专利名称：一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法
一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶 基因失活的枯草芽孢杆菌的方法技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方 法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法。
背景技术：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)被公认为是安全菌株(GRAS)，可以使外源基因分泌表达出有活性的产物。此外，枯草芽孢杆菌遗传背景清楚、具有生长迅速、培 养条件简单、良好的发酵基础和生产技术，使其在科研和工农业生产领域被广泛应用。 B.subtilis作为一种重要的工业微生物，具有开发为食品级表达宿主的优势，减少用于食 品行业的重组生物制品的下游分离纯化成本。
目前B.subtilis作为宿主的最大问题是其自身分泌的蛋白酶，对外源蛋白产生降 解作用，严重的影响了外源目的产物的分泌表达产量。B.subtilis分泌多种蛋白酶对外源 基因的降解作用早已引起许多学者的注意。国外学者通过基因敲出技术将已发现的蛋白 酶基因逐个敲除，生成了 DB104、DB403、WB600、WB700、WB800等蛋白酶缺陷菌 株。WB800是由加拿大Sui-LamWong教授实验室创建的敲除了碱性蛋白酶(apr)、中性 蛋白酶(npr)、金属蛋白酶(mpr)、中性蛋白酶B (nprB)、三种丝氨酸蛋白酶(epr、bpf和 vpr)和胞壁蛋白酶(cwp)8种蛋白酶的菌株。该菌株已失去绝大部分的蛋白酶活力，很多 基因在该宿主内实现了稳定表达。但是WB800内残留的蛋白酶仍然对某些敏感蛋白造成 降解。WB800的构建也是通过传统的基因敲出过程，宿主本身携带了多种抗生素基因， 不能应用于食品级工程菌，不符合食品安全标准。
传统的对枯草芽孢杆菌染色体的基因操作是通过一个正向筛选标记实现的，通 常是在要失活或敲除的基因内部插入一个抗性基因，其两端即为同源交换臂，这样根据 同源重组原理，修饰过的或无活性的基因将原始染色体上的活性基因置换。然而，当我 们在经过一次基因修饰的菌株上再次进行基因操作，不可避免的引入第二个抗性基因； 另外一种方法是通过再一次的单交换作用，将第一次引入的抗性基因切除掉。可以想见 第一种方法，将会导致宿主产生多种抗生素抗性，而且多重抗生素抗性压力下有可能会 改变菌株的生理特性；第二种方法的缺陷是发生一次双交换后，再发生一次单交换的频 率极低，而且没有正向筛选标记，工作量相当大。
因此，建立一套枯草芽孢杆菌的无抗生素抗性标记基因的筛选技术对基础研究 和应用研究具有重要推动作用。Fabret等在2002年第一次报导了枯草芽孢杆菌无标记基 因组修饰的方法，原理是通过控制尿嘧啶合成的有无来起到筛选的目的。此后，先后出 现了5篇这方面的报导，或是以利用抗药性筛选、利用营养缺陷型筛选和利用毒素基因 /解毒素基因筛选。这些方法的共同之处是需要发生两次双交换过程达到基因修饰的目 的。第一次双交换借助同源片段，第二次双交换借助所修饰的靶基因位点两侧引入的两 个同向重复序列(DR)。虽然上述方法能够达到无抗生素抗性标记筛选的目的，但是构建4敲除载体过程繁琐，并且重组突变效率低。 发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种无抗生素抗性标记的枯草 芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法。
—种无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构建方法，其特 征在于包括下述步骤
(1)分别构建 SpovAF-CM-Lys 和 SpovAF-Pspac-Lys 同源交换片段；
(2) SpovAF-CM-Lys转化枯草芽孢杆菌168感受态细胞，发生一次双交换，该菌株基因组上LysA基因天然启动子被置换为含有终止子的CM基因，得到赖氨酸营养缺陷 型突变菌株BS-CM ；
