专利名称：抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种获得抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的动物转基因技术方法，属 于细胞工程领域。
背景技术：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄类动物发生的一种急性、热性、高度接触性传 染病，世界动物卫生组织将其列为A类烈性传染病之首，一旦暴发，必须扑杀感染及接触感 染的动物。2001年英国暴发口蹄疫损失约90亿英镑，占其国内生产总值的1. 1%；2005年 我国部分地区暴发Asia I型FMD，2009年初多个省区又发生了 A型FMD，不仅造成了巨大的 直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、 经济具有深远的影响。目前，大多数流行FMD的国家以计划免疫为主的措施预防FMD。尽管新型疫苗不断 涌现，但传统灭活疫苗仍是预防FMD的基础。FMDV变异快，血清型多，且不同血清型疫苗之 间没有交叉保护，故通过疫苗免疫的单一手段很难控制和根除FMD。因此，科学家们在注重 疫苗研发的同时，开始探索防控FMD的新策略，RNA interference (RNAi)因快速、特异的抗 病毒能力而成为新的研究热点。表达针对病毒不同基因的RNAi可切断病毒复制的源头，进而阻断病毒感染及其 扩散和传播，将打破传统的通过免疫学手段预防病毒病的思维模式，为控制和消灭家畜病 毒病开辟新的途径。RNAi是抑制病毒增殖的理想工具，其抗病毒功能在HIV(Chang等， 2005 ；Das 等；2004 ；Dave 和 Pomerantz，2004 ；Wu 等，2007)、HBV (Wu 等，2005 ；Wu 等，2007)、 埃博拉病毒(Geisbert等，2006)、脊髓灰质炎病毒(Gitlin等，2005)等病毒病的防控中进 行了广泛的研究，并得到了验证。许多学者针对FMDV不同基因并在细胞、实验动物及敏感动物猪等不同水平对 RNAi抗FMDV作用进行了探索和研究，目前的研究结果如下Liu等(2005)体外合成针 对FMDV基因组5’ NCR、VP4、VPg,3D和3’ NCR保守区的siRNA可抑制同种及异种FMDV在 BHK-21细胞内的增殖，病毒感染48h后的抑制率为10-1000倍，其特异性的抑制作用可持 续6天以上；该研究以多基因交叉保护的方式抑制了 FMDV在BHK-21细胞内的复制，为高度 变异的FMDV的防控提供了新的策略。de Ios Santos等(2005)构建了针对4种血清型2B 基因保守区的shRNA表达质粒，转染猪细胞后，可明显抑制病毒RNA及蛋白的合成，并减少 了病毒的产率，该shRNA抗病毒作用是其序列特异性的，并不是诱导产生的干扰素导致的。 Kahana等(2004)针对FMDV所有血清型3B和3D基因的保守区设计并合成了 3个siRNA， 共转染BHK-21细胞后，病毒在细胞内的增殖被100%的抑制。Kim等(2008)在FMDV感染 前，接种表达siRNA的腺病毒有效地抑制了 FMDV在猪IBRS-2细胞内的增殖，若在FMDV感 染前和感染后均使用siRNA，其抗病效果更理想。Lv等(2009)利用T7RNA聚合酶体外合成 的3个siRNA可特异性地沉默VPl-EGFP融合基因在293细胞内的表达；瞬时转染的siRNA可抑制FMDV在BHK-21细胞内的增殖。Pengyan等(2008)针对7个血清型的3D和2B1基 因的siRNA/shRNA可减少FMDV在BHK-21细胞内的生长滴度；颈部皮下注射shRNA表达质 粒后，FMDV对乳鼠的攻击减弱。Joyappa等(2009)将表达针对3D基因的shRNA的质粒转 染BHK-21细胞后，用IO2TCID5tl的FMDV攻毒，与对照组比，病毒生长滴度下降3倍；用该质 粒接种豚鼠后，对IO3GPID5tl的FMDV攻毒保护率为80%。Chen等(2004)转染针对VPl的 shRNA重组表达质粒，可使FMDV VPl在BHK-21细胞内的表达下降80-90%，进而特异性地 抗病毒感染，其抗病毒作用可持续48h;皮下注射该质粒的乳鼠对FMDV的敏感性显著下降。 Chen等(2006)利用表达针对3D基因siRNA的复制缺陷型的人5型腺病毒阻止同种和异 种FMDV对猪IBRS-2细胞的感染，并显著地降低了豚鼠及猪对FMDV感染的敏感性。