为IFN-γ刺激 细胞表面受体使其胞内酪氨酸残基磷酸化，这些磷酸化的酪氨酸残基成为STATl单体的停 泊位点，从而被Jakl和2磷酸化。磷酸化的STATl 二聚化入核激活一系列靶基因的转录包 括CIITA。而CIITA是MHC classll的总开关，它的缺失不影响GILT的表达。(2) Maric等人的研究表明GILT的上调会降低T细胞的敏感性从而减少自身免 疫。降低成熟T细胞的TCR的敏感性有助于控制自身免疫病的发生。GILT-/-的外周T细 胞能够增加TCR的敏感性，因为降低了线粒体超氧化物歧化酶的表达导致活性氧的增加和 ERK1/2的磷酸化。GILT-/- T细胞的敏感性增加导致了高血糖症。(3),2010 年 Reshma Singh 和 Peter Cresswell 在 Science 上发表文章证明 GILT 对促进I型组织相容性抗原复合物的呈递抗原有作用，在GILT-/-小鼠中缺乏对病毒抗原 的交叉递呈，影响了 CD8+T细胞对病毒抗原的应答反应。(4)、Su Yan等人研究表明GILT对B细胞的耐受起重要作用，临床免疫耐受诱导方面有潜在价值。肽-IgG融合蛋白转导的脾脏B细胞能够有效的对APCs (抗原呈递细胞) 耐受。但是机制如何并不清楚。他们发现来源于肽-IgG的class II表位以GILT依赖的 方式被加工。这种体内耐受诱导系统对多种自身免疫病(实验性变态反应性脑脊髓炎、糖尿 病、血友病)模型动物有效。(5)、Reshma Singh等在nature的文章表明GILT是李斯特氏菌感染的关键宿主 因子。李斯特氏菌是革兰氏阳性、胞内、食源性病原菌能够在人和动物体内引起严重的疾 病。感染过程中被巨噬细胞吞噬并在胞内逃离吞噬体并在胞浆中复制，然后以非裂解的机 制从一个细胞到另一个细胞传播。穿透吞噬体膜是通过分泌溶血素(LLO)实现的。活化具 有裂解活性的LLO的正是GILT。在细菌感染部位，巨噬细胞能够分泌GILT到胞外，GILT因 能够活化那个部位的血溶素介导的组织破坏，可能包括因宿主防御招募过来的炎症细胞的 裂解。综上所述，国际上对GILT的研究是个热点，但对GILT上游的基因调控及下游信 号通路与免疫调节机理研究比较充分，但应用研究还是一个空白，本课题基于国内外研究 的现状以及羊的细菌感染疾病的思考提出，对羊GILT进行分子结构、功能及免疫调节机制 方面进行研究，针对免疫力低下和炎症感染疾病的动物，开发相关的免疫增强剂和疫苗佐 剂。
发明内容
本发明针对现有技术，提供一种从绵羊提取的IFN-Y诱导的溶酶体巯基还原酶 cDNA，并提供绵羊IFN- γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA的克隆方法及重组应用。本发明从绵羊中克隆到IFN-Y诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA，它具有SEQ ID NO. 1所示的序列。本发明的绵羊IFN- γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA的克隆方法如下
(1)根据绵羊基因组IFN-Y诱导的溶酶体巯基还原酶的序列设计引物
正义寡核苷酸引物 She印 GILTl :5，_ TGTGATGGCCTCGTCGCCTCTC -3，( SEQ ID NO. 3) 反义寡核苷酸引物 ^ie印 GILT2 :5，- CAGTCACTTCAAGTGGACTTCCTTG-3’ ( SEQ ID NO. 4)
(2)从绵羊脾脏提取总RNA；
(3)通过RT-PCR方法，以上述引物Sie印GILTl及Sie印GILT2为特异性引物，扩增出 一段cDNA序列，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测定。上述绵羊IFN- γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA的克隆方法具体操作如下
(1)根据绵羊基因组IFN-Y诱导的溶酶体巯基还原酶全长CDS两端设计的正义寡核 苷酸引物She印GILTl (5，- TGTGATGGCCTCGTCGCCTCTC _3，)与反义寡核苷酸引物Sie印 GILT2 (5， - CAGTCACTTCAAGTGGACTTCCTTG -3，)。(2)应用组织RNA提取试剂盒(天根生物公司)，按照操作手册，提取出绵羊脾脏细 胞的总RNA，
