专利名称：一种鉴定基因抗盐功能的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中一种鉴定基因抗盐功能的方法。
背景技术：
土壤盐渍化是影响农业生产及生态环境的一个全球性问题，盐碱是目前制约我国农业增产的两大土壤因素之一。土壤中的含盐量是影响植物生长的一个重要因子，土壤的盐渍化严重阻碍的植物的生长发育，造成了农作物的减产。目前，全世界大约有20%的农业用地受到盐碱化的威胁，预计到2050年，全世界会有超过50%的土地会变得盐碱化。上世纪四十年代，各国科学家就开始了植物耐盐性研究，特别是近年来，无论是耐盐品种的筛选，还是品种耐盐机理的研究都取得了很大进展。从目前来看，虽然许多抗性基因被克隆，并通过基因工程在一定程度上提高了转基因植物的抗逆性，但进一步挖掘有潜力的抗逆基因资源仍然是艰巨的任务。这就要求人们把目光投向更广泛的领域中。要研究一个基因的功能，除了转基因技术以外，最直接有效的办法就是抑制该基因的表达或构建功能性蛋白不能形成的突变体，然后观察其表型的变化。目前已有的用于功能丧失(loss-of-function)研究的方法主要包括化学突变，转座子或农杆菌T-DNA插入突变以及RNAi等。这些方法在拟南芥基因功能研究中非常有效，但在其它植物中尚未能大规模的应用。另外，对引起致死突变或在维持细胞基本功能或发育早期基因的功能进行传统的T-DNA插入与转座子突变体等正向遗传学研究方法具有一定的困难，因为往往这些基因的突变为致死突变。RNAi技术需要转基因操作，实验周期长，载体构建涉及到反向重复结构，细菌操作时容易出错。病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是近年来发展的一种快速简单的植物基因功能研究方法。与其它导致基因功能缺失的研究方法如反义抑制、 基因突变等相比，病毒诱导的基因沉默具有研究周期短、不需要遗传转化、可在不同的遗传背景下生效以及能在不同的物种间进行基因功能的快速比较等优点，此种技术正在发展成为一种简单、快速、有效、高通量的分析基因功能的方法。病毒诱导的基因沉默是借助一种病毒侵染植物后发生的转录后基因沉默现象，来引起在mRNA水平上发生特异性降解的技术。即如果在病毒载体中插入目标基因片段，侵染寄主植物后，植物会表现出目标基因功能丧失或表达水平下降的表型，从而可以确定基因功能。VIGS被应用最活跃的领域是植物抗病性相关基因的鉴定和分离。尤其是“基因对基因”抗性相关基因的功能分析方面，近几年来已有较大量文献，而且有逐年增加的趋势。 这可能得益于多数基因对基因抗性有一个标志性防卫反应-过敏性反应0 )。而且不同植物种类间R/Avr下游信号传导途径保守。将互补R/Avr基因对分别克隆入双元表达质粒，转化农杆菌后，导入植物叶片，或将表达Avr的农杆菌或病原细菌本身导入含互补R基因的植物，即可看到R/Avr特异性诱发的HR坏死。比较野生型和VIGS植株的HR坏死产生强度，即可明确被沉默基因在该R/Avr诱发的HR产生中的作用。根据该思路，大量基因在多个R/Avr互作包括Pto/AvrPto，Rx/PVX, Cf/Avr等诱导的HR和抗病性中的作用已得到鉴定。除此之外，VIGS还被用于其它抗病性和防卫反应相关基因的鉴定。研究发现，SGTI 和HSP90不仅与多个R基因诱导的HR和抗性相关，而且在非寄主抗性中也起重要作用。另外，VIGS还被应用于抗虫信号传导途径以及植物醇合成途径，光合作用途径，以及纤维素合成途径的分析。目前，与生物逆境中的研究不同，VIGS在非生物逆境的研究方面应用的还很有限，目前还缺乏一种快速鉴定植物里盐胁迫相关基因的方法。基因LeNHX2是与植物的抗盐性相关的，呈正相关，过表达LeNHX2基因拟南芥的抗盐性提高，而LeNHX2基因表达量下调的番茄对盐更敏感(Rodriguez-Rosales， Μ. P. , Χ. Y. Jiang, et al. (2008). " Overexpression of the tomato K+/H+ antiporter LeNHX2confers salt tolerance by improving potassium compartmentalization. " New Phytologistl79(2) :366-377)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测植物中目标基因是否具有抗盐功能的方法。