专利名称：一种细菌的检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种细菌的检测方法和一种用于细菌 检测的凝集素修饰的金纳米粒子及一种用于细菌检测的试剂盒。
背景技术：
当今社会，病毒性感染疾病有愈演愈烈之势，但细菌感染仍然是人类健康的一大 威胁。例如结核病造成的死亡仍然位居世界第一位，并且有卷土重来的迹象；食品来源的沙 门氏菌、李斯特氏菌和大肠杆菌等是造成腹泻的重要因素；引起肺炎的几种病原如肺炎克 雷伯氏菌、肺炎双球菌、肺炎衣原体、肺炎支原体等往往对抵抗力低下、年老或年幼人群构 成极大威胁；金黄色葡萄球菌感染十分顽固，而且耐药性十分普遍；脑炎球菌对抵抗力尚 不十分完善的儿童威胁较大。随着细菌耐药性的不断增强，生物恐怖主义隐现以及食品污 染等影响日常生活，传染病的威胁越来越受到人们的关注，因此发展有效的细菌检测方法 对公共卫生有重要意义。细菌的检测方法多种多样，目前细菌分类鉴定的常规方法主要依赖于细菌培养、 染色以及显微观察技术，但是细菌需要进行分离、培养以及一系列的生物化学检测使得 该方法非常耗时(Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. , Am. Soc. Microbiol. Washington,D. C.，2007)。此外，还有核酸(DNA标记探针、PCR等)技术和抗体检测(ELISA 酶联免疫检测、免疫荧光等)技术等，但上述方法属于一对一的检测模式，即一种标记探针 只能检测一种细菌。因此，亟待发展高效的细菌识别检测技术。生物芯片是目前基因组学、蛋白质组学研究的重要工具。生物芯片以其高通量、 敏感、准确的特点，越来越多地应用于细菌快速检测以及细菌糖组学的动力学研究(Nat. Chem. Biol.，2006，2，153-157)。但目前，生物芯片主要以荧光为检测手段，在检测灵敏度、 选择性等方面尚存在一定的缺点，因而发展生物芯片的检测新方法对其发展有重要意义 (Nature,2007，4，437-444)。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是针对现有的检测方法灵敏度和选择性欠佳的缺陷，提供 一种灵敏度和识别度更高的细菌的检测新方法。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案一种细菌的检测方法，包括以下步骤步骤1 提供对照细菌样品；步骤2 固定有一种以上凝集素的固体支持物分别与待测样品和对照细菌样品充 分作用，洗涤除去固体支持物上未结合的样品；步骤3 洗涤后的固体支持物与凝集素修饰的金纳米粒子充分作用，洗涤除去固 体支持物上未结合的金纳米粒子；步骤4:检测固体支持物上结合的金纳米粒子的共振光散射信号，与细菌标准品共振光散射信号比较，分析待测样品细菌种类。细菌表面覆盖着多种不同糖缀合物，如糖蛋白、糖脂、糖胺聚糖和蛋白多糖等，而 且不同细菌表面覆盖糖基的种类不完全相同，如大肠杆菌表面覆盖有唾液酸、岩藻糖、末端 乙酰氨基半乳糖、α-半乳糖、末端乙酰葡萄糖和α-甘露糖等糖基，而与大肠杆菌不同，枯 草芽孢杆菌表面除覆盖有唾液酸、岩藻糖、末端乙酰氨基半乳糖、α -半乳糖、末端乙酰葡萄 糖和α -甘露糖等糖基外，还存在葡萄糖-β -1，4葡萄糖低聚物。凝集素(lectin)是从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结 合糖的蛋白，能识别单糖或寡糖中特定的糖基序列，并与之结合，常用于寡糖和糖复合物 的分离纯化和糖链的结构分析。目前发现的凝集素有100多种，常用的为植物凝集素 (Phytoagglutin, PNA)，通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A、麦胚素、花生凝集素和大 豆凝集素等，凝集素是它们的总称。