专利名称：一种植物乳杆菌及其细菌素发酵和制备方法与用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及微生物应用技术，具体地说是涉及一种高产广谱细菌素的植物乳杆菌 新菌株，本发明还涉及该菌株及其所产细菌素的应用。
背景技术：
自二十世纪五十年代以来在动物饲养和饲料中广泛长期和大量使用抗生素、化学 合成药物等促生长保健剂，导致了畜禽和水产产品中药物残留严重、畜禽产品品质下降、细 菌多重耐药性、耐药菌株增多，给人类大众健康安全和生态环境带来很大威胁。由于抗生素 的诸多副作用，特别是近年来消费者对食品安全问题的关注，世界各国都在纷纷禁用或限 制抗生素的使用，并加速开发、推广新型安全高效的绿色生物兽药和生物饲料添加剂，以替 代或减少抗生素等药物的使用。细菌素是由微生物通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或低 分子量多肽物质，抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌，产生菌对其细菌素具有自身免疫性。 细菌素作为一种特殊的抗菌抑菌蛋白质，具有抑菌活性强、生物相容性好、性能稳定、可生 物降解、可消化吸收、生物安全性高的特点，在预防及治疗畜禽疾病、生产绿色生物饲料添 加剂和生物兽药领域具有广阔的开发应用前景。在众多微生物添加剂中，乳酸菌是饲用微生物添加剂中应用最为广泛。有大量报 道证明这类饲用微生物添加剂具有良好的生物学功能，并且已在饲料工业中得到广泛应 用，但未见高产细菌素的乳酸菌作为微生物饲料添加剂和生物兽药。乳酸菌的代谢产物，包 括细菌素、乳酸、消化酶等，它们对动物的主要作用有(1)乳酸菌是多种动物消化道主要 的共生菌，对稳定、平衡和优化消化道菌群结构有重要作用；(2)调节宿主肠道菌群，提高 机体免疫力，增强抗病能力；C3)其代谢产物可以促进营养物质分解，促进营养物质吸收；[4]其代谢产生的乳酸和乳酸菌素可以有效抑制肠道腐败菌和有害的繁殖及有害物质的 产生等。基于以上特性，我们把乳酸菌作为本案筛选获取优秀菌株的主要种类。在工业微生物发酵生产的过程中，决定生产水平和生产成本高低的最主要因素有 三个生产菌种、发酵工艺和后提取工艺或后加工工艺，其中，最重要的是生产菌种的特性。 因此从自然界中寻找性能优秀的菌株成为一项十分重要的工作，运用常规方法从自然界分 离菌种时，工作量大，效率低下，针对性不强，难以在短时间内获得符合生产要求的菌株。为 提高效率，迫切需要一种有效的筛选方法，本发明所提及的定向筛选方法很好的解决了这 一问题。
发明内容
本发明的第一个目的在于是提供一株具有高产广谱抑菌活性细菌素的植物乳杆 菌新菌株YJG。本发明的另一个目的是提供上述菌株或其所产细菌素在制备绿色生物兽药或生 物饲料添加剂中的应用。
本发明通过点种法和牛津杯法从鸡肠道中分离得到一株具有高产广谱抑菌活性 细菌素的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum) YJG。该菌株已于2009年03月30 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路甲3 号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum)，保藏号为 CGMCCNo. 2994。植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum) YJG，细胞形状呈杆状，在MRS培养基上， 菌落为乳白色圆形凸起，电子显微镜测量为0. 5 1. 2X 1. 0 10. 0 μ m(长1. 0 10. 0 μ m， 直径0. 5 1. 2 μ m)，呈现革兰氏染色阳性；不生孢子，无鞭毛，不运动；厌氧或兼性厌氧； 化能异养菌，需要营养丰富的培养基；发酵分解糖代谢，终产物50%以上是乳酸；接触酶和 氧化酶皆为阴性，最适生长温度30 40°C。菌株YJG通过法国生物梅里埃公司API-50CHL 生化鉴定试剂条快速鉴定，记录24h和48h的糖发酵结果(表1)，将结果在apiweb在线数 据库中进行鉴定，所得鉴定结果均为Lactobacillus plantarum 1，其鉴定概率(％ id)分 别是是99.9%和99.0%，期望值(T)分别是0.90和0.90，均为极好的鉴定结果，因此判定 菌株YJG为植物乳杆菌。表1.菌株YJG在24h和48h的糖发酵结果权利要求
1.植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) YJG，保藏号为 CGMCC No. 2994。
2.由权利要求1所述菌株产生的细菌素。
3.权利要求1所述菌株的发酵培养方法，其包括步骤1)种子培养将植物乳杆菌YJG接入灭菌后的液体培养基中，于25 35°C培养M 48小时，得到 种子液，液体培养基的配制如下蛋白胨9 llg，牛肉膏9 llg，酵母浸粉3 7g，葡萄糖 15 20g，柠檬酸胺1 3g，三水合乙酸钠3 6g，磷酸氢二钾1 3g，吐温800. 5 1. 5mL， 硫酸镁0. 1 0. 2g，硫酸锰0. 03 0. 06，水IOOOmL ；2)发酵培养将步骤1)得到的种子液按接种量 15%接种到发酵培养基中进行发酵培养，培养 条件30 37°C，通气量0. 5 2. 5vvm,转速150 300rpm，发酵30 48小时，所述发酵培养基包括碳氮比为1 2 20的发酵底物，发酵底物按照与水比为3 20 100配制成发酵培养基。
4.一种制备权利要求2所述细菌素的方法，其包括如下步骤1)制备发酵液发酵培养权利要求1所述的菌株，得到发酵液；2)分离细菌素粗品将得到的发酵液离心沉淀菌体等、取上清，在上清中加硫酸铵至 饱和度为80%，4°C下静置8 16小时，离心弃去上清得到细菌素粗品；3)纯化将沉淀物溶解于0.IOM pH6. 8的磷酸盐缓冲液，上经10mMpH7. 0硫酸钠缓冲 液预平衡的kphadex G-25凝胶柱，固定流速0. 5ml/min,分段收集洗脱液，并收集具有抑 菌活性的洗脱峰。
5.权利要求1所述菌株或权利要求2所述细菌素在制备绿色生物兽药或绿色饲料添加 剂中的应用。
6.含有权利要求1所述菌株或权利要求2所述细菌素的绿色生物兽药或绿色饲料添加剂。
全文摘要
本发明提供了一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)新菌株YJG，于2009年3月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.2994。本发明植物乳杆菌菌株YJG能够高产广谱抑菌活性细菌素，对革兰氏阴性菌Staphylococcus aureus、Salmonella、E.coli及革兰氏阳性菌L.plantarum、L.brevis、Streptococcus、Bacillus等有抑菌表现，高剂量攻毒试验表明，其对动物体是安全的。本发明植物乳杆菌YJG及其发酵菌液可以用于制备动物绿色饲料添加剂，其细菌素可以用于制备绿色生物兽药、食品生物防腐剂、生防药物等。
文档编号C12N1/20GK102041238SQ20101052835
公开日2011年5月4日 申请日期2010年10月22日 优先权日2009年10月22日
发明者刘开健, 张日俊, 韩冰, 黄燕 申请人:中国农业大学