基于G₄DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法

专利名称：基于G₄DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基因检测试剂的制备方法，具体的说，涉及基于(^4DNA酶显色的可 视化基因检测试剂的制备方法。该试剂不但能够快速定性检测猪瘟病毒，而且还适用于其 它病原微生物核酸的定性检测，属于基因工程技术领域。
背景技术：
自上世纪以来，人们已经认识到核酸是决定遗传性质的关键物质。对于大部分生 物体而言，DNA是遗传信息的载体；而在部分病毒中，这个角色由RNA承担。每一种生物都 有自己特定的核酸序列，各种各样的生物性状最终都能在特定核酸序列中找到根源。因此， 对特定序列核酸的检测在生命科学及其相关的领域，医疗卫生、农业、环境、司法等都有广 泛的应用前景。具体来说，通过检测样品中是否存在某种核酸，就可以判断出检测对象是否 携带某种病原体及其耐药性，患有某种疾病或处于某种遗传状态。因此，核酸分析技术在病 原微生物的鉴定诊断，分型和耐药性检测，疾病诊断与预后，SNP检测等领域有着广泛的应 用，并发挥着重要的作用。人们不断发展各类检测核酸的技术，使之更灵敏、准确，经济、快 捷，以满足各领域对DNA检测的不同需要。
最近几年，具有过氧化物酶活性的DNA酶(DNAzyme)逐渐受到人们重视(Rich， Α. ； Zhang, S. Timeline Z-DNA the long road to biological function, Nat. Rev. Genet. 2003, 4, 566-572.)。它能够催化双氧水氧化2，2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑 啉-6-石黄酸)[2，2-azinobis (3-ethylbenzothiozoline) - 6-sulfonic acid, ABTS]等过 氧化物酶显色底物，生成有颜色的物质，并且DNA过氧化物酶能够作为催化标签融入各种 检测探针中，实现用肉眼检测目标物。DNA过氧化物酶是Dipankar Sen课题组发现的，它 是G-四链体DNA与氯高铁血红素(Hemin)形成的复合物。DNA过氧化物酶作为催化标签有 着自己独特的优势，例如DNA过氧化物酶可以在检测体系中由G-四链体与Hemin原位组 装形成，不需要额外的制备纯化步骤；它是一种DNA序列，可在合成过程中直接加入核酸探 针序列中，或者通过碱基对互补与探针相连，省去额外的标记步骤；DNA序列稳定，有活性 的结构很容易在溶液中形成，这样在运输存储过程中不需要特殊的条件。
猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)和口蹄疫一样，是猪的一种高度致死性接 触性传染病。目前，全世界仍有50多个国家和地区存在猪瘟。世界动物卫生组织(OIE) 2005年出版的《陆生动物卫生法典》中将猪瘟列为必须报告疫病之一。我国是猪瘟高发国 家，也将猪瘟列为“一类动物疫病”。猪瘟于1833年首先发现于美国的Ohio州，1904年由 Schweinitz EA 和 Dorset M 证明猪癌病原体是猪癌病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)。猪瘟病毒是一种具有囊膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科(Flaviridac)瘟病 毒属(Pestivirus)的成员。基因组是由 5，非编码区(5，untranslated rigion, 5' UTR), 一个大的开放阅读框(ORF)和3，非编码区组成(3，untranslated rigion, 3，UTR) ORF 编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，多聚蛋白在翻译过程中或翻译后，被病毒 自身编码的蛋白酶和宿主细胞的蛋白酶加工成12种成熟的蛋白，包括四种结构蛋白C，E0,E1, E2 和八种非结构蛋白 Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 和 NS5B。
传统的猪瘟检测方法主要包括病毒的分离和生物学试验、电镜技术、免疫荧光技 术、补体结合试验、核酸杂交、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，这些方法在病毒病诊断和进出口检 验检疫中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，诸如周期长，操作繁琐，特异性和敏感 性差，不规范，不适用于大批量检测，给猪瘟的检测带来巨大困难。因此，如何快速、准确测 定猪瘟病毒是猪瘟检测面临的主要难题之一。发明内容
