专利名称：：两个棉花纤维伸长期优势表达的启动子及应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明属于植物基因工程
技术领域：
。具体涉及两个棉花纤维发育时期特异启动子的克隆及其应用。通过克隆、鉴定两个棉花纤维伸长期特异性启动子，将其应用于棉花纤维品质改良的遗传转化。
背景技术：
：棉花纤维是一种重要的纺织业原料，对棉花纤维的遗传改良有利于棉纺工业的发展。而纤维细胞又是一种独特的植物细胞，它由棉花种皮的单细胞发育而来，从开花当天开始，经历起始，延长，次生壁沉积及成熟四个阶段，最后发育成一个长达3厘米左右、次生壁中纤维素含量达百分之九十多的纤维细胞。为此，棉花纤维细胞是研究植物细胞发育及纤维素沉积的良好研究材料。基因启动子是重要的基因表达调控元件，决定了基因的转录方向、转录效率以及转录的时空特性。运用基因工程手段对农作物进行遗传改良，赋予农作物一些新的性状，需要外源基因在受体内以高度受控的方式表达，这就对启动子的表达特性提出了很多新的要求。比如启动子能接受外部信号刺激，引导基因在特定器官、组织和细胞类型的特定发育阶段表达。外源基因的特异表达类型有很多优点，如表达高效、节约能量等等。目前一批棉花组织特异启动子已经得到表达特性分析(John和Crow，Geneexpressionincotton(GossypiumhirsutumL.)fiber:CloningofthemRNAs,ProcNatlAcadSciUSA,89:5769-731992;Rinehart等，Tissue-specificanddevelopmentalregulationofcottongeneFbl2a,PlantPhysiol,89:5769-5773,1996;Liu等，CloningandpromoteranalysisofthecottonlipidtransferproteingeneLtp3,BiochimBiophysActa,1487106-112000；Wang等，ControlofplanttrichomedevelopmentbyacottonfiberMybgene,PlantCell，16:2323-2334,2004;Zhang等，Membersofanewgroupofchitinase-likegenesareexpressedpreferentiallyincottoncellswithsecondarywalls,PlantMolBiol,54:353-72,2004;Li等，Thecottonactinlgeneisfunctionallyexpressedinfibersandparticipatesinfiberelongation,PlantCell,17:859-875,2005；Wu等，Isolationofacottonreversiblyglycosylatedpolypeptide(Ghrgpl)promoteranditsexpressionactivityintransgenictobacco,JPlantPhysiol,163=426-35,2006)这些启动子中E6达高峰在纤维发育10天左右；FbL2A启动子在20天纤维中特异表达，表达高峰在纤维发育的第35天。GhCTL的启动子不仅启动⑶S在次生壁增厚期纤维中表达，而⑶S在其他组织的次生壁部位也表达。虽然到目前为止克隆的棉花纤维启动子已经为数不少，但像克隆种子特异启动子a-globulinpromoter真正以克隆启动子为最初目标而克隆的很少(Sunilkumar等，Cottonalpha-globulinpromoterisolationandfunctionalcharacterizationintransgeniccotton,Arabidopsis,andtobacco,TransgenicRes，11:347-359,2002)。目前克隆的纤维特异启动子都是克隆或分析某些纤维发育相关基因功能时的副产品，这就造成了启动子资源的相对缺乏，不能满足棉花纤维发育相关基因功能验证和纤维品质转基因育种的需要，本专利能丰富棉花纤维特异/优势启动子资源。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供两个棉花纤维伸长期优势表达启动子，利用所述的启动子转化棉花以及作为在棉花遗传改良中的应用。