(3) SpovAF-Pspac-Lys转化BS-CM感受态细胞，发生一次双交换，所述的CM 基因被替换为受LacI基因抑制调节的Pspac启动子，得到无抗生素抗性标记的条件赖氨酸 营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS。
其中，所述的SpovAF-CM-Lys同源交换片段通过如下步骤得到
(1)以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板分别进行PCR扩增得到spoVAF 基因和Lys基因，以pJC164.3质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的CM基因， 将这三个基因分别克隆至PMD19-T载体，得到pMD19-T_spoVAF、pMD19-T_LysA、 pMD19-T-CM 载体；
(2)步骤(1)所述的pMD19-T-CM经双酶切后获得CM片段，与经过相同双酶 切处理的pMD 19-T-spoVAF载体连接得到pMD 19-T-spoVAF-CM载体；
(3)步骤(1)所述的pMD19-T-LysA经双酶切后获得LysA片段，与经过相同双 酶切处理的pMD 19-T-spoVAF-CM载体连接得到pMD19-T-S_C-L载体；
(4)以 spoVAF-HSEQIDNO.l)为上游引物，LysA-R^SEQ ID N0.4)为下游引 物，以步骤⑶所述pMD19-T-S-C-L载体为模板PCR扩增得到SpovAF-CM-LysA同源 交换片段。所述的SpovAF-Pspac-LysA同源交换片段通过如下步骤得到
(1)以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板分别进行PCR扩增得到spoVAF基 因和Lys基因，以PDG-Stu质粒为模板PCR扩增得到Pspac启动子基因，将这三个基因 分别克隆至 PMD19-T 载体，得到 pMD 19-T-spoVAF、pMD19_T_LysA、pMD19-T-Pspac 载体；
(2)步骤⑴所述的pMD19-T-Pspac经双酶切后获得Pspac片段，与经过相同双 酶切处理的pMD 19-T-spoVAF载体连接得到pMD 19-T-spoVAF-Pspac载体；
(3)步骤(1)所述的pMD19-T-LysA经双酶切后获得LysA片段，与经过相同双 酶切处理的pMD 19-T-spoVAF-Pspac载体连接得到pMD19-T-S_P-L载体；
(4)以 spoVAF-HSEQIDNO.l)为上游引物，LysA-R6EQ ID N0.4)为下游引 物，以步骤
(3)所述 pMD19-T-S-P_L 载体为模板 PCR 扩增得到 SpovAF-Pspac-LysA 同源交换片段。
一种利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法，包括如下步骤
(1)按照权利要求1所述方法构建无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯 草芽孢杆菌BS-PS ；
(2)构建插入失活靶基因的同源整合载体；
(3)将步骤( 所述的同源整合载体转化步骤(1)所述的无抗生素抗性标记的条 件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS，通过一次单交换和一次由于基因组结构不稳 定引起的自发单交换过程，以是否能自我合成赖氨酸为筛选标记，得到两种基因型的枯 草芽孢杆菌突变株，一种为枯草芽孢杆菌回复突变菌株，另一种为靶基因失活的无抗生 素抗性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株，经PCR鉴定筛选得到靶基因失活的无抗生素抗 性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株。
其中，步骤( 所述的插入失活靶基因的同源整合载体通过如下方法构建
(1)以大肠杆菌pMD19-T为骨架，构建了一个含有P43_LacI自主表达框及CM 结构基因的通用型整合载体PLC-T ；
