专利名称：嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒及其应用，属于分子检测技术领域。
背景技术：
嗜酸氧化亚铁硫杆菌(AcidithicAacillus ferrooxidans)是一种硫杆菌，属化能 自养菌、革兰氏阴性细菌，好氧嗜酸，被广泛地应用于浸矿、有用金属的回收、煤的脱硫及含 硫废水的处理，是在资源微生物处理工艺中应用最多、适应性最强的一种细菌；另一方面在 输水、输油设备和管线中存在的嗜酸氧化亚铁硫杆菌加速管道腐蚀，需要严格控制。嗜酸氧 化亚铁硫杆菌可广泛存在于土壤、海水、淡水、固废、矿泉和金属沉积物等，随着氧化亚铁硫 杆菌对人类生产、生活越来越广泛的影响，人们对其有效检测方法也越来越关注。目前对嗜酸氧化亚铁硫杆菌存在与否的检测主要依赖在含亚铁的培养基上 先经过富集培养后，再检测亚铁离子或其他金属的氧化性能；富集培养通常需要在含 FeSO4 · 7H20的低pH(pH = 2)的Leathen或9K培养基中进行，由于该细菌生长缓慢、代谢 周期长，一般需要观 30°C恒温培养7 10d。例如，在石油天然气行业广泛采用的铁细 菌检测标准方法一绝迹稀释法，其原理就是将水样逐级稀释，注入到测试瓶中进行接种，在 恒温下培养7-14d，根据阳性反应和稀释倍数，计算水样中铁细菌的数目。由于琼脂在强酸 性培养基中理化性状受干扰，培养基的配置步骤繁琐，也增加了富集影响的难度，目前仍有 很多嗜酸氧化亚铁硫杆菌难以用上述培养基培养，因此不能被进一步有效检出。近年来，分子生物技术也在嗜酸氧化亚铁硫杆菌的检测中开始应用，其中一类是 与培养技术相结合的通过PCR反应扩增嗜酸氧化亚铁硫杆菌特征基因进行检测，其中培养 过程与前述相似，设计的引物可以针对16S rRNA基因、亚铁氧化酶基因。这种技术仍然以 嗜酸氧化亚铁硫杆菌的培养为基础，使应用受到限制。另外根据嗜酸氧化亚铁硫杆菌的16S rRNA基因特异性保守序列，设计和选择特 异性探针以及荧光标记物质，通过探针与目标微生物rRNA基因特异性片断进行杂交反应， 使目标微生物特异性地带有荧光标记，利用显微观察检测目标微生物在水样中的存在与分 布，这种方法不依赖于对微生物进行培养，特异性高；但当环境样品中含菌数量低时，由于 DNA含量低不能成功检测，另外操作相对繁琐。铜蓝蛋白(Rus)是rus基因编码的一种水溶性铜结合蛋白，分子量为16kDa，从不 同嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株中分离的Rus，其氨基酸序列的差别小于10%，目前在其它革 兰氏阴性细菌中还没有发现有Rus的存在，表明rus基因可以作为嗜酸氧化亚铁硫杆菌的 一个很好的分子检测标志。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒及其应用。一种嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒，其特征在于，它含有如下引物
外引物Primerl :5’ -GTACATGTGGTCGCGGCGGC-3‘ Primer2 5' -ACATACCGGTGGCGGCATGC-3‘ 内引物Primer3 5' -ACCTTGGAGATTCCCGCGGG-3’ Primer4 :5’ -TAGTAAGTGCCCGCCGTCGG-3，。所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒中的2XPCR反应液由双蒸水配制，其组分
浓度为Taq DNA聚合酶 0.08~0.12u/ul dNTP 混合物(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 0. 6 lmmol/L MgCl2 2 4mmol/LKCl80 120mmol/L
Tris-HCl(pH8. 3) 16 24mmol/L 上游内引物(Primerl) 0. 12 0. 2umol/L下游内引物(Primer2) 0. 12 0. 2umol/L上游外引物(Primer3) 1. 2 2umol/L下游外引物(Primer4) 1. 2 2umol/L上述嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒在检测嗜酸氧化亚铁硫杆菌中的应用，步骤
