专利名称：水稻OsNAC编码序列及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，具体涉及一种在水稻中表达的 NAC家族转录因子的克隆、基因表达模式分析、转基因载体的构建、植物转化、转基因植株的 获得，以及相应的表型和细胞水平鉴定。
背景技术：
植物生殖发育的多个环节影响到果实和种子的大小和多少。因此，控制生殖发育 的基因可以决定农作物的产量。植物生殖发育的环节包括花器官的发育，雄蕊细胞分裂和 分化，减数分裂，及花粉发育，调节这些环节的基因可能会对产量有很大的影响。对植物生 殖发育的功能基因的克隆及其功能的分析研究，将为提高作物产量提供候选基因。根据拟南芥花药发育5、期的芯片数据结果，发现J似切似在两个花粉发育异 常的突变体ems中的表达量较野生型大量下调，推测其在花粉发育过程中起重要 调控作用。该基因参与拟南芥的衰老和侧根形成过程，尚未有其在花粉发育过程中作用 的报道。NCBI中通过BLASTn获得了该基因在水稻品种“日本晴”中的同源基因As似C (0s04g0460600, L0C_0s04g38720)。NAC家族转录因子是植物特有的一大类转录因子，其在植物的生长发育中主要参 与形态建成，包括顶端分生组织的形成，侧根的形成，次生壁的形成等，另外NAC家族还参 与植物的生物逆境和非生物逆境反应。尚未有其参与花粉发育的报道。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的水稻OsNAC 在花粉发育中功能的研究。
发明内容
本发明的第一目的就是提供一种新的水稻功能基因OsNAC,该基因是NAC家族转 录因子。本发明的第二目的是提供这种水稻蛋白As似C编码序列在参与花粉发育中的应用。本发明一方面提供一种水稻功能基因OsNAC,该基因是NAC家族转录因子，能参与 花粉发育，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。本发明还提供一种DNA分子，该序列编码具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多 肽。本发明一方面提供一种克隆出编码AsUC的开放阅读框的方法，序列为SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的105 1136bp，0RF长度为1032bp (红色字符标识出起始密码子和 终止密码子)。本发明还提供了一种检测OsNAC mRNA时空表达模式的方法，其步骤如下
1、取萌发5d的水稻幼苗的根，花粉发育早期减数分裂时期的花序和花粉粒形成时期 的花序，固定，石蜡切片。
2、利用开放读框的3’端和3’ UTR的特异序列(SEQ ID NO. 1所示序列的 1020bp lM4bp)设计特异引物SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6，合成探针，杂交显色。本发明还提供一种通过Realtime PCR检测AsUC表达量的方法，它包括用SEQ ID NO. 1所示序列的1020bp lM4bp为模板设计引物SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6, Realtime PCR定量分析水稻不同器官中和不同激素，胁迫处理下水稻体内As似C的表达量的变化。本发明还提供所述的编码NAC家族转录因子在参与花粉发育过程中的应用。包 括
将所述的编码NAC家族转录因子序列转入拟南芥，分析其对花粉发育的功能，具体步 骤如下
(1)将编码序列可操作的连接于植物表达载体，形成含有SEQ ID NO. 1序列ORF框的表 达载体；
(2 )将步骤(1)中的表达载体转化拟南芥；
(3)通过抗生素筛选，RT-PCR鉴定，获得转基因阳性单株，转基因植物的花粉发育异常， 花粉粒含量减少。本发明还提供一种用于鉴定是否存在As似C核苷酸序列的方法，它包括用SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4所示ORF框的特异引物对转基因拟南芥基因组DNA进行PCR反应，PCR 反应体系中添加5%的DMS0，可以提高PCR反应的特异性，然后通过检测是否扩增出目的片 段来判断是否含有OsNAC核苷酸序列。