(2)构建插入插入子的失活枯草芽孢杆菌168靶基因；
(3)将步骤( 所述的失活枯草芽孢杆菌168靶基因亚克隆至通用型整合载体 PLC-T,得到所述的插入失活靶基因的同源整合载体。
步骤(3)所述的PCR鉴定方法为设计扩增靶基因的引物，分别以靶基因失活的 无抗生素抗性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株基因组和枯草芽孢杆菌回复突变菌株基因 组为模板进行PCR扩增，以靶基因失活的无抗生素抗性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株 基因组为模板扩增出来的条带比以枯草芽孢杆菌回复突变菌株基因组为模板扩增的条带 多出插入序列的大小。
所述的靶基因为蛋白酶基因，优选nprE基因或aprE基因。
有益效果
本发明以BS168为出发菌株，通过两次双交换过程获得了 BS-PS突变菌株，该 菌株基因组上控制赖氨酸合成酶的基因LysA的启动子被置换为Pspac启动子，该启动子 可受LacI的抑制，即BS-PS菌株可受LacI调控。该无抗生素抗性标记的条件赖氨酸缺 陷型枯草芽孢杆菌构建方法过程简单，重组突变效率高。赖氨酸是枯草杆菌宿主生长所 必须氨基酸，控制其合成的启动子为组成型，本发明中选择能够调控的Pspac启动子，并 且枯草杆菌本身不合成LacI阻抑蛋白，因此可通过LacI严格控制宿主的生长情况。同 时，赖氨酸条件营养型标记符合食品级工程菌对筛选标记的要求。
本发明在构建条件赖氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS的基础上，能够以赖氨酸 能否自我合成为筛选标记，对枯草芽孢杆菌同一菌株进行重复、多次的基因组改造，获 得的蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌突变菌株，与以已报导的方法相比有以下优点
(1)该方法在敲除靶蛋白酶的同时不会向宿主引入抗生素基因，所构建的蛋白 酶失活的枯草芽孢杆菌无抗生素抗性基因，可应用于食品级工程菌，不符合食品安全标 准。
(2)构建整合突变载体简单。以往报导的方法需要复杂的操作过程来构建用来发 生两次双交换过程的元件，即用来发生第一次双交换的A、B同源片段和用来发生第二次 双交换的两DR序列，靶基因则位于两个DR之间。本方法首先构建一个通用的整合载6体PLC-T，在此基础上只要将靶基因内部插入或缺失一段序列，然后将修饰后的靶基因 插入PLC-T即可。
(3)突变效率高。以往报导的方法需要发生两次双交换过程，而本方法需要发生 两次单交换的过程。枯草芽孢杆菌基因组发生单交换比双交换的频率高，因此，本方法 整个过程要比以往报导的方法效率要高。
(4)本发明所采用的方法可在同一突变菌株重复使用。本发明中利用赖氨酸能否 自我合成为筛选标记，在发生第二次自发单交换过程后，突变宿主恢复了赖氨酸合成能 力。当再次转化入整合突变载体后，又可以以赖氨酸合成能力的有无作为筛选标记。因 此，可以在同一菌株运用本发明方法进行多次基因突变操作。
图1.本发明技术方案。
图 2.SpovAF-CM-LysA 和 SpovAF-Pspac-LysA 同源交换片段的构建。
图3.BS-CM突变菌株的构建。
图4.BS-PS突变菌株的构建。
图5.BS-PS菌株蛋白酶nprE和aprE失活整合载体的构建。
图6.BS-PS菌株nprE蛋白酶基因的插入失活。(a)整合突变载体与BS_PS基因 组发生单交换；(b)过渡菌株由于基因组不稳定发生自发单交换。
图7.PCR产物电泳验证BS-PS-nl菌株。
图8.PCR产物电泳验证BS-PS-nl-al菌株。
图9.SDS-PAGE 检测 BS-PS-nl-al 菌株分泌蛋白。
具体实施方式
本发明首先构建SpovAF-CM-LysA和SpovAF-Pspac-LysA两个同源交换片段，通过两次双交换过程将枯草芽孢杆菌168改造为条件赖氨酸营养缺陷型菌株BS-PS。在 此基础上构建失活nprE和aprE靶基因的同源整合载体，通过一次单交换过程，获得过渡 菌株，由于过渡菌株基因组结构不稳定引起再一次自发单交换过程，以赖氨酸为筛选标 记，筛选蛋白酶基因插入失活的突变菌株(技术方案如图1)，从生理、分子及生化方面 对突变菌株进行验证，技术方案如图具体实施方式
