专利名称：日本囊对虾2种形态变异体的识别方法
技术领域：
本发明涉及日本囊对虾，特别涉及日本囊对虾2种形态变异体的识别方法。
背景技术：
日本囊对虾分布极广，在日本北海道以南、中国东南沿海、东南亚、澳大利亚北部、 非洲东部及红海等海域均有栖息。日本囊对虾成虾根据其头胸甲上的斑纹特征可明显地分 为2种形态变异体，这2种形态变异体的分布具有明显的地理分布区域差异，其中变异体I 主要分布在日本北海道以南至中国南海中部，而变异体II主要分布在其他区域，2种变异 体在中国南海中部均有出现。在日本囊对虾幼虾及幼虾以下阶段，由于头胸甲斑纹不明显， 其所属变异体类型无法正确辨认。目前，除了在成虾阶段从形态上直接识别这2种形态变 异体，未见有其他识别方法的报道。在日本囊对虾的家系选育研究中，在幼虾阶段准确识别 不同形态变异体能有效地解决不同形态变异体家系混养的家系识别问题。因此开发准确、 快速鉴别日本囊对虾2种不同形态变异体的技术对日本囊对虾种质资源研究及遗传育种 具有重要意义。聚合酶链式反应结合限制性酶切(PCR-RLLP)方法具有分析简单、快速、稳定 可靠的优点，作为一种优良的分子标记技术，广泛用于生物遗传变异的检测(Klinbimga S, Penman DJ, McAndrew B J and Tassanakajon A. Mitochondrial DNA diversity in three populations of the giant tiger shrimp Penaeus monodon[J]. Marine Biotechnology. 1999，1(2) :113_121)。
发明内容
本发明的目的在于提供准确、快速的日本囊对虾2种形态变异体的识别方法，所 述日本囊对虾2种形态变异体分别为日本囊对虾变异体I和日本囊对虾变异体II。所述日本囊对虾2种形态变异体的识别方法包括以下步骤1)根据日本囊对虾线粒体基因组全序列，设计扩增日本囊对虾细胞色素b基因片 段的引物；2)提取日本囊对虾变异体I和变异体11的DNA，以所述DNA作为模板进行PCR反 应，反应结束后即得日本囊对虾变异体I的PCR扩增产物和日本囊对虾变异体II的PCR扩 增产物，再将所述PCR扩增产物进行酶切，酶切后的产物进行电泳鉴定。在步骤1)中，所述引物为正向弓丨物5，-caaattgttactgggctctttttagct-3，；反向弓丨物5，-cagttagcattacgataaatccggt-3，。在步骤2)中，所述提取日本囊对虾变异体I和变异体II的DNA，可采用常规酚 氯仿抽提法。所述PCR反应的体系为10XPCR缓冲液2. 5μ 1，2. 5mmol/L MgCl2 2. 5μ 1, 2. 5mmol/L dNTP2. 0 μ 1，50ng/μ 1 模板DNA 2μ l,5U/y 1 TaqDNA聚合酶 0. 4 μ 1，正向引物 和反向引物各Ι.ΟμΙ，ddH20补足至25μ 1。所述PCR反应程序为94°C变性5min，再进行以下循环94 V变性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，共30个循环，最后72°C延伸7min。所述日本囊对虾变异体I的PCR扩增产物的序列为 caaattgtta ctgggctctt tttagctata cactatacag cccacgtaga ccttgcattt 60tccagtgtag ctcacatttg ccgagatgtt aattatggtt gactcctacg aactctccac 120gccaatggtg cctccttctt ctttatttgc ttatatatgc acacaggacg aggtatttat 180tatggttcct tcctttacct tcacgcctga tcagtaggag ttgtaattct acttctcgtg 240atggcaactg ccttccttgg ttatgtcctt ccctgaggtc agatatcctt ctgaggagca 300actgtcatta ctaacctttt ctcggccatc ccttatattg ggccagattt agtccaatga 360atttgaggag gtttcgcagt agataacgca acactaacac gcttctttac ctttcacttt 420ctgttcccat tcattgtagc agcagctaca atcattcaca ttctttttat tcaccaaaca 480ggttctaaca atcccctagg aatcgttaga aatgtagata aagtaccatt ccatccttat 540tttacattca aagacatcac cggatttatc gtaatgctaa ctg583其中gatatc为酶切位点。