本发明的目的在于提供一种基于G4DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方 法，该试剂不但能够快速定性检测猪瘟病毒，而且还适用于病原微生物核酸的定性检测，方 便、快捷、经济实惠。
本发明DNA过氧化物酶序列为G-四链体DNA，包含4段GGG序列，很容易拆 分、组装的特性，将DNA过氧化物酶序列分成了两个部分，采用3 1拆分的模式构建 探针，即一条探针中含有3段序列，另外一条只含有一段序列，也就是说将序列 d (GGGTAGGGCGGGTTGGG)不对称分为d(GGGTAGGGCGGG)和d (TGGG)分别与两条结合序列的 3’和5’端融合形成探针，这两条结合序列与靶DNA的部分序列互补。当不存在靶DNA时， 探针呈游离状态，分成两个部分的DNA过氧化物酶序列不能组装成G-四链体结构，不能表 现出过氧化物酶活性，故体系中没有信号的变化。在有靶单链DNA存在的情况下，在变性与 退火过程中，探针与模板特异性结合，两拆分部分相互靠近从而组装成G-四链体结构，与 Hemin结合后表现出过氧化物酶活性，在显色体系的条件下释放肉眼可见的绿光。这样可以 通过体系中DNA过氧化物酶催化的颜色反应检测靶DNA。
由于通常从样品中获得的核酸量是不足以直接用于分析的，因此，在用(^4DNA酶进 行显色反应之前必需对被检测的核酸进行基因扩增。其次，由于(^4DNA酶显色反应时只有 一条PCR产物可以与探针杂交，而其对应的互补链由于PCR双链的自身退火，会干扰所需要 的杂交反应，降低杂交信号，因此需要复制出单链。本发明选择不对称PCR，利用浓度有明显 差异的特异性上、下游引物进行不对称PCR扩增；如果目标基因是RNA，则应加上反转录的 步骤。不对称PCR进行完成后，可以直接加入G4DNA酶反应液，探针等试剂，直接进行下一 步的显色反应，从而实现了检测的方便、快捷。
本发明是通过采用如下的技术方案来实现发明目的的。
基于(^4DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在于包括如下步 骤A、目标基因的提取选取经猪瘟病毒感染后的PK-15细胞，经_70°C冻融3次，每次10-30分钟后，取200μ1 加RNA裂解液(Trizol) Iml混勻，室温静置10-15分钟，加0. 2ml氯仿，再室温静置3-5分 钟，于4°C 12000g/min离心10-15分钟，上清液转移到另一个离心管，加0. 5ml异丙醇，室温 沉淀10-20分钟，再于40C 12000g/min离心10分钟，轻轻倒出上清，加Iml 75%乙醇于4°C 7500g/min离心5分钟，弃上清，RNA沉淀在室温下自然晾干，加DEPC处理过的水20 μ 1得 到目标基因RNA;所述75%乙醇采用无菌双蒸水按体积比配制而成。
B、cDNA 的制备采用基因提取试剂盒取步骤A所得到的目标基因RNA 10 μ 1，加入反向引物W3 (-) 1μ 1 (20Mmol/L)和dNIPs (三磷酸脱氧核苷酸)1 μ 1 (10Mmol/L)，65°C孵育5分钟，再迅 速置冰上5分钟，然后加逆转录反应缓冲液4μ 1 (5XbufTer)，RNA酶抑制剂1 μ 1，DTT (二 硫苏糖醇)2 μ 1 (0. lmol/L)，MMLV逆转录酶1μ 1，于42°C反应50分钟、75°C反应10分钟， 即得至Ij cDNA ；所述基因提取试剂盒选自hvitrogen公司生产的产品。
所述反向引物W3 (-)的序列是 5，GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA 3，。
所述逆转录反应缓冲液的组成为250 mmol/L pH 8. 3的Tris_HCl(Tris-盐酸)， 375 mmol/L KCl (氯化钾)，15 mmol/L MgCl2 (氯化镁)。
C、不对称PCR的扩增取步骤B制好的cDNA 5 μ 1，加入到100 μ 1的不对称PCR体系中进行反应，循环条件 为95°C预变性2分钟；94°C变性15秒，53°C退火15秒，72°C延伸15秒，扩增50-100个 循环；最后72°C延伸10分钟，得到PCR产物；所述100 μ 1不对称PCR体系的组成为正向引物W3 ( + )2μ 1 (0. 4_4Mmol/L)和反向 引物 W3 (-) 2μ 1 (20ymol/L)，PCR 溶 10μ 1 (10 X buffer)，MgCl2 溶液 8 μ 1 (2. 5mmol/ L)，dNIPs溶液2μ 1 (10mmol/L),Taq DNA聚合酶2 μ 1 (2U)以及余量的无菌双蒸水。
所述不对称PCR反应体系中的正向引物W3( + )序列是5’-gcgcgggtaacccgggat-3’ ，反向引物 W3 (-)序列是5’ - GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA - 3’。
