专利名称：紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白及其编码基因与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种植物晚期胚胎富集蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
晚期胚胎发生丰富蛋白(Late Embryogenesis Abundant Protein)是生物体中广泛存在的一类与渗透调节有关的家族蛋白。研究发现在植物胚胎发育晚期，LEA蛋白表达量十分丰富，D7LEA蛋白在成熟棉花胚细胞中占非细胞器胞质蛋白质的4%，且在环境胁迫如干旱、低温、盐胁迫、ABA、紫外辐射和NaHCO3等条件下LEA蛋白mRNA也会大量累积，被认为是在胁迫过程中对植物起保护作用的物质之一。LEA蛋白在细胞中分布广泛，参与蛋白稳定、分子保护、离子结合和防止氧化及参与细胞膜连接、折叠和稳定等作用。这些是通过体外实验或软件预测蛋白结构得到的单个LEA蛋白的功能，对多种LEA蛋白的体内实验和蛋白之间的相互作用的研究越来越受到关注。不管在植物，动物还是微生物中，LEA蛋白并不是唯一的亲水蛋白，还有很多亲水糖和与脱水相关的溶质等。因此研究LEA蛋白与它们之间的相互作用也有非常重要的意义。许多研究已经报道，LEA蛋白可以在多种胁迫如干旱、 低温、盐胁迫、ABA、紫外辐射和NaHCO3等条件下大量积累从而提高了植物的抗性，因此对未知LEA基因的克隆和表达鉴定也是非常必要的。紫花苜蓿是一种重要的优质高产牧草，对畜牧业的发展起着重要的作用。通过 RACE方法克隆得到MsLEA3-l基因全长，对其编码蛋白进行分析，探讨该基因在提高转基因植物抗干旱、低温、盐胁迫等方面提供一定的支持。MsLEA3-l基因作为一个潜在的抗逆候选基因，其全基因的克隆与功能分析以及对植物的遗传转化对于培育高抗逆的植物品种将具有一定的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白，来源于紫花苜蓿(Medicago sativa)，是1)具有序列表中序列2所示氨基酸残基序列的蛋白质；或2)是将序列2所示氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2所示氨基酸残基序列相同活性的由序列2所示蛋白质衍生的蛋白质。本发明的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白，其中所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。本发明所提供的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因，是下列DNA分子之一1)其核苷酸序列为序列表中的序列1自5’端第157到第1465位所示；2)编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA分子；3)5’端非编码区为序列表中序列3，从5’端第397到第805位所示；
4) 3’ RACE产物序列为序列表中序列4，从5’端第419位到第17 位所示；5) 5’ RACE产物序列为序列表中序列5，从5’端第1位到第434位所示；6)与序列表中序列1所示的DNA分子具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。本发明的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因，其中所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因如序列表中的序列1所示。本发明还提供了含有所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因的表达载体。本发明还提供了含有所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因的细胞系。本发明还提供了扩增所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因中任一片段的引物。本发明的所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因可用在苜蓿耐盐分子机制研究中。本发明的所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因可用在植物耐盐性状改良中。本发明的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因将为苜蓿耐盐分子机制研究，以及对植物耐盐性状的改良打下坚实的基础，具有重要意义。