本发明通过下列技术方案实现申请人:通过基因克隆方法，从海岛棉中克隆得到两个棉花纤维伸长期优势表达启动子PGbEXAl和PGbEXATR，它们是由序列表SEQIDNO:1及序列表SEQIDNO:2所示的DNA分子。上述启动子Ρ(ΛΕΧΑ1和P(ibEXPATR的核苷酸序列包括所述启动子序列的全部或部分序列，所述的部分序列是指大于或等于所述启动子Ρ(ΛΕΧΑ1起始密码子上游461bp的序列，其中启动子Ρ(ΛΕΧΑ1的46Ibp序列位于序列表SEQIDNO1所示序列的379_839bp处。与此同时，申请人获得了一种棉花纤维伸长优势表达的启动子Ρ(ΛΕΧΑ1的表达载体pGWB407-P(ibEXAl，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。本发明所述的Ρ(ΛΕΧΑ1和P(ibEXATR启动子和所述重组表达载体可用于改良棉花纤维品质或特种棉花创制的棉花转基因育种。实验证明，这两个启动子在棉花纤维伸长期优势表达，并且在拟南芥叶片表皮毛中特异表达。本研究是在研究海岛棉纤维发育相关基因表达谱的基础上发掘的两个在海岛棉纤维伸长期高丰度表达的基因(ΛΕΧΑ1和(ibEXATR，进而克隆的启动子(图1)。序列表SEQIDNO1是本发明克隆的启动子(ΛΕΧΑ1的核苷酸序列。其中该序列表SEQIDNO1所示序列的379-839bp区段是该启动子的核心区。序列表SEQIDNO2是本发明克隆的启动子(ibEXATR的核苷酸序列。图1是GbEXAl和GbEXATR启动子克隆和验证的技术路线。图2是GbEXAl和GbEXATR表达分析。图中:GbEX2(上面一排)和GbEX3(下面一排)的3，-UTR设计引物RT-PCR(28的循环)的电泳图。泳道1-2分别为DNA、水；3-8为TM-I的23、15、10、5、3DPA的纤维和开花前1-4天的胚珠；9-15为Pima3-79的27、23、17、15、10、OTPA的纤维和开花前1-4天的胚珠；16-25为花粉、花、蕾、叶、乙烯处理的铃柄离层、赤霉素处理的铃柄离层、未处理铃柄离层、茎、黄萎病菌处理的茎、DNA分子量标记。图3是Ρ(ΛΕΧΑ1启动子驱动⑶S基因在棉花和拟南芥中的表达情况，PGbEXAl启动子驱动GUS在棉花纤维中优势表达，其中在纤维发育早期有微弱表达，在纤维伸长期表达丰度很高。A-D:0、3、9、18DPA棉花胚珠及纤维；E-H:18DPA纤维、剥掉纤维的胚珠、胚珠切面及胚，表明除纤维外胚珠其他部分GUS是不表达的。1-0:萌发的胚、内种皮、胚根、根、叶片、茎尖、茎尖(0)的放大，表明该启动子驱动⑶S在刚萌发的子叶及内种皮上微弱表达，在下胚轴子叶端微弱表达，还在茎尖幼嫩叶片表皮毛上表达。P=PGbEXAl启动子驱动⑶S在拟南芥叶片的表皮毛特异表达。图4是P(ibEXATR启动子驱动⑶S基因在棉花和拟南芥中的表达情况，表达模式与Ρ(ΛΕΧΑ1基本一致，但有微弱差别。图中Α-Η:棉花萌发的胚、内种皮、胚根、下胚轴、根、24DPA胚珠、叶片、茎尖，表明该启动子驱动GUS在胚根根尖有微弱表达，在下胚轴子叶端微弱表达，但在茎尖幼嫩叶片表皮毛没有表达，和Ρ(ΛΕΧΑ1启动子有差异。I:Ρ(ΛΕΧΑ1启动子驱动⑶S在拟南芥幼嫩叶片的表皮毛特异表达，与Ρ(ΛΕΧΑ1区别在于在成熟叶片表皮毛中没有表达。图5为启动子Ρ(ΛΕΧΑ1的截短策略。图6为启动子Ρ(ΛΕΧΑ1起始密码子上游118bp驱动⑶S表达的模式，118bp的启动子不具备驱动GUS在伸长纤维中表达的能力。各种组织如图中标示，其中DPA表示开花后的天数。图7为PGbEXATR、PGbEXAl及PGbEXAl不同截短区段转基因棉花⑶S定量分析。分析表明起始密码子上游461bp为该启动子的核心序列。图8为表达载体pGWB407-P(ibEXAl的物理图谱。A:pGWB407物理图谱；B含有Ρ(ΛΕΧΑ1启动子的植物表达载体的物理图谱；C利用pGWB407-P(ibEXAl进行转基因功能验证，Southern杂交结果表明该载体的T-DNA已经整合到基因组上(NPTII为探针)。图9为启动子Ρ(ΛΕΧΑ1的核心序列如下划线部分所示。具体实施例方式实施例1:GbEXAl和GbEXATR的表达分析以GbEXAl和GbEXATR基因(基因登录号分别为DQ9U952和DQ912951)的3，_UTR设计引物对进行RT-PCR，验证其表达模式。