Dj4DNA酶显色反应分别取G4DNA酶显色反应缓冲液20 μ 1，上游探针ftx)blL 2μ 1 (20 μ mol/L)和下游探 针ftx)blR 2 μ 1(20 μ mol/L)，加无菌双蒸水补足为91 μ 1，加入至步骤C所得的含有100 μ 1 不对称PCR反应液的200 μ 1 PCR管中，95°C变性5 min ;30°C退火:3min，加入Hemin底物 0. 5μ 1 (50_ol/L)，放置 5min，再加入 8μ 1 (50 mmol/L) ATBS 禾口 0· 5 μ 1 (1 mo 1/DH2O2 显色，观察有无肉眼可见的绿色出现。
所述(^4DNA酶显色反应缓冲液的组成包括100 mmol/L的4_羟乙基哌嗪乙磺酸 (4-(2-hydroxyethyl)piperazine-l-ethanesPlfonic acid,HEPES)10 μ 1,2 mol/L 的氣化 钠和0. 2mol/L的氯化钾共10 μ 1。
所述上游探针 ProblL 的序列是 5’-tgggtaattttttatttatttaggt_3’。
所述下游探针 ProblR 的序列是 5’_cgccaccctattgtagataa cacttgggtagggcggg-3 。
所述上、下游探针的组成为(^4DNA酶中的G-四链体DNA，包含4段GGG序列，该序 列又被拆分为两个部分一个部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模311 ο
本发明的基本原理是首先，G4DNA酶中的G-四链体DNA包含4段G你序列，通过将其拆分为两个部分，一个 部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，从而形成3:1的拆分模式。
其次，包含两条特异性基因序列的探针，即上、下游探针分别融合有拆分的G-四 链体DNA序列，也就是说两条探针的3’端或5’端分别包含d (GGGTAGGGCGGG)或d (TGGG)。在探针呈游离状态时，两基团在空间结构上距离远，故体系中没有信号的变化。在有目标单 链DNA存在的情况下，在变性与退火过程中，探针与模板特异性结合，两基团相互靠近形成 G4DNA过氧化物酶，在显色体系条件下的催化底物Hemin即可释放肉眼可见的绿光。因此， 通过肉眼观测溶液有无颜色变化，即可提示检测对象是否带有猪瘟病毒，变为绿色为阳性， 不变色为阴性。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果表现在1、检测速度快，整个检测过程共需2-3小时，但(^4DNA酶显色步骤仅需15分钟；2、检测方法精确稳定、重现性好；3、检测步骤简单，操作简便，只需1人即可完成整个检测过程，一次可检测1-95个样 品，减少了人力资源的浪费；4、可肉眼直接观察显色反应，结果直观；5、无需特殊的昂贵仪器，试剂便宜，检测成本低廉，利于推广使用。


图1为本发明对经猪瘟病毒感染后的H(-15细胞、空白的冊-15细胞以及无菌双 蒸水进行检测的(^4DNA酶显色反应结果图；图2为本发明对经猪瘟病毒感染后的H(-15细胞、空白的H(-15细胞以及无菌双蒸水 进行检测后利用紫外-可见分光光度计(UV-2550 UV-vis spectrophotometer 岛津公司 产品)分析&DNA酶显色反应的光吸收结果图(吸收波长为419nm)。
具体实施方式
基于(y)NA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在于包括如下步 骤A、目标基因的提取选取经猪瘟病毒石门毒感染后的H(-15细胞，空白的H(-15细胞，以无菌双蒸水作对 照，经-70°C冻融3次，每次10-30分钟后，取200 μ 1加RNA裂解液(Trizol) Iml混勻，室 温静置10-15分钟，加0. 2ml氯仿，再室温静置3-5分钟，于4°C 12000g/min离心10-15分 钟，上清液转移到另一个离心管，加0. 5ml异丙醇，室温沉淀10-20分钟，再于4°C 12000g/ min离心10分钟，轻轻倒出上清，加Iml 75%乙醇于4°C 7500g/min离心5分钟，弃上清， RNA沉淀在室温下自然晾干，加DEPC处理过的水20 μ 1得到目标基因RNA ； 所述75%乙醇采用无菌双蒸水按体积比配制而成。
B、cDNA 的制备采用基因提取试剂盒取步骤A所得到的目标基因RNA 10-12μ 1，加入反向引物W3(_) 1μ 1 (20Mmol/L)和dNTPs (三磷酸脱氧核苷酸)1 μ 1 (10 μ mol/L)，65°C孵育5分钟，再迅 速置冰上5分钟，然后加逆转录反应缓冲液4μ 1 (5XbufTer)，RNA酶抑制剂1 μ 1，DTT (二 硫苏糖醇)2 μ 1 (0. lmol/L)，MMLV逆转录酶1μ 1，于42°C反应50分钟、75°C反应10分钟， 即得至Ij cDNA ；所述基因提取试剂盒选自hvitrogen公司生产的产品。
