专利名称：一种减少l-色氨酸发酵过程中代谢副产物乙酸的方法
一种减少L-色氨酸发酵过程中代谢副产物乙酸的方法技术领域：
本发明涉及一种减少L-色氨酸发酵过程中代谢副产物乙酸的方法， 属于发酵法生产氨基酸的技术领域。背景技术：
:L_色氨酸又名β-吲哚基丙氨酸，化学名L-2-氨基-3-吲哚基丙酸， 别名L-胰化蛋白氨基酸、L-氨基吲哚丙酸，分子式C11H12O2N2，相对分子质量204. 21。L-色 氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，它以游离态或结合态存在于生物体 之中。对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应 用于医药、食品和饲料等方面。世界市场L-色氨酸年需求量约为120万吨以上，而目前全 世界只有一万多吨的生产能力，且主要集中在日本、美国、中国、韩国等国家，因而L-色氨 酸的市场前景巨大。国内主要有上海、武汉、北京等地小规模少量生产用于药品的L-色氨 酸，但尚无厂家生产饲料添加剂用的L-色氨酸。因此，研究提高L-色氨酸产量方法具有重 要的理论意义和实用价值。目前利用微生物生产L-色氨酸的方法主要有酶法、微生物转化法和微生物发酵 法，其中微生物发酵法将是大规模生产L-色氨酸的首选技术，现常用菌株有大肠杆菌、谷 氨酸棒杆菌。由于大肠杆菌具有遗传特性较清楚、易培养、发酵周期短并能实现目的基因的 高效表达等特性，因而得到广泛地应用。但是，大肠杆菌生长时会产生乙酸，尤其是在重组 菌的高密度培养中，乙酸的产生和积累不仅会影响菌体生长，还会抑制产物的合成。因此， 减少发酵过程中乙酸的产生不但有利于实现大肠杆菌的高密度培养，而且对于提高L-色 氨酸产量和实现L-色氨酸生产的工业化极为重要。
发明内容本发明根据大肠杆菌在L-色氨酸发酵过程中会产生乙酸，抑制菌体 生长，导致L-色氨酸产量降低。采用控制溶氧水平、初糖浓度、葡萄糖限制流加等措施能显 著降低发酵过程中的乙酸含量，使得L-色氨酸产量得到显著提高。在发酵过程中，乙酸产生主要有两个原因，即设备的供氧能力不足使得重组菌的 呼吸受到限制和葡萄糖的摄入速率大于重组菌TCA循环的周转能力。这两种情况均会导致 底物通过乙酰磷酸途径转化为乙酸，且外源基因表达产生的代谢负荷会降低大肠杆菌的有 氧呼吸能力，导致重组菌生长过程中更易积累乙酸。L-色氨酸生产菌在生长过程中，需大量氧气参与代谢，溶氧浓度过高或过低，都 会影响菌体生长和产物生成。氧气对好氧微生物有潜在的毒副作用，氧浓度过高也会产生 Crabtree效应；过低的溶氧浓度则导致乙酸的大量生成，菌体生长受到抑制，比生长速率 下降，甚至菌体发生自溶，严重影响产物合成。维持一定水平的溶氧浓度，不仅有利于菌体 生长，还有利于提高产酸水平。优化碳源是实现L-色氨酸生产菌高密度发酵的关键因素，葡萄糖是目前最常用 的碳源物质。培养基中葡萄糖的浓度严重影响细胞的代谢方式，糖浓度超过50g/L时，大肠 杆菌的生长将会受到抑制。当L-色氨酸生产菌的比摄糖速率超过一定的临界值时，即使在 氧充足条件下E. coli也会发生Crabtree效应而产生乙酸。控制葡萄糖的摄入速率略低于 或等于TCA循环的周转能力，可有效避免中间产物乙酰辅酶A通过乙酰磷酸途径产生乙酸， 因此维持发酵过程中合适的葡萄糖浓度可有效减少乙酸产生。
此方法在不增加额外设备和人力投入的情况下，有效减少L-色氨酸发酵过程中 乙酸的产生并显著提高了 L-色氨酸的产量，适合于工业化生产。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供了减少L-色氨酸发酵过程中代谢副产物乙酸的方法，其特征是在 L-色氨酸发酵过程中，采用10 20g/L初糖浓度，更优选20g/L，控制溶氧水平在20 30%，更优选20%，维持发酵液中葡萄糖浓度为2 5g/L，更优选2g/L。本发明提出了适用于减少L-色氨酸发酵过程中副产物乙酸的方法，它通过采用 控制溶氧水平、初糖浓度、葡萄糖限制流加及控制菌体比生长速率等措施能显著降低发酵 过程中的乙酸含量，使菌体生物量及L-色氨酸产量得到显著提高。