一种凝集素可以识别一种或几种特定的糖基序列，并 与之结合。如蓖麻凝集素I可以识别半乳糖-β (1,4)葡萄糖(Gali3 (1,4) GlcNAc β 1)糖 基，大豆凝集素可以特异性识别末端乙酰氨基半乳糖(Terminal GalNAc)糖基，麦胚凝集 素可以特异性识别β-乙酰葡萄糖胺、唾液酸和乙酰氨基半乳糖糖基(β-GlcNAc，sialic acid, GalNAc)。本发明所述细菌的检测方法在固体支持物上固定有一种以上不同种类的凝集素， 利用凝集素-糖类物质相互作用识别具有不同糖基的细菌，将与凝集素结合的细菌固定在 固体支持物上，以凝集素修饰的金纳米粒子作为细菌标记物，利用共振光散射技术检测细 菌表面金纳米粒子的共振光散射信号，然后通过将待测样品的共振光散射信号与对照细菌 样品的共振光散射信号比较，分析待测样品细菌种类，实现细菌的定性分析。其中，凝集素 修饰的金纳米粒子为金纳米粒子直接或间接与凝集素结合形成的带有凝集素的金纳米粒 子。本发明所述凝集素可以为目前发现的凝集素中的任意一种。其中，作为优选， 所述凝集素为蓖麻凝集素I (Ricinus Communis Agglutinin)、山槐黄柏苷凝集素I和 II (Maackia Amurensis Agglutinin)、笄[J豆凝集素 I (Ulex Europaeus Agglutinin)、大豆 凝集素(Soybean Agglutinin)、鸡冠珊瑚树凝集素(Erythrina Cristagalli Lectin)、 接骨木凝集素(Sambucus Nigra Lectin)、西非单叶豆凝集素I和II (Griffonia simplicifolia)、麦胚凝集素(Wheat Germ Agglutinin)、刀豆素 A(Conconvalina)、 橙黄网胞盘菌凝集素(Aleuria Aurantia Lectin)、喇叭水仙凝集素(Narcissus Pseudonarcissus Lectin)、蔓陀萝^疑集素(Datura stramonium Lectin)、扁豆^疑集素 (Lens Culinaris Agglutinin)或花生凝集素(Phaseolus Vulgaris Agglutinin)。共振光散射技术(RLQ是近年迅速发展起来的新的仪器分析技术，因其灵敏度 高，操作简单等显著特点而广泛应用。随着金纳米粒子周围的环境变化，其共振光散射信号 的强度不同，由此可以检测细菌表面金纳米粒子结合强度。因金纳米粒子对周围环境的变 化反应迅速，故检测的灵敏度和准确性高，因此该方法还可实现细菌的半定量分析，并且可 应用于检测不同环境下的细菌。作为优选，所述金纳米粒子半径为IOnm 13nm。优选的，所述检测共振光散射信号之前还包括增强信号步骤，以进一步提高检测 灵敏度。
作为优选，所述增强信号步骤具体为与银增强溶液反应5 lOmin，18. 2ΜΩ水洗 涤，其中，所述的银增强溶液是美国西格玛(Sigma)公司生产的银增强溶液A与银增强溶液 B按体积比1 1混合所得，即制即用。本发明所述18. 2MΩ水是指绝对纯水。MΩ是指水的电阻率，表示高纯水水质的参 数，指某一温度下横截面积是Icm2长度是Icm的水的电阻，其单位为欧姆*厘米(Ω *CM)， 电阻率越高表明盐份越少。绝对纯水在25°C的理论值为18.2MQ*CM，测定值与温度有关， 温度越高，电阻率越低，反之越高。本发明还提供了一种用于细菌检测的凝集素修饰的金纳米粒子，金纳米粒子直接 或间接与凝集素结合。本发明所述金纳米粒子与凝集素可以通过多种方式结合在一起，包括金纳米粒子 与凝集素通过直接或间接形成离子键、共价键或配位键而结合形成凝集素修饰的金纳米粒 子。本发明还提供了一种凝集素修饰的金纳米粒子的制备方法，包括步骤1 金纳米粒子与多肽反应，得到多肽修饰的金纳米粒子，所述多肽为
biotin