Cong等 (2010a)构建了可针对VPl基因的不同靶点的siRNA表达质粒，在BHK-21细胞内其对A、0 和Asia I型VPl的表达具有沉默作用，并可抑制0型和Asia I型病毒的增殖；颈部皮下 注射其可明显地降低乳鼠对0型和Asia I型病毒的敏感性。Cong等(2010b)利用BHK-21 细胞病毒感染及乳鼠攻毒保护试验，筛选出针对3D(p3D-NT56)和2B基因的抗FMDVRNAi ； 在豚鼠的攻毒保护试验中，携带P3D-NT56的Salmonella choleraesuis C500减毒疫苗株 (P3D-NT56/S. cho)对RNAi同种的FMDV的攻毒保护率为80% ；预先接种p3D_NT56/S. cho 剂量为5x109CFU的猪，在FMDV攻毒后9天内的保护率为100%。上述研究结果表明，RNAi 是控制高传染性FMDV在家畜中传播的可选择的具有潜力的策略。转基因体细胞克隆技术是比较常用的家畜转基因技术，是基因组修饰技术与动物 体细胞核移植技术有机结合而产生的一种新的转基因动物制作技术，它部分地克服了传统 转基因动物外源基因整合率低、大动物生产成本高的技术瓶颈，代表当前转基因动物制作 的主流方向。在该方法中，核供体细胞在核移植前要经过重组质粒载体转染或重组病毒载 体感染、筛选和鉴定等环节，提高了转基因动物的阳性率。各种转基因动物的利记博彩app均需 先构建目的基因的重组载体，用于转基因技术的基因载体可分为病毒载体、质粒载体及人 工染色体等。其中Lenti-virus在介导基因转移研究中，发挥了重要作用。以人类免疫缺 陷病毒I型(HIV-I)为代表的Lenti-virus是复杂的逆转录病毒，经改造的Lenti-virus 作为外源基因载体，具有其独特的优势。慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转 移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点(Cockrell等， 2007)，是较好的RNAi转基因载体。Golding等(2006)利用RNAi技术针对引起牛疯牛病和 羊痒病的PRNP基因序列设计有效的siRNA，获得1头转基因羊胎儿，检测发现siRNA很好地 抑制了体内PRNP基因的表达。本发明根据Kahana 等(2004)及 Joyappa 等(2009)验证的抗 FMDV siRNA/shRNA 序列(本发明中分别为3B1、3D1和3D2)，构建了表达抗FMDV的shRNA重组Lenti-virus载 体，利用转基因体细胞克隆技术获得了抗FMDV RNAi转基因家畜。参考文献1. 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发明内容
针对上述现有技术，本发明的发明人进行了研究，研究表明，通过表达抗口蹄疫病 毒RNAi获得的杂合子或纯合子转基因家畜的FMDV感染率明显下降，具备了抗FMD的能力。 因此，制备抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的方法是获得抗FMD转基因家畜的最佳方法之
ο本发明的目的是提供一种通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜 的方法。通过本发明的方法获得的转基因家畜抑制FMDV在体内的增殖，其FMDV感染率明 显下降。本发明是通过以下技术方案实现的一种通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法是将携带 shRNA碱基序列(如表1)及GFP报告基因的抗口蹄疫病毒RNAi重组Lenti-virus载体线 性化并转染正常家畜的胎儿成纤维细胞，利用报告基因GFP、通过流式细胞分选仪筛分转基 因核供体细胞，将核供体细胞核导入家畜的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入 代孕家畜子宫中，得到的子代即为抗口蹄疫病毒RNAi的杂合子转基因家畜。还包括以下方法杂合子转基因公畜和杂合子转基因母畜正常交配或人工授精繁 殖而获得纯合子转基因家畜。所述家畜为牛、羊或猪，优选奶牛或肉牛。所述家畜胎儿成纤维细胞为35 150日龄胎儿不同组织来源的成纤维细胞，包括 耳成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、输卵管上皮细胞或卵丘细胞，优选皮肤成纤维细胞。