所述的引物对的DNA序列如下GbEXAlSense:5’CGATGGCAGGACTATCACAAAC3’；GbEXAlAnti:5’TATAATATTGTCTTAAAACTGGCCTCCTT3’GbEXATRSense:5，GTGAAGAAAGGAGGCATCAG3，；GbEXATRAnti:5，TCGAAAATACTTGCAAAAAT3‘RT-PCR步骤如下提取不同组织的总RNA陆地棉TM_13、5、10、15、23DPA(dayspostanthesis开花后天数)的纤维和开花前1-4天的胚珠；海岛棉3-79的5、10、15、17、23、27DPA的纤维和开花前1-4天的胚珠；花粉、花、蕾、叶、乙烯处理的铃柄离层、赤霉素处理的铃柄离层、未处理铃柄离层、茎、黄萎病菌处理的茎。RNA提取完成后后用DNaseI(购自Promega公司，美国)处理，RNA完整性通过1.4%(w/v)琼脂糖胶(EtBr)电泳检测(5V/cm)ο核酸浓度的测定在BeckmanDU800spectrophotometer上进行。RNA260/280比值在1.9到2.1之间，26(V230比值大于2.0的RNA用于下一步的分析。cDNA的合成是以3yg总RNA为模版，与Ιμ500μg/mloligo-dT(15)引物(购自Promega公司，美国)，1μ1IOmMdNTP,DEPC-water混合，总体积为12μ1；然后65°C变性5min冰上骤冷；再力口入8μ1含有4μ1RTbuffer,2μ10.IMdithiothreitol,40unitsofRNasinRibonucleaseInhibitor(购自Promega公司，美国)，禾口200unitsofSuperscriptIIRT(购自hvitrogen公司，美国)的混合液；42°C温浴Ih合成第一链(以随机引物来合成第一链的反应先在25°C放置IOmin)；反应结束后75°C处理15min使SuperscriptIIRT失活。每份cDNA稀释到300μ1后-20°C保存待用。PCR反应体系(20μ1)包括1μ1稀释后的cDNA(等于IOng起始总RNA)，10μ12XPCRMasterMix，200nM的引物。PCR程序为50°C，2min；95°C变性IOmin；然后28个循环(95°C变性15s，60°C复性延伸Imin)。结果表明(ΛΕΧΑ1是棉花纤维特伸长期异/优势表达基因，只在海岛棉和陆地棉纤维快速伸长期表达(5-15DPA)，在非纤维组织没有检测到相应的表达。(ibEXATR是海岛棉伸长期纤维特异表达基因(见图1)。实施例2启动子Ρ(ΛΕΧΑ1和P(ibEXATR的序列的获得以全长CDNA3，端序列设计引物GSPl(genespecialprimer基因特异性引物)和引物GSP2分别与GenomeWalkerUniversalKit(ProtocolNo.PT3042-2，购自Clontech公司，美国)的引物API、引物AP2组合进行启动子的克隆(具体步骤见试剂盒操作手册)，得到如下所示的引物对，其序列如下所示GbEXAlGSPlCCACCGTAGAAGGTGGCATGGGCAGTTTGbEXAlGSP2:ATTAGCACCAAGGAAAATGGAGTTGCATGbEXATRGSPlCCACCGTAGAAGGTGGCATGGGCAGTTCGbEXATRGSP2:ATTAGCACCAAGGAAAATGGAGTTGCAG在凝胶电泳后用凝胶回收试剂盒回收目的片段(试剂盒购自Qiagene公司，德国，Cat.No.28704)后进行TA克隆，测序。确认这两个启动子Ρ(ΛΕΧΑ1和P(ibEXATR分别长839bp、1405bp，其序列见序列SEQIDNO1和序列表SEQIDNO:2所示。利用预测植物启动子软件TSSP进行启动子顺式元件进行预测(http//www,softberry.com/berry,phtml？topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter&advanced=on；SolovyevandSalamov,1997；Solovyev,2001；SolovyevandShahmuradov，2003)，发现该序列具有核心启动子序列(上述两个启动子的核心区见SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示)及相应的激素和环境响应的各个元件。实施例3启动子PGbEXAl和PGbEXATR驱动GUS在棉花及拟南芥中表达设计带有HindIII和BamHI的酶切位点的引物扩增了该启动子，替换载体PBI121(购自Clontech公司，美国))上的驱动⑶S表达的35S启动子，转化棉花品系TL-Y检测是否为纤维特异启动子。