Cys-Ala-Leu-Asn-Asn 和广 Αι τ ▲ ▲Tl ^ 摩尔比为 9 1 的混合物；
Cys-Ala-Leu-Asn-Asn-Gly-Lys-Gly步骤2 多肽修饰的金纳米粒子与亲和素反应，得到亲和素修饰的金纳米粒子；步骤3 生物素与凝集素反应，得到生物素修饰的凝集素；步骤4 亲和素修饰的金纳米粒子与生物素修饰的凝集素反应，得到凝集素修饰 金纳米粒子。本发明多肽混合物为CyS-Ala-LeU-ASn-ASn(胱氨酰丙氨酰亮氨酰天冬酰胺酰天
biotin
冬酰胺)和r A1 T A AI (胱氨酰丙氨酰亮氨酰天冬酰胺酰天冬酰胺
Cys-Ala-Leu-Asn-Asn-Gly-Lys-Gly
酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸)摩尔比为9 1的混合物。Cys-Ala-Leu-Asn-Asn与金表面有很强的亲和性，能够形成致密的保护层，使金纳
米粒子溶于水，并可以保持长期稳定性。
biotin^ αι τ A AI ^能够高效且有针对性的聚集在指定位置。 Cys-Ala-Leu-Asn-Asn-Gly-Lys-Gly亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生 物素分子亲密结合，结合后两者形成的键稳定很难断裂。亲和素-生物素是目前发现的最 稳定的配合物。本发明以亲和素与多肽修饰的金纳米粒子共价结合，再利用亲和素与生物素间形 成的稳定的配位键，与生物素修饰的凝集素结合，将凝集素连接到多肽修饰的金纳米粒子 上，获得凝集素修饰的金纳米粒子，可作为标记物特异性识别糖类物质，应用于糖类物质的 识别和检测。在一个具体实施方案中本发明所述生物素修饰的凝集素为市售的生物素修饰 的GS-II凝集素。优选的，所述金纳米粒子半径为IOnm 13nm。本发明还提供了利用上述制备方法制备的凝集素修饰金纳米粒子。本发明还提供了一种用于细菌检测的试剂盒，包括凝集素修饰的金纳米粒子和凝集素生物芯片，所述凝集素生物芯片通过将一种以上的凝集素固定在固体支持物上得到， 所述凝集素修饰的金纳米粒子为上述直接或间接与凝集素结合的金纳米粒子。凝集素生物芯片属于糖类物质生物芯片，是继基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等 之后发展起来的一种很有前景的生物检测技术，具有检测样品用量少、高通量和特异性高 等优点。在一个实施方案中，所述凝集素生物芯片，为4X4排布的16个子阵列，其中每个 子阵列包括4个结合位点。作为优选，所述固体支持物为玻片。按照本发明，玻片优选为本领域人员熟知的二 氧化硅玻璃片或有机硅半导体玻片，本发明不做限定，所述玻片的表面修饰有环氧基团，可 与凝集素发生共价反应。本发明所述用于细菌检测的凝集素生物芯片的制备方法，为取不同种类的凝集素 在固体支持物上点样，25°C 37°C静置4h 16h，得到凝集素生物芯片。优选的，所述用于细菌检测的凝集素生物芯片的制备方法还包括洗涤和封闭步 骤。所述封闭为在25°C 37°C与封闭溶液反应Ih 池，以封闭未凝集素的结合部位，以减 少非特异性结合背景的影响。常用的封闭液中含有脱脂奶粉、小牛血清等。作为优选，本发明所述封闭溶液为包括40mmol/L 60mol/L牛血清蛋白、0. Imol/ L 0. 2mol/L乙醇胺以及0. 15mol/L 0. 2mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液。在一个实施方案中，所述用于细菌检测的凝集素生物芯片制备过程为将16种不 同凝集素喷点于4X4排布16个子阵列的环氧玻片上，每个子阵列包括4个结合位点，分别 喷点相同的凝集素。之后喷点了凝集素的玻片在25°C 37°C反应4h 16h，磷酸盐缓冲 溶液洗涤玻片，然后浸泡于含有40mM 60mM牛血清蛋白(BSA)、0. IM 0. 