专利名称：脂联素基因表达水平在肉牛肌肉大理石纹等级鉴定中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种脂联素基因表达水平在肉牛肌肉大理石纹等级鉴定中的应用，用于监测肉牛的等级及最适宜的屠宰时间的确定。
背景技术：
我国畜牧业畜禽肉质分子水平方面的研究还刚刚起步，畜禽生长发育、新陈代谢、 遗传变异、免疫与疾病等，就本质而言，都是动物基因的表达调控发生了改变的结果，许多生理现象的彻底阐明，最终需要在基因水平上进行解释，所以从分子水平上来解释各种基因与动物功能、对机体的作用机制等问题。随着分子生物学技术不断发展，越来越多与代谢有关的动物基因被克隆和鉴定，人们对基因表达与肉质的功能的关系越来越感兴趣。寻求肉质优良性状的功能基因的研究已成为当今畜牧业研究的一个热点领域；如何通过功能基因表达的调节来调控肉质的性状，从而使畜禽生产达到优质高效已成为现代畜牧业研究的 ^^点ο目前，PCR技术已广泛应用于遗传性疾病、肿瘤疾病、感染性疾病的临床诊断及动物代谢有关的动物基因的分析。常规PCR法虽然具有灵敏度高，特异性强的优点，但在实验中，影响实验结果的因素很多，在实验中既没有对照标准，也没有质控措施，故其结果很难重复，而畜禽生产中营养代谢、肉质相关的基因的检测，必须要有量的界定。因此，必须利用定量PCR方法进行测定，才能满足畜牧业上的需求。自1985年Saiki等首次描述聚合酶链反应(PCR)技术以来，因其展现了前所未有的敏感性和特异性，受到了人们的高度重视。短短的二十年时间，各种各样以PCR为基础的DNA序列的扩增和控制方法得到了迅猛发展，广泛应用于畜牧兽医研究的各个领域。并且也逐渐成为畜牧生产代谢相关基因研究强有力的分析工具。随着研究的深入，研究者不仅要知道特定DNA序列的存在与否，在某些情况下更要进行精确的核酸定量。人们曾运用 Southern、Northern、狭孔印迹定量分析特异核酸序列，但这些方法的灵敏度低，操作复杂， 环境要求苛刻，有时需要采用对人体和环境有害的放射性物质进行标记。因此，人们对采用 PCR方法进行核酸定量进行了深入的研究，在此基础上产生了多种定量PCR方法。定量PCR的问世是继定性PCR(即常规PCR)后分子生物学方法学研究的一大飞跃，实现了对核酸信息量的分析比较，为畜禽生产提供了更多、更有效的基因水平信息。近年来研究和应用较多的定量PCR方法主要有5个，即对PCR产物的直接定量、极限稀释法、非竞争性对照基因定量法、竞争性定量PCR和荧光定量PCR。这几种方法各有利弊，对其选择取决于实验目的、靶基因的特性、靶序列分子数的估计范围、准确度的要求、需要相对还是绝对定量
PCR产物的直接定量又称外对照定量PCR，即测量PCR产物的数量。但这个定量过程必须在指数扩增期进行，并且要对一个反应过程中多个时间点的产物量进行线性回归分析。 通过这种方法可以消除管与管之间的差异，但不能消除样本与样本之间的差异。外对照定量PCR虽然相对简单，但试验的精确性和可重复性较差。因此，采用外对照定量PCR时，要分析试验的精确性和可重复性。目前已较少使用。极限稀释法是通过稀释阳性标本直至靶基因不能再扩增为止。稀释程度可用来计算起始靶基因的分子数。该方法具有操作简便，灵敏度高的特点。这种分析方法，一个重要优点即定量不依赖扩增效率，但每个样品需要多次PCR反应，工作量很大。但要取得可靠结果则必须满足几个严格条件①优化反应条件，使检测具有可重复性，一个或几个靶分子能被稳定检测出；②对每个稀释度作多次PCR，其结果用统计学的Poisson分布进行分析； ③必须严格避免污染以免造成假阳性结果。非竞争性对照基因定量，即是靶基因与参照基因的同步扩增，又称内对照PCR定量。