引物序列如下(两个启动子反向引物一样)PGbEXAlF:5’agagaagcttAGTGCGAATAAAGAAGACCGCA’3PGbEXATRF:5’agagaagcttCACTTAAATTCTCAATAAAATTAGAAAAC，3PEXR:5’agaggatccTTGAGTAAGAGCTAGCTAGCTCAAACAA’3上述引物中的酶切位点以小写英文字母表示。本发明中所涉及的棉花转基因采用的方法为农杆菌介导的遗传转化法，所采用的农杆菌菌株为LBA4404(OctopineTi-plasmiddeletionmutantsofAgrobacteriumtumefacienswithemphasisontherightsideoftheT—region，Plasmid，1982，7:15-),转化受体材料为YZ-I(参照Jin(金双侠)等的文献identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum，2006，50:519-524)。转化方法和程序参照Jin等建立的高效转化体系(Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum，200650:519-524；Anefficientgraftingsystemfortransgenicplantrecoveryincotton(GossypiumhirsutumL.).PlantCell,TissueandOrganCulture,85:181-185,2006；FactorsaffectingstabletransformationandplantregenerationduringtransformingembryogeniccallusofUplandcotton(GossypiumhirsutumL.)viaAgrobacteriumtumefaciens,PlantCell,TissueandOrganCulture,81:229-237,2005)，并作了相应的调整和修改，具体方法和流程如下1、无菌苗的培养将棉籽壳去掉，用0.1/100的升汞灭菌十分钟，无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中配方如下=IAMS大量元素+葡萄糖15g/L+phytagel(购自Sigma-Aldrich公司，美国)2.5g/L，3-6天暗培养，培养温度为。2.农杆菌的活化和保存2.1材料准备农杆菌LBA4404，含卡那霉素50mg/L的MGL液体培养基(胰化蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，MgSO4.7Η200·lg/L，KH2PO4O.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.Og/L,ρΗ7·0)，无菌三角瓶，LB(固、液)培养基(含卡那霉素50mg/L)，灭菌甘油，无菌枪头，无菌1.5mL离心管。2.2操作:2.2.1活化，悬浮超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上划线，26.5°C暗培养36-4他，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在另外的LB平皿划线，26.5°C暗培养36-4,待皿内长出足够的菌落结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL培养基中，27°C、200rpm摇2h，OD值在0.5-1.5之间即可用于侵染。2.2.2菌株的保存从培养皿内挑取单菌落接于LB液体培养基中150rpmJ6°C摇48h，按菌液和甘油按体积比11加入1.5mL离心管混勻，-70°C保存。3.浸染，共培养3.1准备取暗培养5天左右幼嫩健壮的TL-Y幼苗，经活化农杆菌，无菌培养皿，无菌滤纸3.2操作无菌条件下将H-I幼苗下胚轴用锋利的刀片切成0.5-lcm长的切段，转入到经活化的农杆菌菌液中，搅勻，静置5-10分钟，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5分钟使表面稍为干燥，分散布于垫有滤纸的共培养培养基中，19-21°C暗培养38-42小时。4.愈伤组织的诱导将侵染共培养后的下胚轴切段接种于诱导培养基上配方如下MS无机盐+B5有机物+2，4-D0.lmg/L+KT0.