专利名称：人源脐带血造血干细胞体外高效扩增技术的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及从健康人的脐带血中提取含造血干细胞的有核细胞作为扩增起始细胞，以健康人的脐带间充质干细胞作为滋养层，接种于含有脐带血血浆的特定培养基中共同培养，从而高效地扩增造血干细胞。
背景技术：
干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，根据分化潜能大小可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)是一类存在于造血组织中的多能干细胞，可以定向分化、增殖为不同的血细胞系，并进一步生成血细胞。造血干细胞在治疗白血病、恶性肿瘤、重症非恶性血液系统疾病以及某些遗传性疾病中有广泛的应用。造血干细胞根据来源又可分为骨髓造血干细胞、夕卜周血造血干细胞和脐带血造血干细胞。与骨髓和外周血造血干细胞相比，脐血造血干细胞更为原始，自我增殖能力最强，且脐带血具有采集方便、细胞免疫不成熟、移植过程中不需要严格配型等优点，因而脐带血造血干细胞具有极大的临床应用价值。但是，单份脐血的造血干细胞含量低，在临床中很难用于正常体重成人患者的移植。因此，造血干细胞在移植前需要进行体外扩增。目前，造血干细胞体外扩增技术主要有三种(1)细胞因子支持造血干细胞体外扩增；( 细胞滋养层支持造血干细胞体外扩增；( 三维空间立体培养。但这三种技术分别存在以下不足(1)细胞因子促进细胞扩增的同时也加速了细胞的分化，尚不能达到既扩增又保持其干细胞功能的目的，且细胞因子价格昂贵；( 滋养层细胞易渗入造血干细胞，而且一部分培养的造血干细胞也会迁入滋养层，要将培养的造血干细胞完全收获非常困难，另外异源滋养层细胞可能产生免疫排斥问题；C3)三维空间立体培养技术复杂，难以进行规模培养，且三维空间培养主要是模拟骨髓造血微环境，而骨髓造血干细胞与脐血造血干细胞的原始程度并不相同，两者本身的造血微环境差异很大，所以三维空间立体培养技术可能并非适合脐带血或外周血的造血干细胞体外扩增。因此，要想获得高产量的脐血造血干细胞，又不存在免疫排斥，而且成本低廉，就需要不断更新或优化造血干细胞体外扩增技术。为此，本发明利用脐带间充质干细胞(Mesenchymal stem cellS，MSCS)作滋养层， 添加脐带血血浆的方法来扩增脐带血造血干细胞，以脐血有核细胞为起始细胞，无需添加细胞因子，无需复杂的三维技术即可高效扩增脐带血造血干细胞。脐带间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞，可以产生多种细胞因子，利用脐带间充质干细胞作为滋养层具有以下几个优点(1)来源充足，取材方便，成本低廉；( 人脐带间充质干细胞含量丰富，较为原始，分化能力强，可在体外进行分离、培养，扩增迅速，且生物学性状稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可以提供充足的细胞来源；C3)免疫原性极低，免疫排斥的概率极低，且脐带间充质干细胞还具有一定的免疫抑制功能；(4)脐带间充质干细胞可以支持造血和促植入。作为造血微环境主要细胞成分-基质细胞系的干/祖细胞，间充质干细胞通过细胞对细胞的直接作用、分泌细胞外基质及多种细胞因子，实现对造血的精细调控，支持造血干细胞的生长。间充质干细胞与造血干细胞共同移植可促进造血干细胞的植入，对于提高造血干细胞的移植成功率有重要意义。同时，脐带血血浆中含有丰富的造血生长因子， 如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、单核细胞集落刺激因子(M-CSF)、红细胞生成素(Fpo)、白细胞介素-1 (IL-I)、白细胞介素-3 (IL-3)、白细胞介素-6 (IL-6)等等，具有促进造血干细胞生长与增值功能。