具体实施方式下面通过实施例对本发明作进一步的说明，所举之例并不限制本发明的保护范 围实施例1 采用的菌株为大肠杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养基[葡萄糖20g/L、 酵母膏 lg/L，(NH4)2SO4 4g/L，柠檬酸钠 2g/L，MgSO4 · 7H20 5g/L，KH2PO4 2g/L，FeSO4 · 7H20 lOOmg/L]；培养方法将菌种接入种子培养基[葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，(NH4)2SO4 IOg/ L，柠檬酸钠 0. 5g/L，MgSO4 · 7H205g/L，KH2PO4 1. 5g/L，FeSO4 · 7H20 15mg/L，Vbi lOOmg/L] 中，接种量为10% ；在32°C、pH为7. 0和溶氧为20%条件下于5L自动控制发酵罐中培养 12h至对数期，按10%的接种量接入含有发酵培养基的30L自动控制发酵罐中，初始通气 量2L/min，搅拌转速500r/min 800r/min，溶氧水平为10 %，通过自动流加氨水控制pH 在7. 0，培养温度32°C，以泡敌消泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在 2g/L，发酵至40h停止。放罐时，代谢副产物乙酸含量为0.9g/L，L-色氨酸产量为32. Sg/ L，比对照实验(代谢副产物乙酸含量为2. 9g/L，L-色氨酸产量为23. 4g/L)乙酸含量减少 T 68. 96%, L-色氨酸产量提高了 40. 17%。实施例2:采用的菌株为大肠杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1)葡 萄糖浓度为10g/L ；培养方法同实施例1。放罐时，代谢副产物乙酸含量为1. 3g/L，L-色氨 酸产量为30. 2g/L，比对照实验(代谢副产物乙酸含量为2. 9g/L，L-色氨酸产量为23. 4g/ L)乙酸含量减少了 55. 17，L-色氨酸产量提高了 29.06%。实施例3:采用的菌株为大肠杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1)； 培养方法同实施例1，控制溶氧水平为30%。放罐时，代谢副产物乙酸含量为1. 5，L-色氨 酸产量为28. 7g/L，比对照实验(代谢副产物乙酸含量为2. 9g/L，L-色氨酸产量为23. 4g/ L)乙酸含量减少了 48. 27%，L-色氨酸产量提高了 22.65%。实施例4:采用的菌株为大肠杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1)； 培养方法同实施例1，通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在5g/L。放罐时， 代谢副产物乙酸含量为1. 6，L-色氨酸产量为26. 71g/L，比对照实验(代谢副产物乙酸含量为2.9g/L，L-色氨酸产量为23.4g/L)乙酸含量减少了 44.83%，L-色氨酸产量提高了 14. 14%。
权利要求
本发明提供了减少L 色氨酸发酵过程中代谢副产物乙酸的方法，其特征是在L 色氨酸发酵过程中，采用10～20g/L初糖浓度，控制溶氧水平在20～30％，维持发酵液中葡萄糖浓度为2～5g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是在L-色氨酸发酵过程中，初糖浓度为10 20g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是在L-色氨酸发酵过程中，控制溶氧水平在 20 30%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是在L-色氨酸发酵过程中，维持发酵液中葡 萄糖浓度为2 5g/L。
全文摘要
一种减少L-色氨酸发酵过程中代谢副产物乙酸的方法。本发明涉及一种发酵法制备L-色氨酸的改进方法。本发明根据调整细胞代谢流分配的原理，采用控制溶氧水平、初糖浓度、葡萄糖限制流加及控制菌体比生长速率等措施显著降低发酵过程中的乙酸含量，使菌体生物量及L-色氨酸产量得到显著提高。
文档编号C12R1/19GK101967502SQ20101052746
公开日2011年2月9日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日 公开号201010527463.发明者刘淑云, 徐庆阳, 谢希贤, 陈宁, 黄静 申请人:天津科技大学