专利名称：一种治疗肿瘤的细胞简易培养方法
技术领域：
本发明专利涉及一种能够用于肿瘤治疗的淋巴细胞的简易培养方法。
背景技术：
目前，公知的人体恶性肿瘤的治疗方法一般有手术治疗、放射治疗、化学治疗及生物治疗，但是有些肿瘤可能难于用上述方法治疗或者上述方法治疗的不良反应较大，使患者无法耐受，这种情况下，就需要创新的其他辅助治疗来改善肿瘤患者的晚期生活质量，延长生命。
发明内容
为了克服临床上恶性肿瘤治疗中存在的问题，本发明的目的是给出了一种应用自身淋巴细胞来治疗恶性肿瘤的生物方法，即，从人外周血中分离淋巴细胞，将其在添加有白细胞介素-11、谷氨酰胺及血浆的培养液中，在添加抗CD8、抗CD16及抗CD56抗体的前提下培养分离出淋巴细胞。这样培养出的淋巴细胞当中，NK细胞占得比例较常规淋巴细胞中的大，且NK细胞杀伤肿瘤细胞的活力增加，可以有效杀伤多种多样的恶性肿瘤细胞的培养方法。该培养方法，其特征在于该方法包括从人外周血中分离淋巴细胞的过程；第一培养步骤，其在添加有白细胞介素-11、谷氨酰胺及血浆的培养液中，在添加抗CD8、抗CD16及抗 CD56抗体的前提下培养分离出的淋巴细胞；第二培养步骤，将上述培养出的淋巴细胞混合液再次与添加白细胞介素-11、谷氨酰胺及血浆的培养液以及添加抗CD8、抗CD16及抗CD56 抗体的培养液混合，进行再次培养。这样培养的淋巴细胞可以大量杀伤恶性肿瘤细胞，从而用于副作用少、给药方便的恶性肿瘤患者晚期生物治疗，以改善治疗效果，延长患者生命。
具体实施例方式该种用于肿瘤治疗的淋巴细胞的简易培养方法，其简略过程为首先从人外周血中分离淋巴细胞，第一培养步骤，其在添加有白细胞介素-11、谷氨酰胺及血浆的培养液中， 在添加抗CD8、抗CD16及抗CD56抗体的前提下培养分离出的淋巴细胞；第二培养步骤，将上述培养出的淋巴细胞混合液再次与添加白细胞介素-11、谷氨酰胺及血浆的培养液以及添加抗CD8、抗CD16及抗CD56抗体的培养液混合，进行再次培养， 培养出具有高度抗恶性肿瘤活性的自身活化淋巴细胞的方法。其具体培养方法过程大体包括从人外周血中分离淋巴细胞，第一培养步骤，第二培养步骤，第三培养步骤。分离淋巴细胞的步骤(1)在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。(2)取抗凝血与等量Hank’ s液或平衡盐溶液充分混勻，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持两液面界面清晰，水平离心2000rpmX20分钟。( 离心后，管内液体分为三层，上层为血浆和Hank’ s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在中上层液面处有一白色云雾层狭窄带，即为富含淋巴细胞和单核细胞的单个核细胞(PBMC)及血小板。(4)吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC，移入一新的离心管中； (5)加入Hanks’液或无血清培养液，混勻后离心200Xg 10分钟，弃去上清液(低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板)。(6)再用同样洗涤液洗涤细胞2次，每次离心500 Xg 10分钟，以洗去残留的淋巴细胞分离液。再用细胞培养液将细胞调配成适当浓度。通常，每毫升外周血可得1 2X 106PBMC。