所述日本囊对虾变异体II的PCR扩增产物的序列为caaattgtta ctgggctctt tttagctata cactatacag cccacgtaga ccttgcattt 60tccagtgtag ctcacatttg ccgagatgtt aattatggtt gactcctacg aactctccac 120gccaatggtg cctccttctt ctttatttgc ttatatatgc acacaggacg aggtatttat 180tatggttcct tcctttacct tcacgcctga tcagtaggag ttgtaattct acttctcgtg 240atggcaactg ccttccttgg ttatgtcctt ccctgaggtc aaatatcctt ctgaggagca 300actgtcatta ctaacctttt ctcggccatc ccttatattg ggccagattt agtccaatga 360atttgaggag gtttcgcagt agataacgca acactaacac gcttctttac ctttcacttt 420ctgttcccat tcattgtagc agcagctaca atcattcaca ttctttttat tcaccaaaca 480ggttctaaca atcccctagg aatcgttaga aatgtagata aagtaccatt ccatccttat 540tttacattca aagacatcac cggatttatc gtaatgctaa ctg5830所述酶切可使用EcoRV内切酶；所述电泳可采用琼脂糖凝胶电泳。日本囊对虾2种变异体经PCR扩增的产物长度为583bp。变异体I存在酶切位点 gatatc,经酶切产生284bp和299bp 2条酶切片段；在日本囊对虾变异体II不存在酶切位 点，故仍存在583bp的条带，即可对日本囊对虾2种变异体进行识别。本发明利用存在于日本囊对虾2种不同形态变异体之间的1个单核苷酸突变位点 (G/A)ATATC，构建出能正确区分2种不同形态变异体的酶切图谱，从而建立了准确、快速地 鉴别日本囊对虾2种不同形态变异体的PCR-RFLP方法。
图1是日本囊对虾2种形态变异体各8个个体PCR扩增后的产物电泳图谱。在 图 1 中，M 表示 DNA Marker DL2000，2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp 为 DNA MarkerDL2000的6条指示带，1 8为日本囊对虾变异体II的扩增产物，a h为日本囊 对虾变异体I的扩增产物。图2是图1中相应的PCR产物酶切后的电泳图谱。在图2中，M表示DNA Marker DL2000，2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp 为 DNA Marker DL2000 的 6 条指示带，① ⑧为日本囊对虾变异体II的扩增产物的酶切图谱，A、B、C、D、E、F、G、H为日本囊对虾 变异体I的扩增产物的酶切图谱。由于284bp和299bp这2个条带在琼脂糖电泳无法区分， 故只见1个条带。
具体实施例方式下面通过实施例进一步说明本发明。1)根据已知的日本囊对虾线粒体基因组全序列(参见美国NCBI网站http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/63003723)，设计1对扩增细胞色素b基因片段的引物如 下正向引物5，-caaattgttactgggctctttttagct-3，；反向引物5，-cagttagcattacgataaatccggt-3，；2)采用常规酚氯仿抽提法提取日本囊对虾变异体I和变异体II的DNA ；3)以步骤2)所得的DNA作为模板，进行PCR反应。反应体系为10X PCR 缓冲液(Buffer) 2. 5 μ 1(内含 20mmol/L Tris-HCl, 1 OOmmo 1/L KCl, 0. lmmol/L EDTA，lmmol/L DTT, 0.5% Tween20), 2. 5mmol/L MgCl2 2. 5μ 1, 2. 5mmol/L dNTP2. 0 μ 1，50ng/μ 1 模板 DNA 2μ l,5U/y 1 TaqDNA聚合酶 0. 4 μ 1，正向引物 和反向引物各1.0 μ 1，ddH20补足至25 μ 1。PCR反应程序为94°C变性5min，再进行以下循环94°C变性30s，55°C退火30s， 72°C延伸40s，共30个循环，最后72°C延伸7min。PCR反应结束后获得日本囊对虾变异体I的PCR扩增产物和日本囊对虾变异体11 的PCR扩增产物。