如下
实施例IBS-PS突变菌株的构建
(1) SpovAF-CM-LysA同源交换片段的构建
构建路线见图2。以 spoVAF-F (SEQ ID NO. 1)禾P spoVAF-R (SEQ ID N0.2) 为引物，以枯草芽孢杆菌168CBS168)基因组DNA为模板PCR扩增spoVAF基因；以 LysA-F (SEQ ID N0.3)禾Π LysA-R(SEQ ID N0.4)为引物，以 BS168 基因组 DNA 为模板 PCR扩增Lys基因；以 CM-HSEQ ID N0.5)和 CM-RXSEQ ID N0.6)为引物，以pJC164.3 质粒(BGSC，含有CM基因)为模板PCR扩增包括启动子和终止子的CM(氯霉素抗性基 因)。扩增得到的三个基因分别克隆至pMD19-T (购自Takara公司)载体，经验证、测 序正确后，分别命名为 pMD19-T_spoVAF、pMD19_T_LysA、pMD19_T_CM，于 _20°C 条件下保存备用。7
PCR 扩增体系如下IOXPfu PCR buffer 10 μ 1，10 μ M 上游引物 10 μ 1，10 μ M 下游引物 ο μ 1，2.5mMdNTPs 8 μ 1，pJC164.3 质粒 10ng，ddH20 加至 100 μ 1，PfoDNA 聚合酶 5U。PCR 程序为 94 "C 2min ； 30 X (94 "C 45s ； 58 "C 50s ； 72 "C 4min)； 72°C lOmin。 以下PCR反应同此条件。
pMD19-T-CM用BamHI/XhoI双酶切后获得CM片段，与经过相同双酶切处理 的pMD19-T_spoVAF载体，用T4DNA连接，构建得到pMD19-T-spoVAF_CM载体，酶切验证正确后于-20°C条件下保存备用。
pMD19-T-LysA用BamHI/Kpnl双酶切后获得LysA片段，与经过相同双酶切处 理的pMD19-T-spoVAF_CM载体，用T4DNA连接，构建得到pMD19-T-S_C-L载体，酶切验证正确后于-20°C条件下保存备用。
以spoVAF-HSEQIDNO.l)为上游引物，LysA-R6EQ ID NO.4)为下游引物， 以pMD19-T-S-C_L载体为模板进行PCR扩增反应，PCR产物即为SpovAF-CM-LysA同 源交换片段，经PCR产物回收试剂盒回收处理后即可用于电转化操作。
(2) SpovAF-Pspac-LysA同源交换片段的构建
构建路线见图2。以 Pspac-HSEQ ID N0.7)和 Pspac-RXSEQ ID N0.8)为引物， 以PDG-Stu质粒(BGSC，含有Pspac启动子基因)为模板PCR扩增得到Pspac启动子基 因，该启动子受LacI抑制。扩增得到的Pspac启动子克隆至pMD19-T载体，经验证、 测序正确后，命名为pMD19-T-Pspac，于_20°C条件下保存备用。
pMD19-T-Pspac用BamHI/XhoI双酶切后获得Pspac片段，与经过相同双酶切 处理的 pMD19-T-spoVAF 载体，用 T4DNA 连接，构建得到 pMD19-T_spoVAF-Pspac 载体，酶切验证正确后于-20°C条件下保存备用。
pMD19-T-LysA用BamHI/Kpnl双酶切后获得LysA片段，与经过相同双酶切处 理的 pMD19-T_spoVAF-Pspac 载体，用 T4DNA 连接，构建得到 pMD19-T_S"P-L 载体，酶切验证正确后于-20°C条件下保存备用。
以 spoVAF-HSEQ ID N0.1)为上游引物，LysA-R LysA-R6EQ ID N0.4) 为下游引物，以PMD19-T-S-P-L载体为模板进行PCR扩增反应，PCR产物即为 SpovAF-Pspac-LysA同源交换片段，经PCR产物回收试剂盒回收处理后即可用于电转化操作。
(3) BS-CM突变菌株的构建
