专利名称：一种培育耐逆转基因植物的方法
技术领域：
本发明涉及一种培育耐逆转基因植物的方法。
背景技术：
干旱、低温、高温是影响作物生长发育的常见的非生物胁迫因子，很大程度上限制了作物的产量和地理分布。为了提高作物在逆境下的产量并且打破地理分布限制，找到新的耐逆基因并利用基因工程手段提高作物耐逆性是一个行之有效的途径。传统方法由于植物抗逆调控机制的复杂性以及缺乏有效的筛选技术等原因而受到限制。有研究表明，植物中大部分基因组都参与了自身对干旱、高盐等逆境因子的响应，改变某单一基因的表达量和表达模式可以显著提高作物的抗旱、抗盐能力。因此，克隆控制水稻逆境诱导相关基因十分必要，不仅可为我国水稻新品种的培育提供具有自主知识产权的目的基因，而且可加深对水稻等禾本科植物抵御非生物胁迫分子机制的认识，具有十分重要的现实价值与理论意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培育耐逆转基因植物的方法。本发明提供的培育耐逆转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示的蛋白的编码基因(命名为OsXLS)导入目的植物中，得到耐逆性强于所述目的植物的转基因植物。上述序列表中序列2所示的蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1的第16-177位；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；3)在严格条件下与1)或2、的基因杂交且编码上述蛋白的基因；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码上述蛋白的基因。序列1有263个核苷酸，其中第16-177是开放阅读框，可编码序列2所示的蛋白。上述严格条件可为用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. SDS的溶液，在DNA或者RNA 杂交实验中65°C下杂交并洗膜。上述序列表中序列2所示的蛋白的编码基因通过重组表达载体导入所述目的植物中的。可用现有的植物表达载体构建含有OsXLS基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、 pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN 或其它衍生植物表达载体。使用OsXLS基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、泛素 (Ubiquitin)基因启动子(ρ^ )等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、 萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。具体地讲，上述重组表达载体包括如下构建步骤将序列表中序列2所示的蛋白的编码基因插入质粒PJIT163的多克隆位点，得到的中间载体；将所述中间载体用KpnI和 XhoI酶切得到的含Double 35S启动子和所述编码基因的DNA片段与经KpnI和Mil酶切 PCAMBIA1300得到的大片段连接，得到重组表达载体。携带有本OsXLS基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。进一步讲，上述耐逆性是耐盐和/或耐旱。上述植物可以为双子叶植物或单子叶植物，优选是水稻。序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在培育耐逆转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围之内。上述序列表中序列2所示的蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1的第16-177位；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；3)在严格条件下与1)或2、的基因杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。上述耐逆性是耐盐和/或耐旱。上述植物可为双子叶植物或单子叶植物，优选是水稻。上述严格条件可为用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. SDS的溶液，在DNA或者RNA 杂交实验中65°C下杂交并洗膜。