本发明所提供检测植物中目标基因是否具有抗盐功能的方法，包括如下步骤利用病毒诱导的基因沉默方法将目的植物中目标基因的功能丧失，得到的植物记作基因沉默植物；对所述基因沉默植物进行盐胁迫处理，检测盐胁迫处理后的基因沉默植物的与盐胁迫有关的性状，若所述盐胁迫处理后的基因沉默植物表现出耐盐性状，则确定所述目标基因具有抗盐功能。所述利用病毒诱导的基因沉默方法将目的植物中目标基因的功能丧失的方法包括如下步骤将目标基因的部分片段插入PTRV2载体的多克隆位点间，得到重组载体；将得到的重组载体与PTRVl载体共同导入所述目的植物中。所述目标基因的部分片段位于所述目标基因的开放读码框区域或5'和3'非编码区域。所述对所述基因沉默植物进行盐胁迫处理的方法为对所述基因沉默植物的离体叶盘进行盐胁迫处理或对所述基因沉默植物的完整植株进行盐胁迫处理。所述对所述基因沉默植物的离体叶盘进行盐胁迫处理的方法包括如下步骤取所述基因沉默植物的叶盘，得到离体叶盘，将离体叶盘分别浸泡在IOOmM和200mMNaCl水溶液中处理3天。所述对所述基因沉默植物的完整植株进行盐胁迫处理的方法包括如下步骤用含 200mM NaCl的溶液浇灌所述基因沉默植物的根系，处理20天。所述与盐胁迫有关的性状为如下1)-5)所示性状中的至少一种1)所述离体叶盘中叶绿素含量；2)所述基因沉默植物的叶片萎蔫程度、根的长度和/或根的数量；3)所述基因沉默植物的株高；4)所述基因沉默植物的鲜重和/或干重；5)所述基因沉默植物的光合速率。所述盐胁迫处理后的基因沉默植物表现出耐盐性状为如下1)-5)中所示的至少一种
1)所述基因沉默植物的离体叶盘中叶绿素含量显著低于野生型对照；2)所述基因沉默植物与野生型对照相比，叶片显著枯萎并下垂、根的长度显著降低和/或根的数量显著减少；3)所述基因沉默植物的株高显著低于野生型对照；4)所述基因沉默植物的鲜重和/或干重显著低于野生型对照；5)所述基因沉默植物的光合速率显著低于野生型对照；所述野生型对照为野生型植物。所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为番茄。本发明的另一个目的是提供病毒诱导的基因沉默方法在检测植物中待功能鉴定基因是否与具有抗盐功能中的应用。实验证明，本发明方法鉴定结果准确，对于快速鉴定和挖掘抗盐相关基因资源有
重要意义。
图1为不同NaCl处理下番茄叶片中的LeNHX2基因的表达量的比较。图2为沉默番茄植株、病毒空载体对照番茄植株以及野生型对照番茄植株体内 LeNHX2基因的表达量的比较。图3为不同NaCl处理下，沉默番茄植株(NHX2)、病毒空载体对照番茄植株(TRV2) 和野生型对照番茄植株(CK)离体叶片中叶绿素含量的比较。图4为不同NaCl处理下，沉默番茄植株(NHX2)、病毒空载体对照番茄植株(TRV2) 和野生型对照番茄植株(CK)地上部分的表型变化。图5为不同NaCl处理下，沉默番茄植株(NHX2)、病毒空载体对照番茄植株(TRV2) 和野生型对照番茄植株(CK)根系的表型变化。图6为不同NaCl处理下，沉默番茄植株(NHX2)、病毒空载体对照番茄植株(TRV2) 和野生型对照番茄植株(CK)株高的变化。图7为不同NaCl处理下，沉默番茄植株(NHX2)、病毒空载体对照番茄植株(TRV2) 和野生型对照番茄植株(CK)光合速率的变化。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明所用番茄品种为丽春(购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所)，在光照培养室内培养，培养条件为光照培养16小时，温度20°C ；黑暗培养8小时，温度18°C ；培养基质为草炭土 蛭石=1 1。实施例1、植物内源与抗盐性相关的LeNHX2基因的沉默及其检测一、鉴定LeNHX2基因表达量受NaCl调控取30天苗龄的番茄品种丽春，用200mMNaCl处理0、3、6、12、24、48小时，然后取不同时间NaCl处理的番茄品种丽春的上部成熟且完全展开的叶片，提取总RNA，反转录成 cDNA,用Actin作为内参，用LeNHX2的特异引物进行Real-timequantitative PCR分析，结果如图1所示。