(3)应用RT-PCR方法，以上述Sie印GILTl及Sie印GILT2为特异性引物，扩增出全长 cDNA序列，全长为73^p，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测定。第一步逆转录的 反应条件为以总RNA为模板，在25 μ 1反应体系中，加入5XM-MLV反应缓冲液5 μ l、10mMdNTP 混合物 1. 5μ 1、RNase inhibitor (HRPl) 1 μ l、M_MLV(RNase F)逆转录酶(Takara 公司)lyl、01igo (dT) 18 primer Ιμ 、及 RNA 模板 3 μ 1，补水至 25 μ 1，42°C 保温 lh。 第二步进行用两个特异性弓I物进行30个PCR循环(94 V变性30s，56 °C退火30s，72 °C延伸 lmin)，最后于72°C延伸7 min。RT-PCR产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂 盒回收约的DNA条带，克隆入pMD19-T载体，挑取8个阳性克隆进行碱基序列测定。将所得序列与GenBank数据库序列进行相似性搜索，发现与已知的人、小鼠、猪 GILT序列相似率分别是60. 15%,62. 50%,73. 58%，可以确定该序列是绵羊IFN- γ诱导的溶 酶体巯基还原酶(She印GILT)的全长cDNA，其开放阅读框如SEQ ID NO. 1所示。对该基因的进一步研究表明该基因主要表达在绵羊免疫器官中，包括脾脏和血 液。该基因的重组融合蛋白具有GILT的高活性功能；该基因编码的蛋白人IgG具有明显 的还原功能；充分表明本发明克隆得到的基因就是绵羊IFN-Y诱导的溶酶体巯基还原酶 (Sheep GILT )的 cDNA。上述绵羊IFN-Y诱导的溶酶体巯基还原酶(She印GILT)的cDNA的重组应用，通 过现有基因工程方法，生产重组Sie印GILT，作为绵羊免疫增强剂。所说的绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA通过现有基因工程方法，转入 绵羊体内，增加其免疫力，在饲养中应用。
图1是Sie印GILT全长cDNA碱基序列及推测编码氨基酸序列。图2是Sie印GILT与牛、人、猪、鼠、爪蟾、斑马鱼GILT全长氨基酸序列同源性比 较图。其中灰色阴影代表保守的半胱氨酸；方框代表CXXC基序和CQHGX2ECX2NX4C特征序列。图3是Sie印GILT mRNA在各组织中的表达水平分析图。GAPDH作为内参。图4是融合蛋白His-sGILT在BL21(DE3)中的诱导表达，纯化的SDS-PAGE鉴定 及鼠抗Hi%-tag的western-blotting鉴定结果，图中泳道1是未经IPTG诱导的全菌蛋 白，泳道2是经IPTG诱导的全菌蛋白，泳道3是经超声破碎后的上清；泳道4是经过超声 破碎后的沉淀，泳道5是纯化后的重组His-sGILT蛋白，泳道6是鼠抗His6-tag单抗的 western-blotting 鉴定结果。图5是体外展示羊GILT巯基还原酶活性。M:蛋白分子量marker ；泳道1和2 纯 化的sGILT ；泳道3和4 变性的纯化人IgG ；泳道5和6 :sGILT和人IgG在ρΗ4· 5条件下孵 育；泳道7和8 用DTT处理的人IgG作为阳性对照。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例1 绵羊(Ovis aries )，人工饲养。(1)引物设计应用生物信息学技术在NCBI的EST库中电子克隆出IFN-γ诱 导的溶酶体巯基还原酶全长cDNA序列用来设计的正义寡核苷酸引物Sie印GILTl (5’ -TGTGATGGCCTCGTCGCCTCTC -3，，SEQ ID NO. 3)与反义寡核苷酸引物 She印 GILT2 (5，-CAGTCACTTCAAGTGGACTTCCTTG -3’，SEQ ID NO. 4)。(2)提取总RNA 应用RNA抽提试剂TRIzol (Invitrogen公司)按照其操作手册 提取出约0. 5克绵羊脾脏细胞的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯 度，紫外分光光度计测定其浓度。(3)应用RT-PCR方法，以上述she印GILTl及she印GILT2为特异性引物，扩增出 Sheep GILT cDNA的全长为73^p，克隆入pMD19_T载体，并对其碱基序列进行测定。第一 步逆转录的反应条件为以总RNA为模板，在25 μ 1反应体系中，加入5 XM-MLV反应缓冲液 5 μ l、10mM dNTP混合物 1· 5μ 1、RNase inhibitor (HRPl) 1 μ l、M_MLV(RNase『)逆转录 酶(Takara 公司)1 μ l、01igo (dT)18 primer Ιμ 、及 RNA 模板 3 μ 1，补水至 25 μ 1，42°C 保温lh。第二步进行用两个特异性引物进行30个PCR循环(94°C变性30s，56°C退火30s， 72°C延伸lmin)，最后于72°C延伸7 min。