专利名称：一种检测尖孢镰刀菌的pcr方法及试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及农作物病害诊断与防治技术，特别是一种检测尖孢镰刀菌的PCR方法 及试剂盒。
背景技术：
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)主要在土壤里越冬(夏)，且在土壤里存活时 间较长，一般是通过土壤、肥料、灌溉水等进行传播，以侵染危害植株地下部位的根茎为主， 且能侵染植物的维管束，病原物在维管束里繁殖，阻塞其输送营养物质，在短期内致使整株 植物枯萎而死亡。尖孢镰刀菌可严重危害瓜类、茄科类、豆科蔬菜及草莓等经济作物，主要引起根 腐、茎腐、果腐等，有的侵染植物维管束组织引起萎蔫症。病原菌以菌丝体、厚垣孢子在土壤 中越冬，且在土壤中可以腐生。厚垣孢子在土壤中能生存5 10年。尤其在保护地农作物种植栽培过程中，尖孢镰刀菌引致的土传病害的发生越来越 严重。因其发生具有隐蔽性，大多在结果期才达到发病的高峰期，因此损失巨大。严重影响 了保护地的发展与人民的经济收入。传统鉴定方法通常采用选择性培养基进行病原菌的分离培养，菌落形态观察，显 微镜下观察病菌的菌丝体，孢子等特征，结合田间发病植株症状的观察进行分类。传统鉴定 方法在很多方面存在一定误差和困难，尤其是对土传病原菌的准确鉴定具有很大局限性。 仅菌丝体和孢子等的形态特征也即表型分析来鉴别，有时是不准确的。同一病原菌的菌落 往往在形态上、分布、生理性状等方面存在一定差异，难以进行准确鉴定。随着分子生物学 技术的日益成熟和广泛应用，人们有可能避开传统的分离培养过程，通过DNA水平上的研 究，对土壤中病原菌进行鉴定。分子生物学方法的简便、快速、高效、可靠等特点，是传统的 分离培养方法所达不到的。定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR 技术(real-time fluorescent quantitative PCR， FQ-PCR)是一种在 PCR 反应体系中力口 入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过扩增产物熔解曲线分析可 以特异地检测和鉴定某种病原真菌，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技 术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反 应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研 究和医学研究等领域，但在农业植物病原真菌的定性定量检测研究中应用较少，尤其是在 尖孢镰刀菌的定性定量研究中。
发明内容
本发明根据上述领域的不足，提供一种采用PCR检测尖孢镰刀菌的方法和试剂 盒，能够提高了检测的准确性，节约了检测时间，试剂盒可以在植物病害诊断与防治领域大 规模推广。
一种检测尖孢镰刀菌的PCR方法，包括如下步骤(1)预制 PCR 体系，(2)在预制好的PCR体系中加入模板得到PCR反应体系，(3)进行PCR扩增反应；其特征在于，所述PCR反应体系中的引物的序列信息如下Fol :5，-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3，Fo2 5 ’ -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3’。所述PCR 反应体系为10 X PCR buffer 2 μ L, 15mM MgCl2 0. 5μ L,2. 5mM dNTPs 1. 6 μ L，5 μ M引物各0· 5 μ L，Taq酶1U，DNA模板1 μ L，其余为灭菌双蒸水，终体积为20 μ L0所述PCR扩增反应的程序为94°C预变性3min ；94°C变性lmin，65°C退火lmin， 72°C延伸lmin，共30个循环；最后72°C延伸IOmin0所述PCR方法为荧光定量PCR方法。所述PCR反应体系为反应总体积为20 μ L, SYBR Green Supermix 10 μ L，10 μ M/L 的 Fol 1 μ L，10 μ M/ L的Fo21 μ L，模板11 μ L，余量为无菌双蒸水。所述PCR扩增反应的程序如下第一步95. OO0C 3分钟，1个循环；第二步95.O0C 45 秒，65. 0°C 45 秒，55. 0°C 1 分钟，45 个循环；第三步55. O0C 10分钟，95. 0°C 1分钟，1个循环；第四步55.0°C 1分钟；第五步55. O0C 10秒，80个循环。一种检测尖孢镰刀菌的PCR方法的试剂盒，其特征在于包含有具有如下序列信息 的引物Fol :5，-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3，Fo2 :5’ -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3，。还包括荧光定量PCR所需的荧光染料。本发明根据本研究克隆测序的尖孢镰刀菌ITS区序列如Seq ID No. 1所示，设计 出特异性引物Fol/Fo2，采用该引物的PCR检测方法具有极好的特异性和灵敏性，经特异性 试验证明，如图1能够将尖孢镰刀菌与其它近缘菌区分开。灵敏性实验结果表明，如图2，可 检测尖孢镰刀菌DNA浓度低至0. Ing/mL。由于PCR方法操作简便快捷，基于对核苷酸的检 测，不受培养条件限制。本发明的方法，其特有灵敏度和特异性能够实现对发病植物组织中 及土壤中的尖孢镰刀菌的快速检测定量，实现防治的目的，操作简便快捷，基于对核苷酸的 检测，不受培养条件限制。本发明优选采用实时定量PCR方法，定量检测，能真实反映尖孢镰刀菌定殖和侵 染的情况；可同时进行高通量的样本检测。并且对实时定量PCR方法的体系和PCR程序进 行了优化，使检测灵敏度和准确性明显提高，对尖孢镰刀菌的精确检测可达到8个孢子，如 图3、4、5所示。本发明还提供一种检测尖孢镰刀菌的试剂盒，可对植物组织及土壤中的尖孢镰刀 菌进行快速检测和定量。可对尖孢镰刀菌进行快速定量检测，可以替代一直沿用的分离培养的传统鉴定方法，并适于在植物病害诊断及防治领域广泛推广应用，实用性强，可满足植 物病害诊断及监测的需要。