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L,ρΗ5·8。5、非胚性愈伤组织的增殖MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+Β5有机物+2，4-D0.05mg/L+KT0.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L,ρΗ5·8。。6、愈伤组织的分化愈伤组织经继代(一个月继代一次)几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基(MS+B5有机物+ΚΤ0.15mg/L+IBA0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，pH5.8)中，进一步分化成胚状体。7、胚性愈伤组织的继代MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B5有机物+ΚΤ0.15mg/L+IBA0.5mg/L+Gln(谷胺酰胺)1.Omg/L+Asn(天冬酰胺)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，ρΗ5·8。8、成苗生根培养将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中成苗生长(1/2MS无机盐+B5有机物+葡萄糖15g/L+phytagel2.5g/L,pH5.8)。9、炼苗移栽将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜，炼苗2-3天，然后移栽到小土钵中，遮荫缓苗一周左右移栽大田。附MS培养基母液配制1.配制大量元素时各种药品分别称量，分别充分溶解，逐一加到容量瓶中，一定要最后加入CaCl2否则容易产生沉淀，定容到一升。2.配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液(浓缩10000倍)，再稀释成二级母液(浓缩100倍)，母液配制完毕后放置于室温下10小时以上，看是否有沉淀产生，然后才能使用。3.配制铁盐时，两种盐用热水分别溶解，然后混合，放置于室温下10小时以上看是否有沉淀产生，然后才能使用。4.各种生长激素一般可以用lmol/L的NaOH或HCl溶解后，再定容。5.配制B5有机物时要用无菌水来配制，一次不要配太大体积，及时用完以防污染6.各种母液配制好后应存放在4°C冰箱中，发现有沉淀后，不得使用。大量元素(20倍)母液(g/L)KN0338NH3N0333MgS04·7H20(无水MgS04)7.4(3.8)KH2P043.4CaCl2·2H20(无水CaCl2)8.8(6.6)微量元素(100倍)母液(g/L)CoC12·6H200.0025CuS04·5H200.0025H3B030.62KI0.083MnS04·4H202.23NaM04·2H200.025ZnS04·7H200.86铁盐(100倍)母液(g/L)FeSO4·7H202.78Na2EDTA3.73B5有机物VBl(硫胺素)10mg/LVB5(盐酸吡哆醇)lmg/LVB6(烟酸)lmg/L肌醇100mg/L甘氨酸ang/LTO植株收获的种子(Tl)在50mg/L卡那霉素的MS培养基上进行阳性筛选，然后阳性植株的不同器官进行GUS组织化学定位。拟南芥的转化采用Floraldip法(参考文献)转化哥伦比亚野生型拟南芥，将收获的当代转基因拟南芥种子在添加30mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选阳性苗。收获阳性植株种子，然后对阳性T2代植株进行GUS染色。GUS组织化学定位法参照Jefferson等(Gusfusionsβ-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ,1987,63901-3907)方法，将转化转基因植株的不同器官，组织放到⑶S染色液溶液中，37°C保温2h至过夜，经70%酒精脱色后FAA固定保存在中，肉眼或在体式显微镜观察⑶S基因表达情况，然后在体式显微镜(LeikaMZFLI11)下照相。⑶S染色液成分如下(IOOmL):x-gluc90mg、氯霉素10.0mg、0.IM磷酸钠缓冲液(pH7.0)50mL、甲醇20%(ν/ν)，补足无菌水至IOOmL;组织固定液(FAA):70%乙醇90mL、5%醋酸5mL、38%甲醛5mL。