如下(1)取样品，直接提取基因组DNA;(2)取步骤⑴制得的基因组DNA，加双蒸水至与2XPCR反应液等体积，然后与嗜 酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒中2 XPCR反应液混合，控制PCR反应条件如下 反应 1预变性93°C，2分钟；然后，变性92°C，15秒，退火58°C，15秒，延伸72°C，5秒， 25个循环后；延伸72 °C，2分钟；反应 2预变性93°C，2分钟；然后，变性92°C，15秒，退火56°C，15秒，延伸:72°C，15 秒，35个循环后；延伸72°C，2分钟；(3)将步骤O) PCR反应后的产物经琼脂糖凝胶电泳后，与阳性对照进行比对。原理说明本发明是根据从不同嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株中分离的Rus蛋白中，其氨基酸序 列的同源性较高，而在其它革兰氏阴性细菌中尚未发现有Rus的存在，针对嗜酸氧化亚铁 硫杆菌rus基因中的保守序列，设计两对引物，第一次PCR反应扩增一对外引物之间的序 列，扩增产物作为第二次PCR反应的模板，扩增内引物之间的rus基因中218bp保守序列。 对于环境样品中浓度极低的嗜酸氧化亚铁硫杆菌通过两次PCR反应，可以扩增出足够量的 DNA从而被检出；而其他菌种即使在第一次PCR反应中产生非特异性扩增产物，在第二次 PCR反应时不会有引物结合上去，不会产生相应的扩增产物。因此通过上述巢式PCR反应扩 增嗜酸氧化亚铁硫杆菌rus基因中的保守序列，保证了检测的特异性、灵敏性。与现有的技术相比，本发明所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒具有以下优点
(1)该试剂盒操作简单，使用方便，PCR反应混合体系配制容易，检测步骤简单容 易掌握，可大大提高检测速度；(2)该试剂盒灵敏性高，样品检测时不需要对菌群单独进行富集培养，大大提高了 检测的应用范围；(3)该试剂盒采用内外两对引物、中途进退式巢式PCR扩增技术，检测结果具有高 特异性和高灵敏性。
具体实施例方式为了更加详细地解释本发明，下面将给出本发明的实施例，这些实施例仅仅出于解释和说明的目的，不应该被理解为对本发明范围的限制。实施例1一种嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒，其特征在于，它含有如下引物外引物Primerl :5’ -GTACATGTGGTCGCGGCGGC-3，(SEQ ID NO. 1)Primer2 5' -ACATACCGGTGGCGGCATGC-3，(SEQ ID NO. 2)内引物
Primer3:5，-ACCTTGGAGATTCCCGCGGG-3’ (SEQ ID NO. 3) Primer4:5，-TAGTAAGTGCCCGCCGTCGG-3’ (SEQ ID NO. 4) 2XPCR反应液由双蒸水配制，其组分浓度为Taq DNA聚合酶 0. IU/μ L dNTP 混合物(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 0. 75mmol/L MgCl2 3mmol/LKCl 1OOmmo1/LTris-HCl(pH8. 3) 20mmol/L 上游内引物(Primerl) 0. 15ymol/L下游内引物(Primer2) 0.15ymol/L上游外引物(Primer3) 1.2 μ mol/L 下游外引物(Primer4) 1. 2 μ mol/L使用时，将上述PCR反应液用双蒸水稀释一倍即可。实施例2上述嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒在检测嗜酸氧化亚铁硫杆菌中的应用，步骤如下(1)从腐蚀金属管道取得管垢，采用Omega生物技术公司生产的土壤DNA提取试剂 盒(商品号D5625)，参照使用说明，具体操作如下(a)取0. 2-0. 5g管垢与0. 5g玻璃珠混合，加ImL含10 μ L 2_巯基乙醇的SLX缓 冲液，涡轮混勻3-5分钟；(b) 70°C水浴放置10分钟，漩涡混勻2-3次，每次10秒；(c)室温3，000-5，OOOrpm离心5分钟，将上清液800 μ L转移至2mL新离心管，加 入270 μ L缓冲液SP2，涡轮混勻30秒；
(d)冰上放置5分钟后，4°C最高转速(13，OOOg)离心5分钟；(e)将上清液转移至2mL新离心管，加入0. 7体积的异丙醇，颠倒混勻20次。(对 与DNA含量低的样品可在-20°C先放置1小时后再离心)4°C最高转速(13，OOOg)离心10 分钟；(f)弃上清液，在吸水纸上倒置离心管1分钟，除去管中液滴，加200 μ L洗脱缓冲 液，涡轮混勻10秒，65°C水浴放置10-20分钟溶解DNA ；(g)力卩50 μ L试剂HTR，涡轮混勻10秒，室温放置2分钟，最高转速(13，OOOg)离 心2分钟；(h)转移上清液至1. 5mL新离心管，加入等体积的XP2缓冲液，涡轮混勻10秒；(i)取混合液700 μ L转移至HiBind DNA吸附柱中，室温10，OOOg离心1分钟，弃