第一培养步骤将分离的人外周血淋巴细胞，再添加有白细胞介素-11、谷氨酰胺及血浆的培养液中，首先在抗CD8存在的前提下进行培养，然后在抗CD16及CD56分别存在的条件下依次进行培养，所含有的培养液含有800-1000IU/ml的白细胞介素11。第二培养步骤在上述第一培养步骤中，将培养出来的淋巴细胞，在添加有白细胞介素-11、谷氨酰胺及血浆的培养液中培养16-20小时，然后将上述固相包被抗CD8的培养板中的培养液移到固相包被抗⑶56的培养板中培养16-20小时，再将上述培养液移到固相包被⑶16的培养液中培养48-72小时。将其首先在抗CD8存在的前提下进行培养，然后在抗CD16及 CD56分别存在的条件下依次进行培养。第三培养步骤将经过第二培养步骤的混合培养液注入到含有IL培养液的透气性培养袋中进行培养8-10天，使细胞大量繁殖。第三培养步骤中的培养液可以使用含有氨基酸、维生素、 有机化合物和无机化合物以及蛋白质等细胞生长所必须的营养成分的培养液，可以含有 100-200IU/ml白细胞介素_2的培养液。经过上述培养步骤所得的淋巴细胞，NK细胞量大大增加，活性增强。可以达到上述的治疗效果。
权利要求
1.一种治疗肿瘤的细胞简易培养方法，其特征在于，该方法包括从人外周血中分离淋巴细胞的过程；第一培养步骤，其在添加有白细胞介素-11、谷氨酰胺及血浆的培养液中，在添加抗 ⑶8、抗⑶16及抗⑶56抗体的前提下培养分离出的淋巴细胞；第二培养步骤，将上述培养出的淋巴细胞混合液再次与添加白细胞介素-11、谷氨酰胺及血浆的培养液以及添加抗⑶8、抗⑶16及抗⑶56抗体的培养液混合，进行再次培养。
2.在如权利要求1所述的一种治疗肿瘤的细胞简易培养方法，其特征在于，在上述第一培养步骤中，将分离的人外周血淋巴细胞，再添加有白细胞介素-11、谷氨酰胺及血浆的培养液中，首先在抗CD8存在的前提下进行培养，然后在抗CD16及CD56分别存在的条件下依次进行培养。
3.在如权利要求2所述的一种治疗肿瘤的细胞简易培养方法，其特征在于，在上述第一培养步骤中，将培养出来的淋巴细胞，在添加有白细胞介素-11、谷氨酰胺及血浆的培养液中培养16-20小时，然后将上述固相包被抗CD8的培养板中的培养液移到固相包被抗⑶56的培养板中培养16-20小时，再将上述培养液移到固相包被⑶16的培养液中培养48-72小时。将其首先在抗CD8存在的前提下进行培养，然后在抗CD16及CD56 分别存在的条件下依次进行培养。
4.在如权利要求3所述的一种治疗肿瘤的细胞简易培养方法，其特征在于，将上述步骤重复一次。
5.在如权利要求1所述的一种治疗肿瘤的细胞简易培养方法，其特征在于，在上述第一和第二培养步骤中所含有的培养液含有800-1000IU/ml的白细胞介素11。
6.在如权利要求1所述的一种治疗肿瘤的细胞简易培养方法，其特征在于，该方法还包括，第三培养步骤，将经过第二培养步骤的混合培养液注入到透气性培养袋中进行培养。
全文摘要
本发明公开了一种治疗肿瘤的细胞简易培养方法，根据本发明的淋巴细胞的简易培养方法，其特征在于，该方法包括从人外周血中分离淋巴细胞；在添加白细胞介素-11、谷氨酰胺及血浆的培养液中，在添加抗CD8、抗CD16及抗CD56抗体的前提下培养分离出的淋巴细胞；将上述培养出的淋巴细胞混合液再次与添加白细胞介素-11、谷氨酰胺及血浆的培养液以及添加抗CD8、抗CD16及抗CD56抗体的培养液混合，进行再次培养。该方法简单易行，工艺容易掌握，临床及基础实验应用范围较广。
文档编号C12N5/07GK102453692SQ20101052757
公开日2012年5月16日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者张文龙 申请人:张文龙