构建路线如图3所示。以BS168为出发菌株，制备感受态细胞，采用电转化方 法，将获得的同源交换片段SpovAF-CM-LysA转化入BS168，在基因组SpovAF和LysA位点发生双交换，CM抗性平板上筛选得到BS-CM抗性菌株。该菌株的SpovAF和LysA 结构基因连接处被置换为CM基因，产生两个表型效应，一是BS-CM突变菌株具有氯霉 素抗性；二是，LysA基因天然启动子被置换掉，而CM基因含有终止子，其启动子不能 对LysA基因起转录作用，因此失去合成赖氨酸功能，BS-CM菌株成为赖氨酸营养缺陷 型突变体。
(4) BS-PS突变菌株的构建
构建路线如图4所示。以BS-CM为出发菌株，制备感受态细胞，采用电转化方 法，将获得的同源交换片段SpovAF-Pspac-LysA转化入BS-CM菌株，在基因组SpovAF和LysA位点发生双交换，基本培养基平板上筛选得到BS-PS突变菌株。通过两次同源 重组的双交换过程，原始枯草芽孢杆菌LysA基因启动子被置换为Pspac启动子，该启动 子受LacI基因抑制调节，菌株被改造为条件营养缺陷型，即在LacI基因存在时为赖氨酸 营养缺陷型，无LacI基因恢复正常表型。
实施例2利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌
(I)BS-PS菌株蛋白酶nprE和aprE失活整合载体的构建
本发明选取了两个枯草芽孢杆菌分泌较多的蛋白酶基因aprE和nprE，采用插入 失活的策略，进行突变失活研究。以大肠杆菌pMD19-T为骨架，构建了一个通用型整合 载体PLC-T。在通用载体的基础上构建了用于插入失活aprE基因的PLC-IaprE-T整合载 体和用于插入失活nprE基因的PLC-InprE-T整合载体。构建路线如图5所示。
PLC-T整合载体的具体构建过程如下
以P43-HSEQIDN0.9)/P43-RXSEQIDN0.10)为引物，以BS168基因组DNA为 模板 PCR 扩增 P43 启动子基因；L^ LacI-F (SEQ ID NO. 11)/LacI-R(SEQ ID NO. 12)为引 物，以质粒pMUTIN4 (BGSC,含有LacI结构基因)为模板扩增包括终止子在内的LacI基 因；以P43基因和LacI基因为模板通过SOE-PCR技术扩增获得P43-Lacl自主表达框， LacI基因受P43启动子控制，组成型表达。将P43_LacI表达框亚克隆至pMD19_T载体， 验证并测序正确后命名为pMD19-T_P43-LacI，于_20°C条件下保存备用。
以CM-HSEQ ID N0.5)/CM-RXSEQ ID N0.6)为引物，以 pJC164.3 质粒为模 板，PCR扩增CM表达元件，扩增产物用BamHI/XhoI双酶切，与经过相同双酶切处 理的pMD19-T_P43-LacI载体，用T4DNA连接，即获得PLOT载体，酶切验证正确后 于-20°C条件下保存备用。
PLC-IaprE-T整合载体的具体构建过程如下
以 aprE-HSEQIDN0.15)/aprE-RXSEQIDN0.16)为引物，B.subtilis 基因组为模板PCR获得该段基因，亚克隆至pMD19-T载体，验证测序正确后，命名为aprE-T。 通过基因分析软件，在基因内部找到HindIII可做为插入子(IS)的合适酶切插入位点。以 YH-HSEQ ID N0.19)/YH-RXSEQID N0.20)为引物，以酵母(NCBI，EU882859)基因 组为模板PCR扩增获得YH序列做为IS，两端带有HindIII酶切位点。用HindIII酶切处 理YH，与同样经过HindIII处理的aprE-T用T4DNA酶连接，得到载体IaprE_T。该载 体内，aprE基因内部插入了 YH序列，产生了插入失活效应，YH两侧的aprE序列即可 做为后续的同源交换片段。
IaprE-T载体用BamHI酶切处理，割胶回收得到IaprE基因片段，与同样经过 BamHI酶切处理的PLOT载体用WDNA酶连接，酶切电泳验证正确后，即得到用于插 入失活BSl68aprE基因的整合载体PLOIaprE-T。
PLC-InprE-T整合载体的具体构建过程如下