日本囊对虾变异体I的PCR扩增产物的序列为caaattgtta ctgggctctt tttagctata cactatacag cccacgtaga ccttgcattt 60tccagtgtag ctcacatttg ccgagatgtt aattatggtt gactcctacg aactctccac 120gccaatggtg cctccttctt ctttatttgc ttatatatgc acacaggacg aggtatttat 180tatggttcct tcctttacct tcacgcctga tcagtaggag ttgtaattct acttctcgtg 240atggcaactg ccttccttgg ttatgtcctt ccctgaggtc agatatcctt ctgaggagca 300actgtcatta ctaacctttt ctcggccatc ccttatattg ggccagattt agtccaatga 360atttgaggag gtttcgcagt agataacgca acactaacac gcttctttac ctttcacttt 420ctgttcccat tcattgtagc agcagctaca atcattcaca ttctttttat tcaccaaaca 480ggttctaaca atcccctagg aatcgttaga aatgtagata aagtaccatt ccatccttat 540tttacattca aagacatcac cggatttatc gtaatgctaa ctg583其中gatatc为酶切位点。日本囊对虾变异体II的PCR扩增产物的序列为caaattgtta ctgggctctt tttagctata cactatacag cccacgtaga ccttgcattt 60tccagtgtag ctcacatttg ccgagatgtt aattatggtt gactcctacg aactctccac 120gccaatggtg cctccttctt ctttatttgc ttatatatgc acacaggacg aggtatttat 180tatggttcct tcctttacct tcacgcctga tcagtaggag ttgtaattct acttctcgtg 240atggcaactg ccttccttgg ttatgtcctt ccctgaggtc aaatatcctt ctgaggagca 300
actgtcatta ctaacctttt ctcggccatc ccttatattg ggccagattt agtccaatga 360atttgaggag gtttcgcagt agataacgca acactaacac gcttctttac ctttcacttt 420ctgttcccat tcattgtagc agcagctaca atcattcaca ttctttttat tcaccaaaca 480ggttctaaca atcccctagg aatcgttaga aatgtagata aagtaccatt ccatccttat 540tttacattca aagacatcac cggatttatc gtaatgctaa ctg583在变异体II与变异体I酶切位点gatatc相应的位置，其碱基序列为aatatc，而 EcoR V内切酶的酶切位点为gatatc，所以EcoR V只能对变异体I进行切割，无法酶切变异 体II。4)将PCR反应产物稀释20倍，进行快速酶切反应。 反应体系为8 μ 1 IOX快速酶切缓冲液(FastDigest Buffer,购自Fermentas公 司)，10μ 1稀释过的PCR产物，2μ 1 EcoR V (IU/μ 1，购自Fermentas公司)。37°C水浴，酶 切反应IOmin,之后加0. 5 μ 1 0. 5mol/L EDTA终止反应。取酶切产物5 μ 1，用1. 5%琼脂糖TBE凝胶电泳检测酶切产物。变异体I存在 284bp和299bp 2个条带，变异体II存在583bp的条带。2种变异体经引物PCR扩增的产 物长度为583bp。变异体I存在酶切位点，经酶切产生284bp和299bp 2条酶切片段；在变 异体II不存在酶切位点，故仍存在583bp的条带(参见图1和2)。
权利要求
日本囊对虾2种形态变异体的识别方法，其特征在于包括以下步骤1)根据日本囊对虾线粒体基因组全序列，设计扩增日本囊对虾细胞色素b基因片段的引物；2)提取日本囊对虾变异体I和变异体II的DNA，以所述DNA作为模板进行PCR反应，反应结束后即得日本囊对虾变异体I的PCR扩增产物和日本囊对虾变异体II的PCR扩增产物，再将所述PCR产物进行酶切，酶切后的产物进行电泳鉴定。
2.如权利要求1所述的日本囊对虾2种形态变异体的识别方法，其特征在于在步骤1) 中，所述引物为正向弓I物5，-caaattgttactgggctctttttagct-3，； 反向弓I物5，-cagttagcattacgataaatccggt-3，。
3.如权利要求1所述的日本囊对虾2种形态变异体的识别方法，其特征在于在步骤2) 中，所述提取日本囊对虾变异体I和变异体II的DNA，是采用常规酚氯仿抽提法。
4.如权利要求1所述的日本囊对虾2种形态变异体的识别方法，其特征在于在步骤2) 中，所述 PCR 反应的体系为10 X PCR 缓冲液 2. 5 μ 1,2. 5mmol/L MgCl2 2. 5 μ 1,2. 5mmol/L dNTP2. 0 μ 1，50ng/ μ 1模板DNA 2 μ 1，5U/ μ 1 TaqDNA聚合酶0· 4 μ 1，正向引物和反向引物 各 1. 0μ 1，ddH20 补足至 25 μ 1。