其中有些脐血血浆因子可以与间充质干细胞分泌的细胞因子协同作用促进造血干细胞生长、增值，例如Flt3配体和EPO对⑶34+细胞的扩增起关键的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合脐带血造血干细胞的体外高效扩增技术，为治疗疾病和应用研究提供充足的造血干细胞。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下利用正常培养的第3代以内脐带间充质干细胞或直接利用复苏冷冻的脐带间充质干细胞(也为第3代以内的细胞)，接种于DMEM/F12培养液中培养，至细胞完全贴壁时， 全量换液为特定培养基(此特定培养基DMEM/F12 RPMI1640为1 1混合，另含10%胎牛血清和10%脐带血血浆，pH = 7. 0 7. 4)，接种从脐带血中提取的有核细胞，放置培养箱中共同培养，每隔3 4天更换半量培养基，培养、扩增至第10 11天，此时收集的细胞中造血干细胞最为丰富。若要获得更多的造血干细胞，重复之前的培养过程即可。其过程为(1)脐带间充质干细胞滋养层的制备取正常培养的第3代以内脐带间充质干细胞或复苏已冻存的第3代以内脐带间充质干细胞(间充质干细胞来自健康人的脐带，按照常规的组织块法制备获得，正常按1 2 的比率传代)，接种于DMEM/F12培养液中培养，至细胞完全贴壁。(2)脐带血有核细胞的提取采集健康人的脐带血，按5 1比例加5%羟乙基淀粉(脐带血羟乙基淀粉为 5 1)，混勻6 8分钟，与4°C静止4 5小时，取上清离心即可获得有核细胞，分离得到的血浆保存待用。(3)脐带血造血干细胞培养、扩增当脐带间充质干细胞培养至完全贴壁时，全量换液为特定培养基(此特定培养基 DMEM/F12 RPMI1640为1 1混合，另含10%胎牛血清和10%脐带血血浆，pH = 7. 0 7. 4)，并接种脐带血有核细胞共同培养(脐带血有核细胞接种浓度为5 8X IO5ceIls/ ml)，每隔3 4天更换半量培养基，至第10 11天即可收集细胞。若要获得更多的造血干细胞，将收集的细胞接种于重新制备好的含脐带间充质干细胞滋养层的培养液中，重复脐带血造血干细胞培养、扩增过程即可。整个过程要求无细菌、真菌、病毒和支原体等污染。本发明联合应用脐带间充质干细胞和脐血血浆，选用脐带血有核细胞作为起始培养细胞，而非单个核细胞或单纯的造血干细胞，发现在扩增过程中细胞分化的比例更小，因此，本技术不但可以高效地体外扩增造血干细胞，而且还避免了造血干细胞增殖的同时也加速分化的不足。
本发明与现有的造血干细胞体外扩增技术相比具有明显的优势第一，脐带间充质干细胞与脐血血浆联合应用，不但可以高效扩增造血干细胞，而且还可以在一定程度上抑制或减缓造血干细胞的分化，不需加外源细胞因子，大大降低了成本。第二，脐带间充质干细胞作为滋养层，无需丝裂霉素C或γ -射线2IGy照射等处理，由于其免疫原性低，且具有免疫抑制功能，可以提高造血干细胞移植的成功率，所以即使少量的滋养层间充质干细胞混入造血干细胞中对临床治疗非但不会产生免疫排斥等副作用，反而具有促进功能。第三，本发明不用三维空间技术，简化了培养、扩增过程，便于规模化生产。