以 nprE-HSEQ ID N0.13)/nprE-R(SEQ ID N0.14)为引物，B.subtilis 168 基因组为模板PCR获得该段基因，亚克隆至pMD19-T载体，验证测序正确后，命名为 nprE-T。通过基因分析软件，在基因内部找到BglII可做为插入子(IS)的合适酶切插入位 点。以 YB-nSEQIDN0.17)/YB-RXSEQIDN0.18)为引物，以酵母(NCBI，EU882859) 基因组为模板PCR扩增获得YB序列做为IS，两端带有BglII酶切位点。用BglII酶切处理YH，与同样经过BglII处理的nprE-T用WDNA酶连接，得到载体InprE_T。该载体 内，nprE基因内部插入了 YH序列，产生了插入失活效应，YB两侧的nprE序列即可做 为后续的同源交换片段。
IaprE-T载体用BamHI酶切处理，割胶回收得到InprE基因片段，与同样经过 BamHI酶切处理的PLOT载体用WDNA酶连接，酶切电泳验证正确后，即得到用于插 入失活枯草芽孢杆菌168nprE基因的整合载体PLOInprE-T。
(2)BS_PS菌株aprE、nprE蛋白酶基因的插入失活
将含有蛋白酶插入失活的整合载体PLC-InprE-T电转化入BS-PS菌株，发生同 源重组过程。如图6(a)所示，第一次单交换，产生一过渡菌株BS-PS-PI，赋予宿主氯 霉素抗性特征，可通过氯霉素抗性平板进行筛选阳性重组子，同时宿主还会产生另一个 重要生理特征，即赖氨酸营养缺陷，这是由于载体上的LacI基因作用于Pspac启动子，从 而抑制了 LysA基因的表达，突变菌株不能在基本培养基上生长；如图6(b)所示，由于 此时两个同源臂的存在，在没有CM抗性筛选压力下，丰富培养基中多次传代培养后， 将会发生第二次单交换，由于交换事件可发生在两个同源臂中的任何一个，所以交换后 的基因型有两种，一种是整合载体序列全部交换丢失的基因型即产生了回复突变，另一 种是我们希望得到的基因修饰菌株。这两种交换结果都会使宿主恢复自我合成赖氨酸的 能力，即能够通过基本培养基筛选出发生了第二次单交换的菌株。这两种单交换产生的 基因型可以通过PCR技术加以区分，设计用来扩增靶基因的引物，以基因经过改造的菌 株基因组为模板扩增出来的条带比以回复突变菌株基因组为模板扩增的条带多出插入序 列的大小。通过此方法最终达到无抗生素抗性筛选标记的基因整合筛选。
(3)蛋白酶失活菌株的生理验证
无抗生素标记基因失活菌株生理验证BS-PS、BS-PS-In(基因失活，目的菌 株)、BS-PS-PI菌株(过渡菌株)划线于同一 MM(基本培养基平板)上，BS-PS-PI菌 株不能生长，是由于该菌株基因组整合LacI基因，LacI对控制LysA基因表达的启动子 Pspac有抑制作用，平板上会出现少数几个菌落的原因是LacI与Pspac结合的不牢固，或 者是在生长压力下，发生了单交换过程，长出的菌落可能是BS-PS或BS-PS-hi基因型菌 株。三种菌株均能在MM+赖氨酸的平板上生长。三种菌株中只有BS-PS-PI菌株能够 在MM+CM平板上生长，BS-PS菌株和BS-PS-PI菌株均在发生交换的过程中，CM基因 被置换掉，达到无抗生素基因残留的目的。
(4)蛋白酶失活菌株的分子验证
对nprE蛋白酶基因(BS-PS-nl菌株)失活过程的分子验证(图7)，以 nprE-F (SEQ ID N0.13) /nprE-R(SEQ IDN0.14)为引物，分别以枯草芽孢杆菌 168 基 因组 DNA (lane 1，1400bp)，BS-PS 基因组 DNA (lane 2，1400bp)，PLOInprE 基因组 DNAClane 3，1800bp)，BS-PS-PI 基因组 DNA(lane 4，1400bp and 1800bp)和 BS-PS-nl 基因组DNAClane 5，1800bp)为模板进行PCR扩增，扩增出与预期结果大小一致的产 物。图8是对aprE蛋白酶基因(BS"PS_nI-aI菌株)失活过程的分子验证，以aprE_F/ aprE-R 为引物，以 BS168 基因组 DNA(lane 1，800bp)，BS-PS-nl 基因组 DNA(lane 2， 800bp)，PLC-IaprE 基因组 DNA (lane 3，1200bp)，BS-PS-nl-PI 基因组 DNA (lane 4， 800bp 和 1200bp)和 BS-PS-nl-al 基因组 DNA (lane 5，1200bp)模板进行 PCR 扩增，扩增10出与预期结果大小一致的产物。
(5)蛋白酶失活菌株的生化验证