图1为MsLEA3_l基因3' -RACE扩增的片断。图2为MsLEA3_l基因5' -RACE扩增的结果。图3为紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白与其它植物晚期胚胎富集蛋白的同源性分析。图4为紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白与其他植物晚期胚胎富集蛋白的氨基酸序列进化树分析。图5为MsLEA3_l蛋白亲水性图分析。图6为MsLEA3_l蛋白的二级结构预测。
具体实施例方式实施例1、(一 )紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白编码基因的获得紫花苜蓿品种中苜一号(Medicago sativa L. v. zhongmu No. 1)种子在下催芽2d后，在光照培养，每天光照12h，至两叶一心期开始用250mmol/L NaCl胁迫处理 Oh, 0. 5h, lh, 3h, 6h, 12h, 24h 以备提取总 RNA。RNA提取参照张劲松等人的方法进行(张劲松，等.中国科学，B辑，1995，25 (5) 659 669)，苜蓿叶片在液氮中研碎，悬于抽提液(4mol/L硫氰酸胍中钠，5g/l十二烷基肌氨酸，25mmol/L柠檬酸钠，0. lmol/L^巯基乙醇)，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，再经4mol/LLiCl悬浮RNA沉淀、氯仿抽提1次，然后用乙酸钠/乙醇沉淀总RNA，最后将RNA溶于水中，贮存于_20°C备用，用0. 8%的琼脂糖检测RNA的完整性。通过反向Northern斑点杂交技术，对一个紫花苜蓿盐诱导抑制消减杂交cDNA文库进行筛选。获得一个在盐诱导条件下表达量上调的克隆。通过测序获得了 409bp的cDNA 片段。以获得的cDNA片段序列为基础，设计用于扩增3’端和5端’特异引物GSP 1 :5，-AAGATAAGGACACCACCACCACT-3，GSP2 :5， -TCAGTGGTGGTGGTGTCCTTATC-3，按照SMART RACE cDNAAmplif ication Kit (Clontech, Cat. no. K1811-1)的方法作 RT-PCR。3，端的扩增的循环参数为94 V变性k，68°C退火IOs，72°C延伸anin，35个循环。产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩出一 1200bp左右的DNA片断(如图1所示，图1中 1:1: MSLEA3-1基因3'末端扩增片断；M :DN2000DNA分子量标准)。5，端的扩增循环参数为94°C变性5s，72°C延伸;3min，5个循环；94°C变性k， 70°C退火10s，72°C延伸3min，5个循环；94°C变性5s，68°C退火10s，72°C延伸2min，25个循环。产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩出一 500bp左右的DNA片段(如图2所示，图2中5 μ 1 巢式PCR产物电泳结果；M :DN2000DNA分子量标准)。产物回收纯化，连接，转化，测序，测序结果MsLEA3-l基因3'末端扩增片断序列为SEQID Na 4, MsLEA3-l基因5'末端扩增片断为SEQ ID Na :5。借助DNA拼接软件contig，获得该基因的cDNA的完整序列，该序列全长为 1728bp，具有SEQ IDNa :1的DNA序列，157_1465bp为其完整编码区域，编码的蛋白含有435 个氨基酸残基，具有SEQ ID No 2的氨基酸残基序列。( 二)紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的功能分析(1)序列比较分析运用BLAST和DNAMAN软件对紫花苜蓿MsLEA3_l蛋白序列进行比较分析。其氨基酸序列与大豆的种子成熟蛋白的同源性E值为le-108，与已知的其他LEA蛋白也有较强的同源性，图3显示与MsLEA3-l蛋白比对E值在Ie-IO以上的氨基酸序列同源比对结果，涂色部分为同源序列。图4显示各氨基酸序列的进化树关系。结果表明紫花苜蓿MsLEA3-l 蛋白与大豆的两个LEA蛋白同源性最高(AAA91965，CAA80491)，亲缘关系最近。从LEA蛋白和多肽的同源比对结果和进化树分析结果显示，登录号为NP 001024042和CAF32327两个多肽与其他多肽之间序列同源性很低，这主要是由于第3组LEA蛋白序列除了有11个氨基酸的重复结构之外，其序列特异性较高有关。其他7个物种之间LEA蛋白在N端有较高的同源性，而C端同源性较低，事实上这7种LEA蛋白为一类LEA蛋白，都为第3组LE蛋白。(2)表达载体的构建设计引物用于构建植物表达载体LEAl :5，-GCTCTAGAATGGTGATGGCTCCAAGATTGGTT-3‘LEA2 :5， -GCAAGCTTTTAAAGCTCAGGATCTCGGCGTTGTC-3’其中下划线部分分别表示Hindlll，XbaI酶切位点。提取苜蓿的总RNA，用oligo (dl%8作反转录。反转录产物用引物LEA1，LEA2进行 PCR，得到含有MsLEA3-l完整开放阅读框的DNA片段，连接到pMD_18T载体上，获得重组克隆载体，命名为PMD-LEA。转化大肠杆菌，并送到华大基因生物公司测序。对于含有正确序列的菌株，摇菌提取质粒，用HindIII和^CbaI分别双酶切pMD-LEA和pKYLX7载体，回收、纯化酶切产物。按照载体插入片段为1 7的比例，取适量线性化载体pKYLX7和MsLEA3-l 的纯化片段混合，用T4DNA连接酶于16°C连接过夜，从而获得含有MsLEA3-l编码序列的重组表达载体，命名为PKYLX7-LEA。挑取农杆菌LBA4404单菌落接种到^iil YEB液体培养基(含链霉素125ug/ml)中， 振荡培养过夜。将过夜培养物500ul接种于50ml的YEB液体培养基中，285000g，4°C