图1 NAC家族功能基因的聚类分析。除来源于油菜的彻似67么来源于马铃薯的 SiyVJG来源于小麦的似#-57，来源于水稻的0sNAC6，0NAC063,和0NAC300其余基 因都来源于拟南芥。图2水稻植株各个器官中As似C表达量的分析。flower是长度为5cm的花序的 总RNA ；stem是水稻分蘖茎的总RNA ；young leaf是刚抽出的幼叶的总RNA ；leaf是展开的 尚未变黄的叶片的RNA ；old leaf是开始变黄，但尚未皱缩的叶片的RNA。图3不同激素和逆境处理下As似C的表达。将两叶一心期水稻苗分别激素处理 24h :KT，6-BA，IAA 10ymol/L,ABA 50 μ mo 1 /L，GA 5ymol /L，以 ddH20 为对照。用 10%PEG 处理4天，200 μ mol/LNaCl处理4天，以ddH20为对照。图4水稻中As似C表达的原位分析。A图和B图为颖花切片的原位图片，C图为 种子萌发5天水稻切片的原位图片。A和B图中的星号示出绒毡层的阳性信号，C图的星号 示出侧根原基的阳性信号。图5 AsUC转基因拟南芥单株的潮霉素PCR鉴定。01，02，03，05分别为独立的转 基因株系，-为野生型拟南芥阴性对照，+为质粒阳性对照。图6转基因拟南芥株系中OsNAC的RT-PCR分析。01，02，03，05，06分别为独立 的转基因株系。WT为非转基因的野生型拟南芥对照。图7 As似C转基因拟南芥株系的表型分析。A图为野生型对照，B图为转基因株 系，红色箭头所示为不育的果荚。图8野生型和转基因株系花粉的Alexander染色。A图为野生型对照的花粉染色，B图为转基因株系的花粉染色。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，例如 Sambrook 等分子克隆实验手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 水稻OsNAC基因的克隆。取田间生长的水稻(日本晴)叶片立即置于液氮中冷冻保存，提RNA。根据As似C 的ORF序列设计引物SEQ ID NO. 3和SEQ ID N0. 4。采用RT-PCR方法从水稻cDNA中扩增 出一条11Λ左右的条带。将PCR产物回收，连接到载体pCR-Blunt上，进行测序。实施例2水稻OsNAC基因的序列信息与同源性分析。本发明中水稻AsUC基因的ORF长度为103^p，详细序列见SEQ ID NO. 1 (红色 粗体字符标识出起始密码子和终止密码子)。该基因编码的多肽由343个氨基酸残基组成， 分子量36837. 81道尔顿，等电点为7. 47，详细序列见SEQ ID N0. 2。该水稻中的OsNAC基因是根据ANAC092的氨基酸序列通过Blast在 Non-redundant GeneBank CDS translations + PDB+SwissPort + Superdate + PIR 数据 库中获得，二者的同源性达到73%。J似切似参与拟南芥的衰老和侧根形成过程，尚未有参与花粉发育的报道，通过 ClustalX和MEGA2对已报道的NAC家族功能基因的氨基酸序列和ANAC092和OsNAC进行 序列的同源性比较和进化树的构建，结果表明ANAC092和OsNAC与CUC1/2聚为一类。实施例3水稻OsNAC不同器官、不同激素和不同胁迫处理下的表达分析。分别提取扬花期“日本晴”不同器官(根，莲，叶，花序)的RNA，其中根据叶的不同 生长阶段和颜色分别提取尚未展开的幼叶，已展开的成熟叶，和发黄尚未皱缩的老叶。进行 Realtime PCR分析，结果如图2，表明As似C在水稻中组成型表达，在幼叶和衰老的黄色叶 片中的表达量高，暗示其参与分化和衰老的过程，其参与植物衰老过程的性状与其拟南芥 中的同源基因JUOH^相似。另外，fe似C的表达受ABA诱导显著，表明其可能参与植物的 逆境反应，进一步的胁迫处理发现，彻似C受干旱和盐的诱导。实施例4水稻OsNAC组织水平表达模式的分析。用原位杂交的方法检测水稻As似C在颖花和根中的表达模式。分别取水稻花粉发 育减数分裂后期至花粉粒形成期的花序材料和刚萌发的5天水稻的材料，经石蜡切片，杂 交，显色。结果如图4所示，As似C在绒毡层和花粉粒中有明显表达，在侧根原基也有明显 的表达。实施例5转As似C基因的拟南芥表型鉴定和细胞水平分析。1含目的基因(flsUC基因)表达载体的构建
以实施例1中获得的克隆载体为模板，在引物两端加上酶切位点Afc0 I和分e I并在 保证阅读框架的前提下，将克隆的目的片段酶切连接到植物表达载体PCAMBIA1304中，将 其转入农杆菌中。利用花序浸染法技术转化拟南芥。2利用花序浸染法转化拟南芥1)挑取农杆菌单菌落在:3ml LB+利福平G0mg/L) +链霉素(50mg/L) +卡那霉素 (50mg/L)培养基中，28°C,250rpm振菌培养过夜。2)取50ml菌液接种到50ml同样抗性的LB培养基中，相同条件下扩大培养过夜， 至 OD6tltl 为 1.2。3)室温下4500rmp离心5min，去上清，转化缓冲液重悬菌体至OD6tltl在0. 8-1. O之 间。拟南芥转化缓冲液配制