所述将线性化的携带有抗口蹄疫病毒RNAi及报告基因的重组Lenti-virus载体转染家畜胎儿成纤维细胞方法为电转染法、脂质体转染法、病毒载体法或磷酸钙沉淀法，优 选脂质体转染法。所述脂质体转染法的条件为线性化的载体DNA浓度不低于1 μ g/ μ L，DNA 脂质 体 LTX =1:3。所述将抗口蹄疫病毒RNAi转基因核供体细胞核导入家畜的去核卵母细胞的方法 为显微注射法。所述去核卵母细胞不带有第一极体。本发明利用RNAi技术和体细胞克隆的方法将线性化的携带有抗口蹄疫病毒RNAi 及报告基因的重组Lenti-virus载体转染家畜胎儿成纤维细胞，获得抗口蹄疫病毒RNAi转 基因核供体细胞，将其细胞核导入家畜的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代 孕家畜子宫中，得到的子代即为抗口蹄疫病毒RNAi的杂合子转基因家畜。经杂合子转基因 公畜和杂合子转基因母畜正常交配或人工授精繁殖而获得纯合子转基因家畜。用本方法获 得的转基因家畜可表达抗口蹄疫病毒RNAi，使FMDV感染率明显下降，具备了抗FMD的能力。 本发明打破了传统的通过免疫学手段预防FMD的思维模式，为控制和消灭家畜FMD开辟了 新的途径，具有较高的实用价值和广阔的市场前景。
图1为体细胞克隆抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的生产流程图。图 2Lenti-virus Hl 载体酶切结果，其中，M :DL marker 10，000 ；1 =SmaI 和 AgeI 双酶切Hl载体；2 =XbaI和AgeI双酶切Hl载体。图3RNAi重组Hl载体的PCR鉴定结果，其中，M =DL marker 2，000 ；1 阳性对照； 2 空载体阴性对照；3 :RNAi-3Bl ；4 :RNAi_3Dl ；5 :RNAi_3D2#l ；6 :RNAi_3D2#2。图4抗口蹄疫病毒RNAi转基因奶牛胎儿的PCR鉴定结果，其中，M :DL marker 2，000 ；1和2 转基因胎儿，3 非转基因奶牛胎儿对照。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明。下述实施例中无特别说明均为常规方法，所用试剂及药品如无特别说明均购自 Sigma公司。实施例1 体细胞克隆抗口蹄疫病毒RNAi转基因奶牛的生产及分子生物学检测体细胞克隆抗口蹄疫病毒RNAi杂合子转基因奶牛的生产流程如图1所示，具体过 程包括如下步骤1. shRNA重组Hl表达质粒的构建将化学合成的RNAi-3Bll 和 RNAi_3B12、RNAi_3Dll 和 RNAi_3D12、RNAi_3D21 和 RNAi-3D22(见表1)分别退火后，与经XbaI和AgeI双酶切的HILenti-virus载体所获得 的12. 5kb以及经SmaI和AgeI双酶切Hl载体所获得的1. 5kb片段(图2)按照如下体系 连接12. 5kb 载体片段，IOOng ；1. 5kb 载体片段，50ng ；shRNA oligo，50ng ；T4DNA 连接酶， 0. 5μ L ； IOX T4DNA连接酶buffer，2 μ L，补足H2O使体系至20 μ L，16 °C过夜连接。转化大 肠杆菌DH5ci株感受态细胞，挑选克隆，提取质粒DNA，经PCR鉴定并经测序确认获得了相应的shRNA重组Hl载体，用于后续试验。PCR鉴定阳性重组质粒的方法是以小提质粒为模板，以已知重组阳性质粒及空载 体为对照，在引物LT-Pl 5’ -TGTCGCTATGTGTTCTGGGA-3’和引物LT-P2:5’ -GGTACAGTGCAGGGGAAAGA-3’的引导下，反应条件如下94°C30s ;94°C 20s 57 °C 20s 68 °C 30s，35 个循 环；68°C 3min,反应结束后对PCR产物进行3 %琼脂糖凝胶电泳检测，重组shRNA的质 粒PCR扩增结果为300bp片段，空载体的扩增结果为250bp片段。结果如图3所示，其 中，M =DL marker2, 000 ；1 阳性对照；2 空载体阴性对照；3 :RNAi_3Bl ；4 :RNAi_3Dl ；5 RNAi-3D2#l；6 :RNAi_3D2#2。表1 沉默FMDV 3B及3D基因的shRNA序列
权利要求