2M乙醇胺以及 0. 15M 0. 2M氯化钠的磷酸盐缓冲溶液的封闭溶液中，25°C 37°C下反应Ih 2h，制得凝 集素生物芯片。在一个具体实施方案中，本发明以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌和金黄葡 萄球菌为对照细菌样品，利用本发明所述细菌的检测方法分别检测对照细菌样品和待测样 品的共振光散射指纹图谱及信号强度，通过比较待测样品与对照细菌样品的共振光散射指 纹图谱及信号强度，定性分析待测样品的细菌种类。在一个具体实施方案中，本发明还用所述的检测方法分别对不同浓度的大肠杆 菌、枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌和金黄葡萄球菌进行检测，结果显示大肠杆菌、金黄葡萄球 菌和枯草芽孢杆菌检测限为103，阴沟肠杆菌测限为104，并且不同浓度的对照细菌样品其 共振光散射指纹图谱相似，而共振光散射信号强度不同，表明本发明所述细菌的检测方法 检测样品用量少，检测灵敏度高，可实现细菌半定量分析。本发明所述细菌的检测方法具有通用性，并且灵敏度高、样品消耗量少、稳定性 好，可实现细菌的定性及半定量分析。本发明所述用于细菌检测的凝集素修饰金纳米粒子 稳定性高、生物相容性好，制备方法简单、快速。本发明所述用于细菌检测的试剂盒制备方 法简单、使用方便，适合广泛推广与应用。
图1示凝集素生物芯片微阵列排列图，相应编号代表的凝集素见表1 ；
图2示实施例6对照细菌样品大肠杆菌的共振光散射指纹图谱；图3示实施例6对照细菌样品大肠杆菌的共振光散射强度图；图4示实施例6对照细菌样品枯草芽孢杆菌的共振光散射指纹图谱；图5示实施例6对照细菌样品枯草芽孢杆菌的共振光散射强度图；图6示实施例6对照细菌样品阴沟肠杆菌的共振光散射指纹图谱；图7示实施例6对照细菌样品阴沟肠杆菌的共振光散射强度图；图8示实施例6对照细菌样品金黄葡萄球菌的共振光散射指纹图谱；图9示实施例6对照细菌样品金黄葡萄球菌的共振光散射强度图；图10示实施例6待测样品的共振光散射指纹图谱；图11示实施例6待测样品的共振光散射强度图；图12示实施例7不同浓度大肠杆菌的共振光散射指纹图谱，大肠杆菌浓度分别 为a、106，b、105，c、104，d、103，e、102 ；
具体实施例方式本发明实施例公开了一种细菌的检测方法、用于细菌检测的凝集素修饰金纳米粒 子及其制备方法和用于细菌检测的试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进 工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而 易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和方法已经通过较佳实施例进行了描 述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和方法进行改 动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例1 凝集素生物芯片的制备由北京博奥生物技术有限公司提供的SmartArrayerfS芯片制作系统上制作并处 理凝集素生物芯片。取16种浓度为lmg/mL的凝集素喷点于环氧基修饰的玻片上，在25°C 37°C真空条件下反应4h，凝集素种类及其特异性识别的糖基见表1。凝集素生物芯片微阵 列排列图见图1。然后用含有体积浓度为0. 05%吐温-20,0. 15mol/L NaCl和pH值为8. 0 的50mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤玻片，再用含有60mol/L牛血清蛋白(BSA)、0. lmol/L乙 醇胺以及0. 2mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液，25°C 37°C下反应lh，封闭芯片得到凝集素 生物芯片。为获得好的阵列点并保持生物分子的活性，点样液含有体积浓度为15%甘油， IOmol/L单糖，0. 15mol NaCl和pH值为8. 0的50mol/L磷酸盐缓冲溶液。表1.凝集素以及相应糖基的特异性结合