1/2MS+6-BA(0. Olmg/L) +5% 蔗糖 +0. 03% silwet
农杆菌喷雾法转化拟南芥侵染前过夜保湿培养野生型拟南芥材料，并将已开放的花 和果荚剪去。将用转化缓冲液重悬的菌液倒入50ml的小喷壶中，对野生型拟南芥(Col.)尚 未开放的花蕾进行充分雾喷，保湿暗培养过夜后转为正常培养，5d后重复转化1次。分批采摘成熟果夹，50°C烘箱脱水干燥数天，取出种子，清理干净后放回干燥器中 室温保存备用。3对转基因植株的筛选和分子鉴定
将转基因种子消毒，在拟南芥筛选培养基上(MS+25mg/L hyg)无菌培养，4°C暗培养2d 后转至人工气候室正常培养。IOd后将有4片真叶并生根的抗性小苗转移到盆土，盖上薄膜 保湿，在温室中培养，3d取下薄膜转为正常培养，生长良好的植株即为转基因株系。将转基 因株系Ttl代苗结出的种子再经拟南芥筛选培养基筛选，获得T1代苗，种植与抗性筛选直至 获得T3代纯合转基因种子。以SDS法小量抽提潮霉素抗性生根拟南芥单株的的基因组DNA，以野生型拟南芥 材料作为负对照，根据潮霉素抗性基因特异序列设计引物，进行PCR检测(部分结果)，见图 5。提取抗性单株的RNA，RT-PCR检测外源基因AsUC的表达，见图6。在PCR反应体 系中添加5%的DMSO可以特异性扩增出AsUG五个转基因株系的外源基因都较野生型拟南 芥有明显的表达。4转基因植株的表型鉴定
得到多个转基因植株，转基因株系的花出现不育，果荚变短，见图7。将尚未开花刚露白 的花苞剥开，取尚未散粉的花药进行Alexander花粉染色，结果表明花粉数量明显较野生 型的减少，见图8。表明外源基因在拟南芥中超量表达，影响了花粉的育性。试验结 果表明，实施例1中得到的水稻β^Λ ^基因参与了花粉发育过程，可以进一步用于研究花 粉发育机制和水稻的转基因育种。
权利要求
1.一种参与花粉发育的NAC家族转录因子，其特征在于，它编码NAC家族转录因子，其 核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列编码具有SEQID NO. 2所示的氨 基酸序列的多肽。
3.—种如权利要求1所述的编码NAC家族转录因子在参与花粉发育中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于将权利要求1所述的编码NAC家族转录因子 序列转入拟南芥，分析其对花粉发育的功能，具体步骤如下(1)将编码序列可操作的连接于植物表达载体，形成含有SEQID NO. 1序列ORF框的表 达载体；(2)将步骤(1)中的表达载体转化拟南芥；(3)通过抗生素筛选，RT-PCR鉴定，获得转基因阳性单株，转基因植物的花粉发育异常， 花粉粒含量减少。
5.一种用于检测水稻植株体内As似C表达部位的方法，其特征在于它包括用SEQ ID N0.5和SEQ ID NO. 6所示的引物序列制备RNA探针与样品杂交，然后检测探针是否发生了 结合，所述样品是水稻花器官或根的石蜡切片。
6.一种用于检测水稻中AsUC表达量的方法，其特征在于，它包括用SEQ ID NO. 5和 SEQ ID NO. 6所述引物对样品进行Realtime PCR反应，然后分析水稻不同器官中和不同激 素，胁迫处理下OsNAC的表达量。
7.一种用于检测转基因拟南芥中是否存在《S似C的方法，其特征在于它包括用SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所述引物与样品进行PCR反应，反应体系中添加5%DMS0，然后检测是 否扩增出目的片段，样品为转基因拟南芥。
全文摘要
本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，为一种在水稻中表达的NAC家族转录因子的编码序列及其在花粉发育中的应用。本发明包括NAC家族转录因子的克隆、基因表达模式分析、转基因载体的构建、植物转化、转基因植株的获得，以及相应的表型和细胞水平鉴定。本发明所说基因在拟南芥中表达，获得的转基因植物的花粉发育出现异常，结实率下降。
文档编号C12N15/29GK102120763SQ20101055445
公开日2011年7月13日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者但晨, 唐雪蓉, 张文政, 明凤, 陈旭 申请人:复旦大学