离心5min，收集菌体200rmp振荡培养至0D600为0. 5左右。5000g，4°C离心5min，收集菌体。于冰上加入IOml 0. 15M的Nacl溶液悬浮细胞。5000g，4°C离心5min，收集菌体。加入预冷的Iml 20mMCaCl重悬。取200ul感受态细胞，加入lug pKYLX7_LEA，冰浴30min，液氮中冻Imin0 37°C热激。加入Iml的YEB液体培养基，28°C振荡培养4h，IOOOOg离心30s，加入IOOul的YEB重悬细胞。菌液涂布于含有lOOug/mlkan和125ug/ml链霉素的YEB固体选择培养基平板上，培养过夜得到LBA4404-LEA。(3) LBA4404-LEA叶盘法转化烟草用5 IOmm打孔器制备叶盘外植体；获得的外植体在LBA4404-LEA菌液中浸泡 8min ；用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺一层滤纸的共培养培养基，28°C 暗培养；3d后，将材料转到含有抗生素的诱导愈伤组织形成及诱芽培养基中进行培养；待抗性芽生长至2-3cm高时转入生根培养基中诱导生根；待烟草长出根，转移到花盘中，待种子成熟，收集种子。(4)转基因阳性植株的筛选制备MS (0.43% MS盐，3%蔗糖，琼脂，用KOH调pH至5. 7)选择培养基。T1代转基因种子表面消毒(70%乙醇浸泡anin，0. 5%次氯酸钠浸泡lOmin，无菌水清洗aiiinX 5 次)。平铺于含相应抗生素(40 μ g/ml Kan和50 μ g/ml的头孢霉素)的MS选择培养基中， 密度为100-200粒种子/皿。4°C春化3天，移入生长箱中(22°C恒温二4小时光照，光强为 30-40 μ mol. m_2. s-1)。7天后挑选转化体，表现为真叶健康呈深绿色，根伸长至培养基中。将转化体转至正常的MS培养基中，10天后转入土壤。收获T2代种子，备用观察，并做生理生化鉴定。(5)转基因植株耐盐性的鉴定材料处理当转基因再生植株高8 10cm、根长4 5cm以上时，移栽到直径为 12cm花盆内，于温室中培养。每天每盆加50mLHOagland营养液(pH值为6. 5)，培养30d后， 分别用浓度为100mmol/L、200mmol/L、M0mmol/L和300mmol/L的NaCl溶液胁迫处理，在处理后Od和4d取样备用。叶片相对含水量先测T2代转基因植株叶片鲜重Wf，再将叶片浸入蒸馏水中数小时，使叶片吸水成饱和状态。取出用吸水纸吸取表面的水分，立即放入已知重量的称瓶中称重，再放入蒸馏水中一段时间后取出吸干外面水分，再称重，直至重量不再增加为止。此时即为叶片吸水饱和时的重量Wt，再将样品烘干，求得组织干重W，从而计算叶片相对含水量(RWC)。相对含水量(RWC)= (fff-ffd)/(Wt) X 100%T2代转基因植株L2和L8分别比非转基因植株的相对含水量高10. 0% (P < 0. 05)和8. 5%，T2代转基因植株L1、L5和L6分别比非转基因植株高23. 7% (P < 0. 05) ,22. 5% 和21. 5%。实验结果显示，外源MsLEA3-l基因的转入可能阻止了转基因植株叶片水分损失，提高了植物的保水能力。夕卜渗率取不同处理植株叶片，流水冲洗后再用蒸馏水冲洗3次，吸干；剪成约Icm2的小叶片(或用直径为Icm的打孔器钻取小圆片)，注意除掉大叶脉。然后用电子天平称取3份， 每份1. 0g，放入小烧杯中，准确加入20mL重蒸馏水，振荡30s，用真空抽气泵抽气5次，使细胞中的空气被抽出，使叶片全部浸入重蒸馏水中，在室温下静置池，然后用雷磁DDSJ2308A 型电导仪测定溶液的电导率R，再将其置于沸水浴中煮沸15min，冷却后测定其电导率R。。外渗率(％ )=处理电导率R/煮沸电导率RtlX 100实验结果表明，240mmol NaCl胁迫下，T2代转基因植株和非转基因植株的差异达到显著水平，T2代转基因植株的电导率明显低于非转基因植株。丙二醛(MDA)含量采用巴比妥酸(TBA)显色法，剪取各不同处理的植株叶片中部0. 5g，放入研钵中， 加入5%三氯乙酸(TCA) 2. OmL，少量石英砂研磨，研磨液倒入离心管中。另取3. OmL的TCA 用来清洗研钵，清洗液也倒入离心管中，在3000r/min的离心机中离心lOmin。分别取上清液2mL各3份，各放入IOmL管中，每管中加入2mL 0. 67%硫代巴比妥酸(TBA)，混合后在 100°C水浴中煮沸30min。反应溶液冷却后在离心机中以3000r/min离心lOmin，最后分别在450，532和600nm处测定上清液的吸光度。