专利名称：一种真菌分子生物学鉴定的dna模板简易制备及pcr扩增方法
技术领域：
本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一种可以用于大规模真菌菌株鉴定的、 不需要提取真菌DNA的PCR扩增模板简易制备及扩增方法。
背景技术：
真菌广泛分布于地球表面，从高山、湖泊到田野、森林、从海洋、高空到赤道、两极、 到处都有(刑来君和李明春)。地球上估计存在有100-150万种真菌，其中已报道的约有 10万种(Hawksworth 1991 ；邱立友等，2009)。真菌在在环境、工业、农业、医药以及基础生物学研究中具有重要作用，多年来一直被广泛地研究。然而人类所了解的生境真菌组成只是很小一部分，很多生境的真菌组成及其功能有待调查研究。了解不同生境真菌的组成以及进行真菌资源开发，需要分离培养并鉴定所分离的真菌。随着分子生物学的快速发展，真菌分子鉴定方法发挥着越来越重要的作用。进行真菌分子生物学鉴定，首先要提取真菌的DNA，常用的方法有CTAB法、SDS提取法、蜗牛酶法、蛋白酶K法(Alex et al. , 2001 ；昂莎莎等，2009)，各种改良的提取方法 (Saitoh et al. , 2006 ；刘素玲等，2006)及商品化的真菌DNA提取试剂盒(如EZ Spin Column Fungal DNA Isolation Kit)。这些方法主要的技术路线是用液氮破碎真菌菌丝， 加入各提取液溶解DNA，使用有机溶剂去除杂质，通过沉淀法或膜结合法获得DNA。虽然已经报道的方法可以获得大量的高纯度的真菌DNA，但是这类方法存在费时费力费耗材等缺点ο
发明内容
本发明解决的问题是大规模真菌分子生物学鉴定过程中，DNA制备方法复杂、费时、费力、费耗材等缺点。本发明的技术方案为 1.简易真菌DNA的制备方法
用无菌镊子或接种环，在超净工作台上取一环大小的真菌菌丝体，放入到0.2 mL的 PCR 管中，加入 2-5 倍于菌丝体积的 IXTE buffer (100 mmol I71 Tris-HCl, 10 mmol I71 EDTA, pH 8.0)，盖紧管盖后，放入PCR扩增仪，98 V加热8_10 min。取上清即为简易制备的真菌DNA，可以直接用作为PCR反应的模板。2. PCR扩增技术
使用PCR扩增18 S rRNA与28 S rRNA之间ITS区域，上游引物ITS3: GCATCGATGAAGAAGAACGCAGC； ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC (White et al. 1990， PCR Protocols, Academic Press)。改良的PCR反应体系如表1所示，使用较高浓度的Taq酶的激活剂Mg2+及较高浓度的Taq酶达到增强反应体系的扩增能力的目的。直接吸取上述简易制备的上清1 μ L作为PCR扩增反应的DNA模板。扩增条件94 °C预变性5 min, 94 °C变性，30 sec ；55 °C退火，30 sec ；72 °C延伸，30 sec ;30 个循环；72 °C延伸，5 min。表1 PCR扩增的反应体系
权利要求
1. 一种真菌分子生物学鉴定的DNA模板简易制备及PCR扩增方法，其特征是由以下步骤组成1)用无菌镊子或接种环，在超净工作台上取一环大小的真菌菌丝体，放入到0.2 mL的 PCR管中；2)加入2-5倍于菌丝体积的IXTEbuffer，盖紧管盖后，放入PCR扩增仪，98 V加热 8-10 min ；IXTE buffer 组成为100 mmol L-1 Tris-HCl, 10 mmol L-1 EDTA, pH 8. 0 ；3)取上清即为简易制备的真菌DNA，用作为PCR反应的模板；4)以改良的PCR反应体系进行扩增反应，50μ L PCR反应体系包括10 XPCR buffer 5 μ L5MgCl2 20 mmol Γ1 6 μ L,dNTPs 10 mmol Γ1 1 μ L，*禾中弓 L 10 μ mol Γ1 2 μ L, Taq DNA polymerase 5 U μ Γ1 0.6 μ L，上述简易真菌DNA 1 μ L ；使用较高浓度的Taq 酶的激活剂Mg2+及较高浓度的Taq酶增强PCR反应体系的扩增能力。
全文摘要
本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一种可以用于大规模真菌菌株鉴定的、不需要提取真菌DNA的PCR模板简易制备及PCR扩增方法。本发明所用的真菌DNA简易制备方法是利用PCR扩增仪加热破碎含有少量菌丝体的及少量TE缓冲液的PCR管，获得少量的真菌DNA，结合改良的PCR扩增体系扩增获得所真菌鉴定所需要的真菌DNA片段。该步骤少、低成本、操作简单、扩增效果良好且环境友好，适用于大规模的真菌分子生物学鉴定。
文档编号C12Q1/68GK102559848SQ20101057786
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者何兴兵, 王从彦, 王保忠, 王保明, 韩国民 申请人:南京大学