从图1可见，与不用NaCl处理的0小时比较，LeNHX2基因的表达在NaCl处理下上升，并且在6小时的时候达到最高。此结果说明LeNHX2基因参与了植物响应盐胁迫的反应。二、用病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法鉴定LeNHX2基因的功能1、构建重组载体根据NCBI 上已公布的基因序列(LePDS-GI :387886 和 LeNHX2_GI :15982205)，设计LePDS基因的特异性引物上游引物5‘TAGAGAATTCGGCACTCAACTTTATAAACC 3'，加了 EcoR I 酶切位点，下游引物5'GAATGGATCCCTTCAGTTTTCTGTCAAACC 3‘，加了 BamH I 酶切位点；同时设计LeNHX2基因的特异性引物上游引物5‘ GATGAATTCTACTACTCAAGGTGGAGACGA 3'，加了 EcoR I 酶切位点，下游引物5‘GATGGATCCCCTAATCCTGGCTTTGAACAT 3'，加了 BamH I 酶切位点。以番茄cDNA为模板，采用RT-PCR扩增分别获取LePDS基因和LeNHX2基因片段。用 EcoR I禾口 BamH I酶切LeNHX2基因片段，同时用EcoR I禾口 BamH I双酶切pTRV2载体(公众可从中国科学院植物研究所获得，记载过PTRV2载体的非专利文献是Liu，Y. L.，Μ. Schiff, et al. (2002). “ Tobacco Rarl, EDSl and NPR1/NIM1 like genes are required for N-mediated resistance to tobacco mosaic virus. " Plant Journal 30(4) :415-429), 回收大约101Λ的片段，将该回收片段与回收的LeNHX2基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在PTRV2载体的EcoR I和BamHI酶切位点间插入了 LeNHX2基因片段，证明质粒构建正确，将构建重组载体命名为pTVR2_LeNHX2 ；用EcoR I和 BamH I酶切LePDS基因片段，同时用EcoR I和BamHI双酶切pTRV2载体，回收大约IOkb 的片段，将该回收片段与回收的LePDS基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在PTRV2载体的EcoR I和BamH I酶切位点间插入了 LePDS基因片段， 证明质粒构建正确，将构建重组载体命名为pTVR2-LePDS ；分别将重组载体pTVR2_LeNHX2、 重组载体pTVR2-LePDS、载体pTRV2和pTRVl载体(pTRVl载体为pTRV2载体及其衍生载体的辅助载体，公众可从中国科学院植物研究所获得，记载过载体PTRVl的非专利文献是 Liu, Y. L.，M. Schiff, et al. (2002). “ Tobacco Rarl, EDSl and NPR1/NIM1 like genes are required for N-mediated resistance to tobacco mosaic virus. " Plant Journal 30(4) :415-429)用热激法转化农杆菌GV3101感受态(购自北京天根生化科技有限公司)， 得到含有pTVR2-LePDS的重组农杆菌、含有pTVR2_LeNHX2的重组农杆菌、含有pTRV2的重组农杆菌以及含有PTRVl的重组农杆菌。2、农杆菌接种液的准备挑取新鲜培养的pTVR2-LeNHX2、pTVR2_LePDS和pTRV2农杆菌单菌落，分别接种 7ml含KanOOOug/ml)和Rif (50ug/ml)的LB培养基(1升LB培养基中酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，其余为水)，在沘°〇、170卬111培养16h至0D600为1.2-1.6。以1 100 的比例接入IOOml LB培养基(加入100mg/ml Kan IOOul，200mM乙酰丁香酮IOul，IM MES Iml)，当菌液0D600为0. 