权利要求
1.一种细菌的检测方法，包括以下步骤 步骤1 提供对照细菌样品；步骤2 固定有一种以上凝集素的固体支持物分别与待测样品和对照细菌样品充分作 用，洗涤除去固体支持物上未结合的样品；步骤3:洗涤后的固体支持物与凝集素修饰的金纳米粒子充分作用，洗涤除去固体支 持物上未结合的金纳米粒子；步骤4 检测固体支持物上结合的金纳米粒子的共振光散射信号，与对照细菌样品共 振光散射信号比较，分析待测样品细菌种类。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述凝集素为蓖麻凝集素I、山槐黄柏苷凝 集素、荆豆凝集素、大豆凝集素、鸡冠珊瑚树凝集素、接骨木凝集素、西非单叶豆凝集素、麦 胚凝集素、刀豆素A、橙黄网胞盘菌凝集素、喇叭水仙凝集素、蔓陀萝凝集素、扁豆凝集素或 花生凝集素。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述金纳米粒子半径为IOnm 13nm。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述检测共振光散射信号之前还包括增强信号步骤。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述增强信号步骤具体为与银增强溶液反 应5 lOmin，18. 2ΜΩ水洗涤。
6.一种用于细菌检测的凝集素修饰的金纳米粒子，其特征在于，金纳米粒子直接或间 接与凝集素结合。
7.一种凝集素修饰的金纳米粒子的制备方法，包括步骤1 金纳米粒子与多肽反应，得到多肽修饰的金纳米粒子，所述多肽为biotinCys-Ala-Leu-Asn-Asn 和广 Αι τ ▲ ▲Tl ^ 摩尔比为 9 1 的混合物；Cys-Ala-Leu-Asn-Asn-Gly-Lys-Gly步骤2 多肽修饰的金纳米粒子与亲和素反应，得到亲和素修饰的金纳米粒子； 步骤3 生物素与凝集素反应，得到生物素修饰的凝集素；步骤4:亲和素修饰的金纳米粒子与生物素修饰的凝集素反应，得到凝集素修饰的金 纳米粒子。
8.权利要求7所述制备方法制备的凝集素修饰的金纳米粒子。
9.一种用于细菌检测的试剂盒，包括权利要求6或8所述凝集素修饰的金纳米粒子和 凝集素生物芯片，所述凝集素通过将一种以上的凝集素固定在固体支持物上得到。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种细菌的检测方法，具体为提供对照细菌样品；固定有一种以上凝集素的固体支持物分别与待测样品和对照细菌样品充分作用，洗涤除去固体支持物上未结合的样品；洗涤后的固体支持物与凝集素修饰的金纳米粒子充分作用，洗涤除去固体支持物上未结合的金纳米粒子；检测固体支持物上结合的金纳米粒子的共振光散射信号，与对照细菌样品共振光散射信号比较，分析待测样品细菌种类。本发明所述细菌的检测方法具有通用性，并且灵敏度高、样品消耗量少、稳定性好，可实现细菌的定性及半定量分析。本发明还提供了稳定性高、生物相容性好的凝集素修饰的金纳米粒子以及制备方法简单、使用方便的用于细菌检测的试剂盒。
文档编号C12Q1/04GK102108375SQ20101059308
公开日2011年6月29日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者刘殿骏, 王振新, 高晶清 申请人:中国科学院长春应用化学研究所