一种通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法，其特征在于是将携带shRNA碱基序列及GFP报告基因的抗口蹄疫病毒RNAi重组Lenti virus载体线性化并转染正常家畜的胎儿成纤维细胞，利用报告基因GFP、通过流式细胞分选仪筛分转基因核供体细胞，将核供体细胞核导入家畜的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕家畜子宫中，得到的子代即为抗口蹄疫病毒RNAi的杂合子转基因家畜。
2.根据权利要求1所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方 法，其特征在于，还包括以下方法杂合子转基因公畜和杂合子转基因母畜正常交配或人工 授精繁殖而获得纯合子转基因家畜。
3.根据权利要求1或2所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜 的方法，其特征在于所述家畜为牛、羊或猪。
4.根据权利要求3所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方 法，其特征在于所述家畜为奶牛或肉牛。
5.根据权利要求1或2所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜 的方法，其特征在于所述家畜胎儿成纤维细胞为35 150日龄胎儿不同组织来源的成纤 维细胞。
6.根据权利要求5所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方 法，其特征在于所述家畜胎儿成纤维细胞为耳成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、输卵管上皮 细胞或卵丘细胞。
7.根据权利要求1或2所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因 家畜的方法，其特征在于所述将线性化的携带有抗口蹄疫病毒RNAi及报告基因的重组 Lentiiirus载体转染家畜胎儿成纤维细胞方法为电转染法、脂质体转染法、病毒载体法或 磷酸钙沉淀法。
8.根据权利要求7所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家 畜的方法，其特征在于所述将线性化的携带有抗口蹄疫病毒RNAi及报告基因的重组 Lenti-virus载体转染家畜胎儿成纤维细胞方法为脂质体转染法，脂质体转染法的条件为 线性化的载体DNA浓度不低于1 μ g/ μ L，DNA 脂质体LTX = 1 3。
9.根据权利要求1或2所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜 的方法，其特征在于所述将抗口蹄疫病毒RNAi转基因核供体细胞核导入家畜的去核卵母 细胞的方法为显微注射法。
10.根据权利要求1或2所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜 的方法，其特征在于所述去核卵母细胞不带有第一极体。
全文摘要
本发明公开了一种通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法是将携带shRNA碱基序列及GFP报告基因的抗口蹄疫病毒RNAi重组Lenti-virus载体线性化并转染正常家畜的胎儿成纤维细胞，利用报告基因GFP、通过流式细胞分选仪筛分转基因核供体细胞，将核供体细胞核导入家畜的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕家畜子宫中，得到的子代即为抗口蹄疫病毒RNAi的杂合子转基因家畜。杂合子转基因公畜和杂合子转基因母畜正常交配或人工授精繁殖即获得纯合子转基因家畜。用本方法获得的转基因家畜可表达抗口蹄疫病毒RNAi，使FMDV感染率明显下降，具备了抗FMD的能力。
文档编号C12N15/113GK101979607SQ20101053512
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月8日 优先权日2010年11月8日
发明者仲跻峰, 何洪彬, 侯明海, 刘晓, 宋玲玲, 杨宏军, 武刚, 武建明, 王洪梅, 高运东 申请人:山东省农业科学院奶牛研究中心