所述反向引物W3 (-)的序列是 5’ GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA 3’。7
所述逆转录反应缓冲液的组成为250 mmol/L pH 8. 3的Tris-HCl(Tris-盐酸)， 375 mmol/L KCl (氯化钾)，15 mmol/L MgCl2 (氯化镁)。
C、不对称PCR的扩增取步骤B制好的cDNA 5 μ 1，加入到100 μ 1的不对称PCR体系中进行反应，循环条件 为95°C预变性2分钟；94°C变性15秒，53°C退火15秒，72°C延伸15秒，扩增50-100个 循环；最后72°C延伸10分钟，得到PCR产物；所述100 μ 1不对称PCR体系的组成为正向引物W3 ( + )2μ 1 (0. 4_4 μ mol/L)和反向 引物 W3 (_)2 μ 1 (20Mmol/L)，PCR 溶液 10μ 1 (10 X buffer)，MgCl2 溶液 8 μ 1 (2. 5mmol/ L)，dNIPs溶液2μ 1 (10mmol/L),Taq DNA聚合酶2 μ 1 (2U)以及余量的无菌双蒸水。
所述不对称PCR反应体系中的正向引物W3( + )序列是5’-gcgcgggtaacccgggat-3’ ，反向引物 W3 (_)序列是5’ - GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA - 3’。
Dj4DNA酶显色反应分别取G4DNA酶显色反应缓冲液20 μ 1，上游探针ftx)blL 2μ 1 (20 μ mol/L)和下游探 针ftx)blR 2 μ 1(20 μ mol/L)，加无菌双蒸水补足为91 μ 1，加入至D步骤所得的含有100 μ 1 不对称PCR反应液的200 μ 1 PCR管中，95°C变性5min ;30°C退火:3min，加入Hemin底物 0. 5μ 1 (50_ol/L)，放置 5min，再加入 8μ 1 (50 mmol/L) ATBS 禾口 0· 5 μ 1 (1 mo 1/DH2O2 显色，观察有无肉眼可见的绿色出现。
所述(^4DNA酶显色反应缓冲液的组成包括100 mmol/L的4_羟乙基哌嗪乙磺酸 (4-(2-hydroxyethyl)piperazine-l-ethanesPlfonic acid,HEPES)10 μ 1,2 mol/L 的氣化 钠和0. 2mol/L的氯化钾共10 μ 1。
所述上游探针 ProblL 的序列是 5’-tgggtaattttttatttatttaggt_3'。
所述下游探针 ProblR 的序列是 5，-cgccaccctattgtagataa cacttgggtagggcggg-3'。
所述上、下游探针的组成为(^4DNA酶中的G-四链体DNA，包含4段GGG序列，该序 列又被拆分为两个部分一个部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模311 ο
权利要求
1.基于(^4DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤A、目标基因的提取选取经猪瘟病毒感染后的PK-15细胞，经-70°C冻融3次，每次10-30分钟后，取200 μ 1 加RNA裂解液Iml混勻，室温静置10-15分钟，加0. 2ml氯仿，再室温静置3_5分钟，于 40C 12000g/min离心10-15分钟，上清液转移到另一个离心管，加0. 5ml异丙醇，室温沉 淀10-20分钟，再于40C 12000g/min离心10分钟，轻轻倒出上清，加Iml 75%乙醇于4°C 7500g/min离心5分钟，弃上清，RNA沉淀在室温下自然晾干，加DEPC处理过的水20 μ 1得 到目标基因RNA;B、cDNA的制备采用基因提取试剂盒取步骤A所得到的目标基因RNA 10 μ 1，加入反向引物W3 (-) 1μ 1 (20Mmol/L)和dNIPs 1μ 1 (10Mmol/L)，65°C孵育5分钟，再迅速置冰上5分钟，然 后加逆转录反应缓冲液4μ 1 (5Xbuffer)，RNA酶抑制剂1 μ 1，DTT 2μ1 (0. lmol/L)，匪LV 逆转录酶1 μ 1，于42°C反应50分钟、75°C反应10分钟，即得到cDNA ；C、不对称PCR的扩增取步骤B制好的cDNA 5 μ 1，加入到100 μ 1的不对称PCR体系中进行反应，循环条件 为95°C预变性2分钟；94°C变性15秒，53°C退火15秒，72°C延伸15秒，扩增50-100个循 环；最后72°C延伸10分钟，得到PCR产物；D、(^4DNA酶显色反应分别取G4DNA酶显色反应缓冲液20 μ 1，上游探针ftx)blL 2μ 1 (20 μ mol/L)和下游探 针ftx)blR 2μ l(20Mmol/L)，加无菌双蒸水补足为91 μ 1，加入至D步骤所得的含有100 μ 1 不对称PCR反应液的200 μ 1 PCR管中，95°C变性5 min ;30°C退火:3min，加入Hemin底物 0. 5μ 1 (50mmmol/L)，放置 5min，再加入 8μ 1 (50 mmol/L) ATBS 禾口 0. 5 μ 1 (1 mo 1/DH2O2 显色，观察有无肉眼可见的绿色出现。