8 1. 2时，5000rpm离心10分钟收集菌体细胞，以20_50ml体积的重悬液(IOmM MgC12+10mM MES+200 μ MAcetosyringone)重悬至 0D6002. 0 左右。室温静止6小时。分别得到pTVR2-LeNHX2农杆菌接种液、pTVR2_LePDS农杆菌接种液、pTRV2农杆菌接种液和PTRVl农杆菌接种液。3、基因沉默番茄植株的获得将以上步骤2静止6小时活化的pTRVl农杆菌接种液分别与pTVR2_LeNHX2农杆菌接种液、pTVR2-LePDS农杆菌接种液和pTRV2农杆菌接种液按体积比为1 1的比例混合，将得到的3种农杆菌混合液分别通过去针头的IOml注射器侵染完全展开两片子叶的番茄品种丽春幼苗，分别得到转入pTVR2-LeNHX2的番茄苗，即沉默番茄苗(NHX2) ’转入pTVR2-LePDS的番茄苗，即阳性对照番茄苗；和转入pTRV2空载体的番茄苗，即病毒空载体对照番茄苗(TRM)，同时设野生型番茄苗(即未转化的番茄苗)为野生型对照番茄苗 (CK)。4、观察基因沉默现象并进行分子检测分别将上述步骤3得到的沉默番茄苗(NHX2)、阳性对照番茄苗和病毒空载体对照番茄苗(TRW)放置在光照培养室中培养2-3周，培养条件为培养室光照培养16小时，温度20°C ；黑暗培养8小时，温度18°C ；培养番茄的基质为草炭土 蛭石=1 1。利用沉默时产生白化现象而易观察的LePDS基因作为阳性对照，观察阳性对照番茄植株叶片白化现象，当其叶片开始出现白化后，分别提取沉默番茄植株、病毒空载体对照番茄植株以及野生型对照番茄植株上部新长出叶片的总RNA，用Actin作为内参， Real-time quantitative PCR检测沉默番茄植株、病毒空载体对照植株以及野生型对照番茄植株体内LeNHX2基因的表达量下调情况，结果如图2所示。从图2的结果可以看出，沉默番茄植株(图2中ΝΗΧ2-1、ΝΗΧ2-2、ΝΗΧ2-3分别为三株沉默番茄植株)获得的沉默效果明显，LeNHX2的转录水平下降到了野生型对照番茄植株(CK)的50% -80%之间；病毒空载体对照番茄植株(TRM)的LeNHX2没有明显的下降，与野生型对照番茄植株(CK)维持在一个水平。此结果表明，重组载体pTVR2-LeNHX2的导入可以有效诱导植物内源LeNHX2基因的沉默。4、离体叶片水平上检测沉默植株抗盐性变化叶绿素是光合作用的主要色素和辅助色素，叶绿素含量对逆境胁迫非常敏感，因此常作为植物抗盐性变化的指标。为了研究VIGS引起的基因沉默在离体叶片水平上的能否引起植物盐敏感性变化，取沉默番茄植株(NHX2)、病毒空载体对照番茄植株(TRV2)以及野生型对照番茄植株(CK)上部完全展开的叶片，打孔器截取直径为0.8cm的圆型叶盘，分别浸泡在IOml IOOmM和200mM的NaCl水溶液和蒸馏水(即OmM的NaCl处理，作为对照处理)中，在连续光照条件下处理3天。培养条件为20°C，16小时；18°C，8小时，光强控制在 130 μ mol. πΓ2· 左右。处理后的叶片在95 %的乙醇暗中浸提48h，以95 %乙醇为对照，在分光光度计 (UV-2102PC,UNICOjUSA)上测定 A649 和 A665，叶绿素含量=6. 63XA665+18. 08XA649。测定结果见图3，从图3可见，在没有NaCl胁迫时沉默番茄植株(NHX2)、病毒空载体对照番茄植株(TRM)和野生型对照番茄植株(CK)都有较高的叶绿素含量；对其离体叶盘进行不同浓度(IOOmM和200mM)的NaCl处理后不同处理组的叶绿素含量均有明显下降，但沉默番茄植株中叶绿素含量下降的幅度更大，且200mM NaCl处理的时候与病毒空载体对照番茄植株和野生型对照番茄植株均发生了显著差异。也就是说，VIGS引起的LeNHX2基因沉默降低了植物对盐胁迫的耐受力。此结果表明，离体叶片处理可以用于VIGS方法鉴定与抗盐相关的基因功能中。5、整株水平上检测沉默植株抗盐性变化为了研究整株水平上抗盐性的变化，将沉默番茄植株、病毒空载体对照番茄植株和野生型对照番茄植株分别进行盐胁迫处理，具体为用含有200mM NaCl的溶液浇灌以上三种植株的根系，处理20天。同时用含有OmM NaCl的溶液浇灌以上三种植株的根系，处理 20天，作为对照处理。含有200mM NaCl的溶液和含有OmM NaCl的溶液分别为含有200mM NaCl 的 l/2Hoagland 溶液和含有 OmM NaCl 的 l/2Hoagland 溶液。l/2Hoagland 溶液的配方如下表1 :表ll/2Hoagland溶液的配方