具体实施例方式实施例1、造血干细胞体外扩增(1)脐带间充质干细胞的制备①采集健康人的脐带；②去掉脐带内血管和外层薄膜；③将脐带组织剪切成1 2mm3大小的小块；④将剪切后小块种植于加有DMEM/F12培养液的培养皿(直径为100mm)中培养， 置37°C，5% CO2培养箱中培养；⑤每3 4天半量换液，培养14 16天细胞生长约80%汇合；⑥当细胞约80%汇合时，利用0. 25%胰酶对细胞进行消化，以1 3X IO5ceIls/ ml接种于培养皿中传代培养；⑦当细胞约80%汇合时，利用0. 25%胰酶对细胞进行消化，收集第1代细胞，按 1 2比率进行传代，置于37°C、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养；⑧若需多次传代，重复步骤⑦即可；⑨若需冷冻细胞，以90%胎牛血清(FBS)+10%二甲基亚砜(DMSO)的混合液作为冷冻保护剂，细胞浓度为3 5X 106cells/ml，进行常规冷冻。(2)脐带间充质干细胞滋养层的制备①收集第3代以内(包括第3代)脐带间充质干细胞，或复苏已冷冻的第3代以内(包括第3代)脐带间充质干细胞；②将脐带间充质干细胞接种于DMEM/F12培养液的培养皿(直径为100mm)中，调整细胞浓度为0. 4 0.6父105(^118/1111，置371，5% CO2培养箱中培养；③至脐带间充质干细胞完全贴壁，无需丝裂霉素C或γ -射线21Gy照射等处理。(3)脐带血有核细胞的提取采集健康人的脐带血，保存于抗凝血袋中，按5 1的体积比加入5%羟乙基淀粉 (HES)(脐带血羟乙基淀粉为5 1)，混合均勻，于4°C冰箱静置4 5小时，沉降红细胞， 取上清，2000rpm离心lOmin，获得有核细胞，其中含0. 83%⑶34+细胞(⑶34为造血干细胞表面抗原)。(4)脐带血造血干细胞培养、扩增滋养层间充质干细胞培养至完全贴壁时，全量换液为特定培养基(此特定培养基 DMEM/F12 RPMI1640 为 1 1 混合，另含 10% FBS 和 10%脐带血血浆，pH = 7. O 7. 4)， 并接种脐带血有核细胞共同培养(脐带血有核细胞接种浓度为5 8X 105cells/ml)，每隔3 4天更换半量培养基，至第10 11天即可收集细胞，此时收集的细胞中造血干细胞最为丰富。若要获得更多的造血干细胞，将收集的细胞接种于重新制备好的含脐带间充质干细胞滋养层的特定培养基中，每隔34天更换半量培养基，至第10 11天即可收集细胞，多次重复此培养、扩增过程可获得大量造血干细胞。实施例2、造血干细胞体外扩增效果测定(1)测定分组将提取的脐带血有核细胞接种于下面各组，以比较造血干细胞体外扩增效果。A组(仅含MSC)脐带间充质干细胞作滋养层，培养基为DMEM/F12 RPMI1640 为 1 1 混合,另含 10% FBS, pH = 7. 0 7. 4 ；B组(仅含细胞因子)无脐带间充质干细胞滋养层，培养基为DMEM/ F12 RPMI1640为1 1混合，另含10% FBS和干细胞生长因子(SCF) 30ng/ml、血小板生成素(TPO) 20ng/ml、FLT-3 配体(FL) 20ng/ml, pH = 7. 0 7. 4 ；C组(MSC+细胞因子)脐带间充质干细胞作滋养层，培养基为DMEM/ F12 RPMI1640为1 1混合，另含10% FBS和干细胞生长因子(SCF) 30ng/ml、血小板生成素(TPO) 20ng/ml、FLT-3 配体(FL) 20ng/ml, pH = 7. 0 7. 4 ；D组(MSC+脐血血浆)脐带间充质干细胞作滋养层，培养基为DMEM/ F12 RPMI1640为1 1混合，另含10% FBS和10%脐带血血浆，pH = 7. 0 7. 4。(2)扩增效果测定以上各组分别于培养第6和第11天测定⑶34+细胞和集落形成单位(Colony forming unit，CFU)扩增倍数。