将上述两个启动子Ρ(ΛΕΧΑ1和P(ibEXATR与⑶S融合转化棉花和拟南芥，组织化学染色表明启动子Ρ(ΛΕΧΑ1主要在棉花纤维伸长期表达，其中在纤维发育早期有微弱表达，在纤维伸长期表达丰度很高。在刚萌发的子叶和内种皮，下胚轴，茎尖幼嫩叶片表皮毛有微弱表达。另外启动子Ρ(ΛΕΧΑ1在拟南芥叶片的表皮毛中也有特异表达(见图2)。对于棉花胚珠，PGbEXAl只诱导GUS在纤维细胞中表达，而在剥掉纤维的种皮、胚乳及胚中检测不到⑶S表达(图2Ε-Η)。PGbEXATR的表达模式和PGbEXAl基本一样，但有微弱差别=PGbEXATR启动子驱动⑶S在胚根根尖处有微弱表达，而茎尖幼嫩叶片表皮毛没有表达，与Ρ(ΛΕΧΑ1启动子正好相反。Ρ(ΛΕΧΑ1启动子除了驱动GUS在拟南芥叶片的表皮毛表达外，在幼嫩叶柄表皮毛也有表达。实施例4=PGbEXATR的表达模式和PGbEXAl核心序列的确定为了确定P(ibEXATR的表达模式和Ρ(ΛΕΧΑ1的核心序列，根据软件预测结果从5’端进行一系列截短，图5所示为Ρ(ΛΕΧΑ1的截短序列示意图。不同的截短片段GUS融合转化棉花。转基因棉花后代先进行GUS表达模式的定性分析，然后进行GUS定量。GUS定量的具体步骤如下1、试剂准备①⑶S提取缓冲液50mM磷酸缓冲液(pH7.0)IOmMβ-巯基乙醇IOmMNa2-EDTA0.1%Sarkosyl十二烷基肌氨酸钠0.1%Triton-X-IOO②反应终止液0.2MNaCO3③ImM4-MU称取19.8mg4-MU粉末溶于IOOmL0.2MNaCO3溶液中，4°C避光可保存一个月。测定⑶S活性前再稀释1000倍，取100μL加入1.9mL反应终止液中，终浓度为50nM。④40mM4_MUG称取1.408mg4-MUG粉末溶于100μL双蒸水中，现用现配。⑤考马斯亮蓝G-250溶液称取50mg考马斯亮蓝G-250粉末，溶于90%乙醇中，加入50mL磷酸，定容至500mL,过滤后4°C避光保存。(6)100μg/mLBSA标准溶液称取IOmgBSA粉末，加水溶解定容至100mL。2、⑶S蛋白提取①取适量材料用液氮研磨成粉末，取约0.6克粉末装入1.5mL离心管中。②加入ImL蛋白提取液，摇勻，在冰上放至沉淀。③4"C13000rpm离心15分钟。④吸取上清，冰箱中保存。3、蛋白浓度测定①将100μg/mLBSA标准溶液按下表制成BSA梯度液表1牛血清白蛋白(BSA)梯度液配置权利要求1.两个棉花纤维伸长期优势表达启动子Ρ(ΛΕΧΑ1和P(ibEXPATR，其核苷酸序列分别如SEQIDNO:1禾口SEQIDNO2所示。2.权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子Ρ(ΛΕΧΑ1和P(ibEXPATR的核苷酸序列包括所述启动子序列的全部或部分序列，所述的部分序列是指大于或等于所述启动子PGbEXAl起始密码子上游461bp的序列，其中启动子Ρ(ΛΕΧΑ1的461bp序列位于序列表SEQIDNO1所示序列的379-839bp处。3.一种棉花纤维发育伸长期优势表达的启动子Ρ(ΛΕΧΑ1的表达载体pGWB407-P(ibEXAl，其核苷酸序列如序列表SEQIDN0:1所示。4.权利要求1或2所述的启动子在棉花遗传改良中的应用。5.权利要求3所述的表达载体在棉花遗传改良中的应用。全文摘要本发明涉及植物基因工程领域。特征是克隆鉴定了海岛棉GbEXPA1和GbEXPATR基因的启动子。其启动子的核苷酸序列如序列表1和序列表2所示。这两个启动子在棉花中是纤维特异/优势表达启动子。将启动子PGbEXPA1和PGbEXPATRDNA序列分别与GUS基因融合构建的植物表达载体经农杆菌介导的遗传转化方法转化棉花，获得转基因植株经染色鉴定，GUS基因在棉花纤维中优势表达。这两个启动子表达模式基本一致，但有微弱差异。通过一系列截短启动子序列与GUS融合，转基因棉花验证结果表明-461bp～-1bp的序列是该启动子PGbEXPA1的核心序列。本发明还公开了含有启动子PGbEXPA1的重组表达载体，该重组表达载体可应用于培育在植物根中特异表达目的基因的转基因植株。文档编号C12N15/82GK102485894SQ20101058238公开日2012年6月6日申请日期2010年12月6日优先权日2010年12月6日发明者张献龙,朱龙付,李阳,涂礼莉,邓锋林申请人:华中农业大学