RT-PCR产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳分离后，用 胶回收试剂盒回收约73^p的DNA条带，克隆入pMD19-T载体，挑取8个阳性克隆进行碱基 序列测定。(6)同源检索将所得序列向http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/提交克隆得 到的cDNA序列在GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库进行相似性搜索及 同源性分析，如图3所示，发现与已知的牛(AAI49407)，猪(ABX79390)，鼠(NP_075552)， 人(AAH31020)，斑马鱼(AAH83267)和爪蟾(NP_001017196) GILT氨基酸序列分别是 93. 03%, 73. 58%, 62. 50%, 60. 15%, 42. 80% 和 41. 86%，可以确定该序列是绵羊 IFN- γ 诱导 的溶酶体巯基还原酶(sGILT)的全长cDNA。并且其开放阅读框具有SEQ ID NO. 1序列，碥 码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。实施例2:
Sheep GILT基因在各组织的表达水平分析
采用实施例1中的提取RNA的方法，分别提取了绵羊肝(liver)、肾(kidney)、肺 (lung)、脾(spleen)、心(heat)、肠(intestine)和血液(PBMCs)的总 RNA,运用定量 RT-PCR法对Sie印GILT基因在各组织的表达水平进行了研究，结果如图3所示，Sheep GILT基因主要表达在绵羊免疫器官中，包括血液和脾脏表。试验中绵羊GAPDH作为内 参，采用的引物为 GF-Pl (5 ‘ -GGGTCATCATCTCTGCACCT-3 ‘，SEQ ID N0. 5)和 GR-P2 (5 ‘ -GGTCATAAGTCCCTCCACGA-3 ‘，SEQ ID NO. 6)。RT-PCR 体系如实施例 1。可溶性Sie印GILT重组载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达
以实施例1得到的She印GILT全长cDNA为模板，设计引物沘-Pl (5 ‘ -AAAGGATCCAT GGCCTCGTCGCCTCTC-3 ‘，SEQ ID N0. 7)和 28-P2 (5 ‘ -CCCAAGCTTTCACTTCAAGTGGACTTCCTT G-3 ‘，SEQ ID N0. 8)扩增出Sie印GILT cDNA，引物分别引入酶切位点召aa/Y/#/7历ii////， 亚克隆入pET-28a载体，构建成重组载体pETjSa-sGILT。将此重组载体转入大肠杆菌表达 菌株BL21 (DE3)，胞浆内表达出目的蛋白His-sGILT。重组目的蛋白的变复性变性过程
2M 尿素IOOmM Tris, IOOmM NaH2P04，2M 尿素。4M 尿素IOOmM Tris, IOOmM NaH2P04，4M 尿素。6M 尿素IOOmM Tris, IOOmM NaH2P04，6M 尿素。8M 尿素IOOmM Tris, IOOmM NaH2P04，8M 尿素。收菌后，放于-20度M小时。用PBS重旋后，超声破碎(超声4s，停顿8s，共150 次)，12000rpm、4度离心20min，弃上清，沉淀放于-20度或直接变性。向沉淀用2M的尿素洗三遍，用4M的尿素洗两遍，用6M的尿素洗1遍或用6M的尿 素溶解，最后用8M的尿素溶解，溶解后加入DTT至5mM。4度摇M-36小时。每次洗的时候 加入TritonX-IOO的量为75微升/30ml蛋白液。复性过程
先用 IOOmM Tris, IOOmM NaH2P04，4M 尿素，ImM GSH, 0. 2Mm GSSG，0. 6mM Arg pH8. 0 透 析 24 小时，再用 IOOmM Tris, IOOmM NaH2P04，2M 尿素，ImM GSH,0. 2Mm GSSG,0. 6mM Arg pH8. 0 透析 36 小时。然后用 75mM Tris,75mM NaH2P04,1. 5M 尿素，0. 6mM Arg，25g 乳糖 /L pH8. 0 透析过夜；再用 50mM Tris, 50mM NaH2P04, IM尿素，0. 6mM Arg, 25g 乳糖 /L pH8. 0 透 析过夜。然后用25mM Tris,25Mm NaH2P04,0. 5M尿素，pH8. 0透析过夜，最后用20Mm Tris 透析过夜，后冻干。每次换透析液时12000rpm，4度，离心20min后重新装入透析袋。western 印迹分析