2.如权利要求1所述基于(^4DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在 于步骤A所述75%乙醇采用无菌双蒸水按体积比配制而成。
3.如权利要求1所述基于&DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在 于步骤B所述反向引物W3 (_)的序列是5’ GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA 3’。
4.如权利要求1所述基于(^4DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在 于步骤B所述逆转录反应缓冲液的组成为250 mmol/L pH 8. 3的Tris-HCl，375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl20
5.如权利要求1所述基于(^4DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在 于步骤C所述ΙΟΟμ 1不对称PCR体系的组成为正向引物W3 ( + )2μ 1 (0. 4-4ymol/ L)禾口反向引物 W3 (-) 2μ 1 (20Mmol/L)，PCR 溶液 10μ1 (10 X buffer)，MgCl2 溶液 8 μ 1 (2.5mmol/L)，dNIPs 溶液 2μ 1 (10mmol/L), Taq DNA 聚合酶 2 μ 1 (2U)以及余量的无菌双 蒸水。
6.如权利要求1或5所述基于(^4DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特 征在于所述不对称PCR体系中的正向引物W3 ( + )序列是5’-gcgcgggtaacccgggat-3’， 反向引物 W3 (_)序列是5’ - GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA - 3’。
7.如权利要求1所述基于(^4DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在于步骤D所述(^4DNA酶显色反应缓冲液的组成包括100 mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸 10μ l，2mol/L的氯化钠和0. 2mol/L的氯化钾共10 μ 1。
8.如权利要求1所述基于(^4DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在 于步骤 D 所述上游探针 ProblL 的序列是 5’-tgggtaattttttatttatttaggt_3’。
9.如权利要求1所述基于G4DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法， 其特征在于步骤D所述下游探针ftx)blR的序列是5’_cgccaccctattgtagataa cacttgggtagggcggg-3 。
10.如权利要求1所述基于(y)NA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在 于步骤D所述上、下游探针的组成为G4DNA酶中的G-四链体DNA，包含4段GGG序列，该序 列又被拆分为两个部分一个部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模31 。
全文摘要
本发明涉及一种基于G4DNA酶显色的可视化猪瘟病毒基因检测试剂的制备方法，包括选取病毒感染后的细胞，经冻融裂解后，采用基因提取试剂盒提取目标基因，经逆转录、灭活MMLV逆转录酶后得到cDNA；将cDNA加入不对称PCR体系，经变性、退火及延伸扩增50-100个循环得到不对称PCR产物；将上、下游探针和不对称PCR产物加入到G4DNA酶显色反应缓冲液中，经变性、退火后再加入Hemin、ATBS和H2O2进行显色反应，观察有无肉眼可见的绿色出现，可判定有无猪瘟病毒感染。本发明检测速度快、精确稳定、重现性好、检测步骤简单、操作简便、可肉眼直接观察显色反应，结果直观、成本低廉。
文档编号C12Q1/70GK102041318SQ201010555429
公开日2011年5月4日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者王毅, 鲁小璐 申请人:成都巨星猪业有限公司, 王毅