按公式C = 6. 45X (A532-A600) -0. 56A450， 计算MDA含量并进行换算。在盐胁迫下，各株系的MDA含量都增加了，但是T2代转基因植株的增加量明显低于对照。说明，外源MsLEA3-l基因起到保护抗氧化系统的作用，提高了转基因烟草的抗氧化能力。脯氨酸含量根据Bates等人的方法，称取不同处理的植物叶片各0. 5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml 3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取IOmin (提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液置于带塞试管中，加入2ml冰醋酸及aiil 2. 5%酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入細1甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至IOml离心管中，在3000r/ min离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度(A)值。在盐胁迫下，脯氨酸在T2代转基因植株中的积累极显著高于对照。T2代转基因植株L1、L2和L7中的脯氨酸含量比对照高出4倍，而T2代转基因植株L3、L4、L5、L6和L8比对照高5倍。综上所述，外源MsLEA3-l基因可以提高转基因烟草的抗盐性。以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
权利要求
1.一种紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白，是1)具有序列表中序列2所示氨基酸残基序列的蛋白质；或2)是将序列2所示氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2所示氨基酸残基序列相同活性的由序列2所示蛋白质衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
3.紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因，是下列DNA分子之一1)其核苷酸序列为序列表中的序列1自5’端第157到第1465位所示；2)编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA分子；3)5’端非编码区为序列表中序列3，从5’端第397到第805位所示；4)3’ RACE产物序列为序列表中序列4，从5’端第419位到第17 位所示；5)5'RACE产物序列为序列表中序列5，从5’端第1位到第434位所示；6)与序列表中序列1所示的DNA分子具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA分子。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因如序列表中的序列1所示。
5.含有权利要求3或4所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因的表达载体。
6.含有权利要求3或4所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因的细胞系。
7.扩增权利要求3或4所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因中任一片段的引物。
8.权利要求3或4所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因在苜蓿耐盐分子机制研究中的应用。
9.权利要求3或4所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的编码基因在植物耐盐性状改良中的应用。
全文摘要
本发明公开一种紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白，是具有序列表中序列2所示氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的所示氨基酸残基序列相同活性的由序列2所示蛋白质衍生的蛋白质。本发明的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白及其编码基因将在苜蓿耐盐分子机制研究、豆科植物耐盐性状改良中发挥重要作用。
文档编号C12N15/29GK102477087SQ20101055756
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者孙彦, 康俊梅, 张铁军, 杨青川, 白永琴 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所