实验证明在1-2叶期的耐盐性检测实验中，转空载体对照材料和野生型对照比转基因的植株T-34(B)生长均要滞后；在3-4叶期的耐盐性检测实验中IOOmM盐处理的第3 天转基因植株的表现基本正常，转空载体对照材料和野生型对照大部分出现叶片卷曲的现象，IOOmM盐处理的第10天转基因植株大部分存活，转空载体对照材料和野生型对照基本上死亡，以上结果说明转OsXLS基因的植株耐盐性比空载体对照和野生型对照明显增强。 在耐旱性检测实验中，干旱处理的第3天，转空载体对照材料(WT)所有植株和野生型对照均出现叶片变黄、卷曲的现象，转基因植株T-13生长正常。第四天转基因植株T-13也出现所有植株均出现叶片变黄、卷曲的现象，在此时给植株加水，观察其恢复情况；复水之后转基因植株T-13大部分植株叶片展开、颜色变绿。而转空载体对照材料(WT)和野生型对照基本上死亡，以上结果进一步说明转基因的植株耐旱性比转空载体对照材料(WT)和野生型对照明显增强。
图1为OsXLS基因PCR克隆，利用cDNA为模板，扩增目标基因，产物大小与预测大小一致，M为Marker, 1为PCR扩增的cDNA。图2为菌落PCR鉴定，以转化的菌斑为模板，扩增目标基因，获得目的条带，说明所选克隆为阳性克隆，M为Marker，1-5为阳性克隆，6为阴性对照。图3为T载体酶切鉴定，利用HindIII和BamH I酶切克隆载体，有目的条带出现， 证明基因已连接到克隆载体上，M为Marker，1为酶切过的载体。图4为表达载体pCAMBIA1300图谱。图5 为 pJIT163 图谱。图6为电泳检测PCR结果，利用筛选基因潮霉素的检测引物，对转基因水稻植株进行鉴定，A中M为Marker，泳道1为阳性质粒对照，泳道2_18为17个转基因植株的检测；B 中M为Marker，泳道19-34为另17个转基因植株的检测，泳道36为野生型对照。图7为盐胁迫处理1-2叶期水稻苗，图7-II是图7_1中B、C的放大图。图8为盐胁迫处理3-4叶期水稻苗的照片，WT为转空载体对照，T34为转OsXLS株糸34 ；A为第3d的照片、B为第IOd的照片。图9为PEG处理水稻苗第3d、10d照片，WT为转空载体对照，T34.T13.T26分别为转OsXLS株糸34、T13.26 ；A为第3d的照片、B为第IOd的照片。图10分别为干旱胁迫处理水稻苗第3d、复水之后的照片，WT为转空载体对照，T13 为转OsXLS株糸T13 ；A为第3d的照片、B为复水之后的照片。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、培育转基因植物及其耐逆性检测一、培育转基因植物1、基因克隆①水稻总RNA提取水稻(培矮64s)(公众可从中国科学院亚热带农业生态研究所获得；记载的文献是傅亚萍等.抗除草剂基因导入培矮64S实现杂交水稻制种机械化的初步研究.中国水稻科学.2001 15(2))组织材料取材后迅速在液氮中研磨成粉末状，取约IOOmg粉末状材料置于盛有1.0ml TRIzol(Invitrogen)的1. 5ml离心管中，置-80oC保存备用。采用TRIzol 试剂提取法将-SOoC保存备用的样品取出，室温解冻后，加入200μ 1氯仿，振荡混勻，离心后，小心取出上层水相，转入另一离心管中，加入500μ 1异丙醇，沉淀、离心分离出RNA，再经75%酒精洗涤，室温微干后，加入适当体积的RNase-free的水，充分溶解。所提RNA经 DNA 酶(Fermentas)处理。②反转录反应取培矮64s总RNA2 μ g进行反转录，加入0. 5 μ g/ μ L Oligo (dT) 1 μ L，加入去离子水补足到12 μ L，70°C保温5min后，依次加入5 X RT buffer 4 μ L，20U/ μ L RNase抑制剂 1 μ L，10mmol/L dNTP 2 μ L，37°C保温 5min 后加入 200U/ μ LM-MLV 反转录酶 1 μ L，反应终体积为20 μ L。42°C反应60min，70°C加热IOmin终止反应。