权利要求
1.检测植物中目标基因是否具有抗盐功能的方法，包括如下步骤利用病毒诱导的基因沉默方法将目的植物中目标基因的功能丧失，得到的植物记作基因沉默植物；对所述基因沉默植物进行盐胁迫处理，检测盐胁迫处理后的基因沉默植物的与盐胁迫有关的性状，若所述盐胁迫处理后的基因沉默植物表现出耐盐性状，则确定所述目标基因具有抗盐功能。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述利用病毒诱导的基因沉默方法将目的植物中目标基因的功能丧失的方法包括如下步骤将目标基因的部分片段插入PTRV2载体的多克隆位点间，得到重组载体；将得到的重组载体与PTRVl载体共同导入所述目的植物中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述目标基因的部分片段位于所述目标基因的开放读码框区域或5'和3'非编码区域。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述对所述基因沉默植物进行盐胁迫处理的方法为对所述基因沉默植物的离体叶盘进行盐胁迫处理或对所述基因沉默植物的完整植株进行盐胁迫处理。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述对所述基因沉默植物的离体叶盘进行盐胁迫处理的方法包括如下步骤取所述基因沉默植物的叶盘，得到离体叶盘， 将离体叶盘分别浸泡在IOOmM和200mM NaCl水溶液中处理3天。
6.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述对所述基因沉默植物的完整植株进行盐胁迫处理的方法包括如下步骤用含有200mM NaCl的溶液浇灌所述基因沉默植物的根系，处理20天。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述与盐胁迫有关的性状为如下1)-5)所示性状中的至少一种1)所述离体叶盘中叶绿素含量；2)所述基因沉默植物的叶片萎蔫程度、根的长度和/或根的数量；3)所述基因沉默植物的株高；4)所述基因沉默植物的鲜重和/或干重；5)所述基因沉默植物的光合速率。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述盐胁迫处理后的基因沉默植物表现出耐盐性状为如下1)-5)中所示的至少一种1)所述基因沉默植物的离体叶盘中叶绿素含量显著低于野生型对照；2)所述基因沉默植物与野生型对照相比，叶片显著枯萎并下垂、根的长度显著降低和 /或根的数量显著减少；3)所述基因沉默植物的株高显著低于野生型对照；4)所述基因沉默植物的鲜重和/或干重显著低于野生型对照；5)所述基因沉默植物的光合速率显著低于野生型对照；所述野生型对照为野生型植物。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为番茄。
10.病毒诱导的基因沉默方法在检测植物中待功能鉴定基因是否与具有抗盐功能中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定基因抗盐功能的方法。本发明所提供检测植物中目标基因是否具有抗盐功能的方法，包括如下步骤利用病毒诱导的基因沉默方法将目的植物中目标基因的功能丧失，得到的植物记作基因沉默植物；对所述基因沉默植物进行盐胁迫处理，检测盐胁迫处理后的基因沉默植物的与盐胁迫有关的性状，若所述盐胁迫处理后的基因沉默植物表现出耐盐性状，则确定所述目标基因具有抗盐功能。实验证明，本发明方法鉴定结果准确，对于快速鉴定和挖掘抗盐相关基因资源有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102154362SQ201010597870
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者李银心, 贺希格都楞, 陈显扬 申请人:中国科学院植物研究所