滤过液；重复操作一次；(j)将吸附柱置原离心管，加入300 μ L ΧΡ2缓冲液，室温10，OOOg离心1分钟，弃 滤过液，将吸附柱置新的离心管；(k)加入700 μ L SPff洗涤缓冲液，室温10，OOOg离心1分钟，弃滤过液；重复操作
一次；(1)将吸附柱置空的原离心管，室温最高转速(13，OOOg)离心2分钟；(m)将吸附柱置新的离心管，加30-50 μ L洗脱缓冲液于吸附柱中央，65°C水浴放 置10分钟，最高转速(13，OOOg)离心1分钟，洗脱DNA;再加入30-50 μ L洗脱缓冲液，重复 洗脱DNA，得基因组DNA。(2)取步骤(1)制得的基因组DNA 5 μ 1，用双蒸水20 μ 1稀释后，加入25 μ 1的嗜 酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒，放入PCR仪，设定PCR反应程序如下
反应1预变性93 0C2分钟变性92 0C15秒25个循环退火58 0C15秒延伸7215秒后延伸72 2分钟反应2预变性93 "C2分钟变性92 "C15秒35个循环退火56 "C15秒延伸7215秒后延伸72 0C2分钟 阳性对照可采用下表配制反应体系
权利要求
1.一种嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒，其特征在于，它含有如下引物外引物 Primerl :5’ -GTACATGTGGTCGCGGCGGC-3，Primer2 :5’ -ACATACCGGTGGCGGCATGC-3， 内引物Primer3 :5’ -ACCTTGGAGATTCCCGCGGG-3’ Primer4 :5’ -TAGTAAGTGCCCGCCGTCGG-3，。
2.如权利要求1所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述嗜酸氧化 亚铁硫杆菌检测试剂盒中的2XPCR反应液由双蒸水配制，其组分浓度为Taq DNA聚合酶0. 08 0. 12U/yLdNTP混合物1. 5 2mmol/LMgCl22 4mmol/LKCl80 120mmol/LTris-HCl16 Mmmol/L上游内引物0. 12 0. 2ymol,/L下游内引物0. 12 0. 2ymol,/L上游外引物1. 2 2ymol/L下游外引物1. 2 2ymol/L
3.权利要求1所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒在检测嗜酸氧化亚铁硫杆菌中的 应用，步骤如下(1)取样品，直接提取基因组DNA;(2)取步骤(1)制得的基因组DNA，加双蒸水至与2XPCR反应液等体积，然后与嗜酸氧 化亚铁硫杆菌检测试剂盒中2 XPCR反应液混合，控制PCR反应条件如下反应1预变性93°C，2分钟；然后，变性92°C，15秒，退火58°C，15秒，延伸:72°C，5秒，25 个循环后；延伸72°C，2分钟； 反应2预变性93°C，2分钟；然后，变性92°C，15秒，退火56°C，15秒，延伸:72°C，15秒，35 个循环后；延伸72°C，2分钟；(3)将步骤O)PCR反应后的产物经琼脂糖凝胶电泳后，与阳性对照进行比对。
全文摘要
本发明涉及嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒及其应用，属于分子检测技术领域。一种嗜酸氧化亚铁硫杆菌检测试剂盒，其特征在于，它含有外引物Primer15’-GTACATGTGGTCGCGGCGGC-3’，Primer25’-ACATACCGGTGGCGGCATGC-3’；内引物Primer35’-ACCTTGGAGATTCCCGCGGG-3’，Primer45’-TAGTAAGTGCCCGCCGTCGG-3’。本发明所述试剂盒操作简单，使用方便，PCR反应混合体系配制容易，检测步骤简单容易掌握，可大大提高检测速度。
文档编号C12Q1/68GK102134589SQ20101055605
公开日2011年7月27日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者李力, 贾瑞宝 申请人:山东大学