无抗生素标记基因失活菌株生化验证对BS-PS-In-Ia突变菌株插入失活后的 InprE和IaprE进行基因序列和读码框的分析，从理论上分析得出BS_PS菌株天然nprE蛋 白酶分子量为53.7kD，天然aprE蛋白酶分子量为36.1kD。对两个基因进行插入失活后， 由于读码框的改变，BS-PS"tn-Ia菌株InprE分子量为26.7kD，IaprE分子量为16.2kD。
为了验证理论上对两个蛋白酶分子量变化的推测，将BS-PS-In-Ia菌株摇瓶培 养，发酵液离心上清液浓缩后，以BS-PS菌株为对照，进行SDS-PAGE电泳分析。结果 为BS-PS-In-Li样品在53kD和36kD位置比泳道1少了两个蛋白条带，而在洸kD和16kD 位置比泳道1多了两个蛋白条带(图9)。因此验证了论证上对两个蛋白分子量变化的推 测。
权利要求
1.一种无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构建方法，其特征 在于包括下述步骤(1)分别构建SpovAF-CM-Lys和SpovAF-Pspac-Lys同源交换片段；(2)利用所述的SpovAF-CM-Lys转化枯草芽孢杆菌168感受态细胞，发生一次双交 换，该菌株基因组上LysA基因天然启动子被置换为含有终止子的CM基因，得到赖氨酸 营养缺陷型突变菌株BS-CM ；(3)利用所述的SpovAF-Pspac-Lys转化BS-CM感受态细胞，发生一次双交换，所述 的CM基因被替换为受LacI基因抑制调节的Pspac启动子，得到无抗生素抗性标记的条件 赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS。
2.根据权利要求1所述的无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构 建方法，其特征在于所述的SpovAF-CM-Lys同源交换片段通过如下步骤得到(1)以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板分别进行PCR扩增得到spoVAF基因和 Lys基因，以pJC164.3质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的CM基因，将这三个基 因分别克隆至PMD19-T载体，得到pMD19-T_spoVAF、pMD19_T_LysA、pMD19_T_CM 载体；(2)步骤(1)所述的pMD19-T_CM经双酶切后获得CM片段，与经过相同双酶切处 理的 pMD 19-T-spoVAF 载体连接得到 pMD 19-T-spoVAF-CM 载体；(3)步骤⑴所述的pMD19-T-LysA经双酶切后获得LysA片段，与经过相同双酶切 处理的pMD 19-T-spoVAF-CM载体连接得到pMD19-T-S_C-L载体；(4)以spoVAF-F(SEQIDNO.l)为上游引物，LysA-R(SEQ ID N0.4)为下游引物， 以步骤⑶所述pMD19-T-S-C_L载体为模板PCR扩增得到SpovAF-CM-LysA同源交换 片段。
3.根据权利要求1所述的无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构 建方法，其特征在于所述的SpovAF-Pspac-LysA同源交换片段通过如下步骤得到(1)以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板分别进行PCR扩增得到spoVAF基因和 Lys基因，以PDG-Stu质粒为模板PCR扩增得到Pspac启动子基因，将这三个基因分别 克隆至 pMD19-T 载体，得到 pMD 19-T-spoVAF、pMD19_T_LysA、pMD19-T_Pspac 载 体；(2)步骤⑴所述的pMD19-T-Pspac经双酶切后获得Pspac片段，与经过相同双酶切 处理的 pMD I9-T-SpoVAF 载体连接得到 pMD 19-T-spoVAF-Pspac 载体；(3)步骤⑴所述的pMD19-T-LysA经双酶切后获得LysA片段，与经过相同双酶切 处理的 pMD 19-T-spoVAF-Pspac 载体连接得到 pMD19-T_S"P-L 载体；(4)以spoVAF-F(SEQIDNO.l)为上游引物，LysA-R(SEQ ID N0.4)为下游引物， 以步骤⑶所述pMD19-T-S-P_L载体为模板PCR扩增得到SpovAF-Pspac-LysA同源交 换片段。