⑶34为造血干细胞表面抗原，⑶34+细胞数的多少反映造血干细胞的增殖情况，⑶34+细胞采用MiniMACS免疫磁性吸附柱分离装置进行分离，利用FACS Calibur流式细胞仪分析⑶34+细胞纯度；集落形成单位(CFU)包括粒单系集落形成单位(Colony forming unit for granulocytes/macrophage, CFU-GM)、粒红单巨核集落形成单位(Colony forming unit for granulocytes, erythroid, monocytes and megarkaryocytes, CFV-GEWA) ,tlM'B^MWMf^^-itL (Burst forming unit erythroid, BFU-E)和高增值潜能集落形成单位(High proliferative colony forming unit, HPP-CFU)，主要反映造血干细胞的增殖分化情况，利用甲基纤维素培养基(内含干细胞生长因子、白介素_3、白介素_6、粒细胞集落刺激因子、粒单细胞集落刺激因子和血小板生成素)培养分析，集落以细胞数大于50个计数。A组(仅含MSC)⑶34+细胞和集落形成细胞(CFU)扩增倍数第6天为2. 0倍和 4. 1倍、第11天为4. 1倍和6.0倍；B组(仅含细胞因子)⑶34+细胞和集落形成细胞(CFU)扩增倍数第6天为3. 0 倍和4. 3倍、第11天为3. 5倍和6. 5倍；C组(MSC+细胞因子)⑶34+细胞和集落形成细胞(CFU)扩增倍数第6天为4. 4 倍和6. 3倍、第11天为16. 8倍和10. 2倍；D组(MSC+脐血血浆)⑶34+细胞和集落形成细胞(CFU)扩增倍数第6天为20. 7 倍和11. 8倍、第11天为46. 6倍和22. 7倍。通过对比研究发现联合应用脐带间充质干细胞与脐带血血浆，以脐带血有核细胞为起始细胞，可以高效地体外扩增造血干细胞，且此方法对造血干细胞的分化具有一定
6的抑制或延缓缓作用，因此利用这种技术可以为临床治疗与研究提供成本低廉、扩增简便、 低免疫原性的造血干细胞。
权利要求
1.人源脐带血造血干细胞体外高效扩增技术，其特征是联合应用脐带间充质干细胞和脐血血浆，以脐带血有核细胞为起始细胞进行体外扩增，其过程为培养脐带间充质干细胞至完全贴壁作为滋养层一换液为含脐血血浆的特定培养基一接种脐带血有核细胞一培养、 扩增。
2.根据权利要求1所述的扩增技术，其特征是联合应用人脐带间充质干细胞和人脐血血浆。
3.根据权利要求2所述的扩增技术，其特征是人脐带间充质干细胞为第3代以内(包括第3代)的细胞。
4.根据权利要求1所述的扩增技术，其特征是培养脐带间充质干细胞至完全贴壁作为滋养层。
5.根据权利要求1所述的扩增技术，其特征是培养中所用的特定培养基含DMEM/F12、 RPMI1640、FBS和脐带血血浆。
6.根据权利要求5所述的扩增技术，其特征是特定培养基中DMEM/F12与RPMI1640按 1 1混合。
7.根据权利要求5所述的扩增技术，其特征是特定培养基中含10%体积浓度的脐带血血浆，但不限于此浓度。
8.根据权利要求1所述的扩增技术，其特征是扩增过程每隔3 4天更换半量培养基。
9.根据权利要求1所述的扩增技术，其特征是以人脐带血有核细胞作为扩增起始细胞。
10.根据权利要求1所述的扩增技术，其特征是单次培养、扩增周期为10 11天，但不限于此周期。
全文摘要
本发明公开了一种人源脐带血造血干细胞体外高效扩增技术，本技术联合应用脐带间充质干细胞和脐血血浆进行造血干细胞体外扩增，其过程为培养脐带间充质干细胞作为滋养层，以含脐血血浆的特定培养液作为造血干细胞的扩增培养基，以脐血有核细胞作为扩增起始细胞，本发明无需添加外源细胞因子，滋养层无需丝裂霉素C或γ-射线21Gy照射等处理，无需三维技术，即可高效扩增造血干细胞，具有成本低廉、扩增方便、产品低免疫原性等优点，是一种适宜规模化生产的技术，此技术的实际应用将会对临床治疗与研究产生重要作用。
文档编号C12N5/0789GK102465112SQ20101053271
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月1日 优先权日2010年11月1日
发明者张正前 申请人:张正前