Western-blot中所用一抗为鼠抗His6单抗，二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG。 其简要步骤是将诱导的产物先行SGS-PAGE，然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素 膜(NC膜)上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5%脱脂奶粉室温封闭lh，与 一抗孵育lh，与HRP标记的二抗IgG孵育lh，每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。 结果如图4所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。Sheep GILT对IgG的二硫键还原作用
对she印GILT用25 μ M的DTT在37°C活化lOmin，将绵羊GILT与人IgG在pH4. 5， 37°C条件下反应1小时，向反应样品中加入非还原性上样缓冲液，在SDS-PAGE胶中跑电泳 结果如图5 实施例3
将实施例1获得的绵羊IFN-Y诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA通过现有基因工程方 法，生产重组Sie印GILT，作为绵羊类免疫增强剂。实施例4
将实施例1获得的绵羊IFN- γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA通过现有基因工程方 法，转入绵羊体内，增加其免疫力，在饲养中应用。按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰绵羊IFN-Y诱导的溶酶体 巯基还原酶基因并用于所述研究和生产。
权利要求
1.绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA，其特征在于，它的序列如SEQID NO. 1 所示。
2.—种权利要求1所述的绵羊IFN-Y诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA的克隆方法，其 特征在于，其步骤如下(1)根据IFN-Y诱导的溶酶体巯基还原酶的保守序列设计引物正义寡核苷酸引物 ^ie印 GILTl :5’ - TGTGATGGCCTCGTCGCCTCTC -3，反义寡核苷酸引物 ^ie印 GILT2 :5’ - CAGTCACTTCAAGTGGACTTCCTTG-3’(2)从绵羊脾脏提取总RNA，(3)通过RT-PCR方法，以上述引物Sie印GILTl及Sie印GILT2为特异性引物，扩增出 一段cDNA序列，克隆入pMD19-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定。
3.一种权利要求1所述的绵羊IFN-Y诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA的重组应用，是 通过现有基因工程方法，生产重组绵羊IFN-Y诱导的溶酶体巯基还原酶，作为绵羊免疫增 强剂。
4.绵羊IFN-Y诱导的溶酶体巯基还原酶，其特征在于，它的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
全文摘要
本发明涉及绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA及其克隆方法和重组应用，属于生物基因工程领域。绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶具有SEQIDNO.2所示的序列，编码它的基因如SEQIDNO.1所示。其克隆方法如下根据绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶的保守序列设计引物；从绵羊脾脏提取总RNA；通过RT-PCR方法，扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD19-T载体，挑取阳性克隆进行测序。所述绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA可通过现有基因工程方法，生产重组绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶，作为绵羊免疫增强剂。
文档编号C12N9/02GK102121021SQ201010598400
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者张双全, 张真真, 艾洪新 申请人:南京师范大学