4.一种利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方 法，其特征在于包括如下步骤(1)按照权利要求1所述方法构建无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽 孢杆菌BS-PS ；(2)构建插入失活靶基因的同源整合载体；(3)将步骤(2)所述的同源整合载体转化步骤(1)所述的无抗生素抗性标记的条件赖 氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS，通过一次单交换和一次由于基因组结构不稳定引 起的自发单交换过程，以是否能自我合成赖氨酸为筛选标记，得到两种基因型的枯草芽 孢杆菌突变株，一种为枯草芽孢杆菌回复突变菌株，另一种为靶基因失活的无抗生素抗 性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株，经PCR鉴定筛选得到靶基因失活的无抗生素抗性标 记基因的枯草芽孢杆菌突变株。
5.根据权利要求4所述的利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草 芽孢杆菌的方法，其特征在于步骤(2)所述的插入失活靶基因的同源整合载体通过如下 方法构建(1)以大肠杆菌pMD19-T为骨架，构建了一个含有P43-Lacl自主表达框及CM结构 基因的通用型整合载体PLC-T ；(2)构建插入插入子的失活枯草芽孢杆菌168靶基因；(3)将步骤(2)所述的失活枯草芽孢杆菌168靶基因亚克隆至通用型整合载体 PLC-T,得到所述的插入失活靶基因的同源整合载体。
6.根据权利要求4所述的利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草 芽孢杆菌的方法，其特征在于步骤(3)所述的PCR鉴定方法为设计扩增靶基因的引物， 分别以靶基因失活的无抗生素抗性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株基因组和枯草芽孢杆 菌回复突变菌株基因组为模板进行PCR扩增，以靶基因失活的无抗生素抗性标记基因的 枯草芽孢杆菌突变株基因组为模板扩增出来的条带比以枯草芽孢杆菌回复突变菌株基因 组为模板扩增的条带多出插入序列的大小。
7.根据权利要求4 6任一项所述的利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因 失活的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于所述的靶基因为蛋白酶基因。
8.根据权利要求7所述的利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草 芽孢杆菌的方法，其特征在于所述的靶基因为nprE基因或aprE基因。
全文摘要
本发明公开了一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法。本方法首先以枯草芽孢杆菌168为出发菌株，构建两个同源交换片段，利用同源重组原理，通过两次双交换过程构建了一个可调控的赖氨酸营养缺陷型菌株BS-PS。以大肠杆菌克隆载体pMD19-T为骨架构建了通用型整合突变载体PLC，以枯草芽孢杆菌中性蛋白酶nprE为失活靶基因，采用插入失活策略，以PLC为基础，构建了插入失活nprE的整合载体PLC-InprE，转化入BS-PS，通过一次单交换，以及一次自发单交换过程，以控制赖氨酸的合成为筛选标记结合PCR验证结果，对蛋白酶插入失活的突变菌株进行筛选。
文档编号C12N15/10GK102021164SQ201010535809
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者别小妹, 吕凤霞, 张充, 王煜, 赵海珍, 陆兆新 申请人:南京农业大学