由于定量的目的核酸样本往往含有大量的非目的序列DNA或RNA，这就为目的序列和细胞中的某个特异序列在同一个PCR管中共同扩增提供了方便。该方法的优点是可以消除管与管之间的变异，并在一定程度上能够消除样本与样本之间的变异，但最好定量处于扩增指数期。竞争性定量PCR是靶序列与一个已知浓度的内部标准在同一反应管中竞争性地共同扩增，二者使用相同引物，靶序列和内部标准共同竞争引物、核苷酸和聚合酶。竞争性定量PCR能消除管间及样本间的变异，重复性好，定量范围较广，结果比较可靠。使用竞争性定量PCR，主要的问题是需要构建竞争模板，灵敏性低于实时荧光定量技术。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前普遍采用的是iTaqman技术和Lightcycler技术。实时荧光定量PCR的出现，简化了 mRNA的重复定量和检测过程，并可精确定量。实时荧光定量PCR反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高、速度快、结果准确、全封闭反应等优点，与传统RT-PCR相比有明显的优势，在畜牧兽医中已得到了广泛的应用。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种脂联素mRNA的实时荧光定量检测方法。本发明的另一个目的在于提供一种脂联素基因表达水平在肉牛肌肉大理石纹等级鉴定中的应用，其可以在肉牛屠宰前，通过活体监测尾部脂肪脂联素mRNA水平，可以直接推测其牛肉的大理石花纹等级，进而确定最适宜的屠宰时期；可为调控优质肉牛肌内脂肪的沉积和优质高档牛肉的生产奠定理论基础。本发明的技术方案是这样实现的一种脂联素的实时荧光定量检测方法，其特征在于采用克隆脂联素基因cDNA全序列，建立脂联素mRNA的实时荧光定量检测方法；具体步骤如下
1 材料与方法
1. 1 引物、探针的设计和合成应用生物信息学知识，从Genebank中查阅出 ADPN的DNA和mRNA序列，根据引物设计原则，并利用I^rimer Express 2. 0设计软件， 设计出扩增ADPN mRNA基因片段的引物和探针，序列如下。 表1 ADPN引物和探针
权利要求
1.一种脂联素mRNA的实时荧光定量检测方法，其特征在于采用克隆脂联素基因cDNA 全序列，建立脂联素mRNA的实时荧光定量检测方法；具体步骤如下(1)应用生物信息学知识，从Genebank中查阅出ADPN的DNA和mRNA序列，根据弓|物设计原则，并利用Primer Express 2. 0设计软件，设计出扩增ADPN mRNA基因片段的引物和探针，序列如下；表1 ADPN引物和探针
2.一种脂联素基因表达水平在肉牛肌肉大理石纹等级鉴定中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种脂联素基因表达水平在肉牛肌肉大理石纹等级鉴定中的应用，其特征在于采用克隆脂联素基因cDNA全序列，建立脂联素mRNA的实时荧光定量检测方法；并确定脂联素基因表达水平在肉牛肌肉大理石纹等级鉴定中的应用。其采用荧光定量RT-PCR检测ADPNmRNA方法具有很好的灵敏性和重复性。检测结果用拷贝数来表示起始模板的含量,相对半定量RT-PCR中的比较值更为准确可靠，ADPNmRNA水平与育肥牛的肌肉大理石纹呈负相关(延边黄牛r=-0.87;P﹤0.001，n=9)和(草原红牛r=-0.79;P﹤0.001，n=9)。准确率达95%。
文档编号C12Q1/68GK102477461SQ20101055878
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月25日 优先权日2010年11月25日
发明者丛立新, 常维毅, 张辉, 李鹏, 陈晓霞 申请人:吉林农业科技学院