5.如权利要求1所述的日本囊对虾2种形态变异体的识别方法，其特征在于在步骤2) 中，所述PCR反应程序为94°C变性5min，再进行以下循环94°C变性30s，55°C退火30s， 72°C延伸40s，共30个循环，最后72°C延伸7min。
6.如权利要求1所述的日本囊对虾2种形态变异体的识别方法，其特征在于在步骤2) 中，所述日本囊对虾变异体I的PCR扩增产物的序列为caaattgtta ctgggctctt tttagctata cactatacag cccacgtaga ccttgcattt 60 tccagtgtag ctcacatttg ccgagatgtt aattatggtt gactcctacg aactctccac 120 gccaatggtg cctccttctt ctttatttgc ttatatatgc acacaggacg aggtatttat 180 tatggttcct tcctttacct tcacgcctga tcagtaggag ttgtaattct acttctcgtg 240 atggcaactg ccttccttgg ttatgtcctt ccctgaggtc agatatcctt ctgaggagca 300 actgtcatta ctaacctttt ctcggccatc ccttatattg ggccagattt agtccaatga 360 atttgaggag gtttcgcagt agataacgca acactaacac gcttctttac ctttcacttt 420 ctgttcccat tcattgtagc agcagctaca atcattcaca ttctttttat tcaccaaaca 480 ggttctaaca atcccctagg aatcgttaga aatgtagata aagtaccatt ccatccttat 540 tttacattca aagacatcac cggatttatc gtaatgctaa ctg583其中gatatc为酶切位点。
7.如权利要求1所述的日本囊对虾2种形态变异体的识别方法，其特征在于在步骤2) 中，所述日本囊对虾变异体II的PCR扩增产物的序列为caaattgtta ctgggctctt tttagctata cactatacag cccacgtaga ccttgcattt 60 tccagtgtag ctcacatttg ccgagatgtt aattatggtt gactcctacg aactctccac 120 gccaatggtg cctccttctt ctttatttgc ttatatatgc acacaggacg aggtatttat 180 tatggttcct tcctttacct tcacgcctga tcagtaggag ttgtaattct acttctcgtg 240 atggcaactg ccttccttgg ttatgtcctt ccctgaggtc aaatatcctt ctgaggagca 300actgtcatta ctaacctttt ctcggccatc ccttatattg ggccagattt agtccaatga 360 atttgaggag gtttcgcagt agataacgca acactaacac gcttctttac ctttcacttt 420 ctgttcccat tcattgtagc agcagctaca atcattcaca ttctttttat tcaccaaaca 480 ggttctaaca atcccctagg aatcgttaga aatgtagata aagtaccatt ccatccttat 540 tttacattca aagacatcac cggatttatc gtaatgctaa ctg583。
8.如权利要求1所述的日本囊对虾2种形态变异体的识别方法，其特征在于在步骤2) 中，所述酶切使用EcoR V内切酶。
9.如权利要求1所述的日本囊对虾2种形态变异体的识别方法，其特征在于在步骤2) 中，所述电泳采用琼脂糖凝胶电泳。
全文摘要
日本囊对虾2种形态变异体的识别方法。涉及日本囊对虾，提供准确、快速的日本囊对虾2种形态变异体的识别方法，包括以下步骤设计扩增日本囊对虾细胞色素b基因片段的引物；提取日本囊对虾变异体I和变异体II的DNA，以所述DNA作为模板进行PCR反应，再将所述PCR产物进行酶切，酶切后的产物进行电泳鉴定。日本囊对虾变异体I存在酶切位点gatatc，经酶切产生284bp和299bp 2条酶切片段；在日本囊对虾变异体II不存在酶切位点，故仍存在583bp的条带，即可对日本囊对虾2种变异体进行识别。
文档编号C12Q1/68GK101979663SQ201010563289
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者刘洪涛, 曾凡荣, 游欣欣, 王军, 苏永全, 董宏标 申请人:厦门大学