图1为特异性检测引物对Fol/Fo2对尖孢镰刀菌及其近缘种、属真菌的PCR扩增结果。1-9号为引物对Fol/Fo2扩增8种病原菌结果1.无 DNA 对照 2.尖孢镰刀菌(Fusarium oxsporum) 3.串珠镰刀菌(Fusarium moniforme)4.禾谷键刀菌(Fusarium graminearum)5.燕麦键刀菌(Fusarium avenaceum) 6.腐皮键刀菌(Fusarium solani) 7.大_轮枝菌(Verticillium dahliae) 8. 辣椒疫霄(Phytophthora capsici)9.番灰霄(Botrytis cinerea)M :100bp Marker图2为尖孢镰刀菌特异引物Fol/Fo2的灵敏度检测结果。1-6号为尖孢镰刀菌DNA模板浓度从高至低系列稀释(1 μ g/mL-10pg/mL) 7.无 DNA 模板对照 M. DL 2000Markero图3为标准样品和未知样品的尖孢镰刀菌荧光定量PCR扩增曲线图(y轴荧光吸收率；χ轴循环数)。图4为标准样品和未知样品的尖孢镰刀菌荧光定量PCR熔解曲线图，图示熔解温 度为88°Co图5为标准样品和未知样品的尖孢镰刀菌荧光定量PCR标准曲线图。未知样品1.病根(有明显症状，2. 16X106个孢子)，2.病根(有明显症状， 2. 12 X IO5个孢子)，3.病茎(有症状，2. 04 X IO3个孢子)，4.茎(无症状，82个孢子)，5.病 土(5g 土壤，8个孢子)；标准样品尖孢镰刀菌孢子数系列稀释(2. 16X107-2. 16 X IO3个孢子)。
具体实施例方式本发明所采用的微生物均在现有文献中记载过，本实验室也有保存，可向公众发 放用于验证试验。实施例1尖孢镰刀菌ITS区的克隆、测序1)尖孢镰刀菌DNA制备采用平板培养尖孢镰刀菌(Fusarium oxsporum)，置于30°C的培养箱内，生长一周 左右，用灭菌的解剖针刮取菌丝体，收集于EP管内，-20°C保存备用。采用液氮研磨菌丝体， 常规CTAB法提取各菌株DNA。2)尖孢镰刀菌ITS区的扩增采用真菌rDNA ITS 扩增的通用引物 ITS1/ITS4 (White，T.J.，Bruns, Τ.，Lee, S. ， et al. ， Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenies. Innis MA, Glefand D H, Sninsky JJ, et al. a Guide to Methods and Applications. San Diego =AcademicPress, New York, 1990,315 322.)扩增尖孢镰刀菌 的ITS区。PCR反应体系见表1。
表IPCR反应体系
权利要求
一种检测尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的PCR方法，包括如下步骤(1)配制PCR反应体系，(2)在配制好的PCR反应体系中加入待测模板，(3)进行PCR扩增反应；其特征在于，所述PCR反应体系中的引物的序列信息如下Fo15’ CGTCATTTCAACCCTCAAGCA 3’Fo25’ ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT 3’。
2.根据权利要求1所述的PCR方法，所述PCR反应体系为10XPCR buffer 2yL,15mM MgCl2O. 5 μ L, 2. 5mM dNTPs 1· 6 μ L，5 μ M 弓丨物各 0. 5 μ L，Taq 酶 IU，DNA 模板 1 μ L，其余为 灭菌双蒸水，终体积为20 μ L。
3.根据权利要求2所述的PCR方法，所述PCR扩增反应的程序为94°C预变性3min; 94°C变性lmin，65°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30个循环；最后72°C延伸lOmin。
4.根据权利要求1所述的PCR方法，所述PCR为荧光定量PCR。
5.根据权利要求4所述的PCR方法，所述PCR反应体系为反应总体积为 20 μ L, SYBR Green Supermix 10 μ L，10 μ M/L 的 Foil μ L，10 μ M/L 的 Fo21yL，模板11 μ L，余量为无菌双蒸水。
6.根据权利要求5所述的荧光定量PCR方法，所述PCR扩增反应的程序如下 第一步95. OO0C 3分钟，1个循环；第二步95. O0C 45 秒，65. 0°C 45 秒，55. 0°C 1 分钟，45 个循环；第三步55. O0C 10分钟，95. O0C 1分钟，1个循环第四步55. O0C 1分钟第五步55. O0C 10秒，80个循环。
7.—种检测尖孢镰刀菌的PCR试剂盒，其特征在于包含有具有如下序列信息的引物 Fol :5’ -CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3’Fo2 :5’ -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3，。
8.根据权利要求7所述的PCR试剂盒，还包括荧光定量PCR所需的荧光染料。
全文摘要
本发明“一种检测尖孢镰刀菌的PCR方法及试剂盒”，属于农作物病害诊断与防治技术。包括如下步骤(1)配制PCR反应体系，(2)在配制好的PCR反应体系中加入待测模板，(3)进行PCR扩增反应；其特征在于，所述PCR反应体系中的引物的序列信息如下Fo15’-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3’；Fo25’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3’。能够提高了检测的准确性，节约了检测时间，试剂盒可以在植物病害诊断与防治领域大规模推广。
文档编号C12Q1/06GK101974650SQ20101056780
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者吴篆芳, 崔瑞, 曹坳程, 李园, 赵海滨, 郭美霞 申请人:中国农业科学院植物保护研究所