③PCR体外扩增根据GenBank搜索到的核苷酸序列设计该基因特异性PCR扩增引物OsXLS-F 5' -CTGAGAAGAGGGAGAATGGCGT-3‘，OsXLS-R,5' -CACCACAGCACAGCATCAGTTG-3‘。以上述培矮64s cDNA作为模板，采用保真性较高的LA Taq聚合酶(TaKaRa)进行PCR扩增。在灭菌的PCR管中建立如下反应体系GCXBuffer溶液25 μ 1，dNTPMixture 8 μ 1，LA Taq 聚合酶 0· 5 μ 1，OsLS-F (IOnmol) 2 μ 1，OsLS-R(IOnmol) 2 μ 1，培矮 64s cDNA 3. 5 μ 1，ddH20 9 μ 1，总反应体积50 μ 1.反应程序95°C预变性4min, PCR扩增94°C变性 30s，56°C退火40s，72°C延伸30s，35个循环，最后72°C延伸lOmin，反应结束后，电泳检测 PCR结果(图1)，扩增产物大小为263bp左右。④PCR产物的纯化电泳后，在紫外光照射下进行切胶回收，利用凝胶回收试剂盒(天根)回收目的基因片断。⑤DNA连接反应参照pMD18-T Vector (TaKaRa)说明书，按试剂盒要求建立连接反应体系 pMD18-TVector 0. 5 μ 1，Solution I 4. 5 μ 1，回收基因片断 2 μ 1，ddH20 3 μ 1，总反应体积 10 μ 1。16°C过夜连接。⑥连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(热激法)无菌条件下取5 μ 1连接产物加到感受态细胞中，轻轻混勻后冰浴30min。42°C热激90s，将离心管迅速转到冰浴中放置2-aiiin。加无抗生素的LB培养基800 μ 1，37°C摇床 (100-160rpm)，温和摇振Ih左右。取200 μ 1培养液涂于含抗生素50 μ g/ml的LB固体培养基上，在涂菌液之前首先加入X-Gal和IPTG涂勻，37°C倒置培养12_1他。⑦阳性克隆的筛选及鉴定1)阳性克隆的筛选培养基中长出许多的蓝色和白色菌斑，待菌斑长到合适大小时，用灭菌的芽签挑取几个白斑，分别于含有50 μ g/ml Amp的LB液体培养基中振荡培养12_1他。2)碱裂解法小量提取质粒DNA3) PCR鉴定和酶切鉴定鉴定分别采用PCR扩增和酶切鉴定。以上述克隆载体质粒为模板，进行PCR扩增 (引物是OsXLS-F和OsXLS-R)，鉴定所提质粒中是否含有目的基因片段(图2)。对克隆载体进行酶切(HindIII和Bamh I)，鉴定目的基因是否已经连入载体(图3)。选取鉴定出的阳性克隆，送交公司测定序列。测序结果表明目的片段的DNA序列为序列表中序列1，其中序列1的第16-177位为开放阅读框，编码序列表中序列2所示的蛋白，将该蛋白命名为 OsXLS，将蛋白OsXLS的编码基因命名为OsXLS。2、重组表达载体构建1)中间载体的构建将基因OsXLS从含OsXLS的pMD18_T Vector用HindIII和Bamh I酶切下来插入如图 5 所示 pJIT163(pGreen, http //www. ρ green, ac. uk/)的 HindIII 禾口 Bamh I 位点间， 构成中间载体。
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2)构建重组表达载体将步骤1)得到的中间载体用KpnI和BioI酶切，回收含Double 35S启动子和基因 OsXLS 的 DNA 条带。将如图 4 所示的 pCAMBIA1300 (CambiaLabs, http//www. cambia. org/ daisy/bioforge_legacy/3725. html)用 KpnI 和 Sail 酶切，回收大片段。XhoI 和 SalI 是同尾酶，回收到的两个片段用T4连接酶连接过夜，构建成重组表达载体。3、转基因植物获得选用超级杂交稻的日本晴(公众可从中国科学院亚热带农业生态研究所获得；记载的文献梁永书等，籼粳交组合培矮64S/日本晴F2、F3及F6代主要农艺性状分析，植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008,25(1) :59-66)作为转化受体，通过植物组织培养技术，将上述重组表达载体采用农杆菌介导法转化到水稻愈伤，其后经共培养、在含潮霉素(50mg/L)的筛选培养基筛选抗性愈伤、分化、生根等一系列步骤，最终得到转基因水稻植株。CTAB法提取水稻叶片DNA，利用PCR技术鉴定阳性植株。我们根据表达载体上潮霉素基因序列设计特异性引物，对转基因植株进行PCR验证。pC13-F 5' -ACCTGCCTGAAACCGAACTG-3‘pC13-R 5' -CTGCTCCATACAAGCCAACC-3‘PCR扩增体系及程序如下IOXBuffer 溶液 5 μ 1，dNTP 4 μ 1, Tap DNA 聚合酶 0.5 μ 1， primer-F (IOpmol) 2 μ 1， primer-R (IOpmol) 2 μ 1,11 4 μ 1， ddH20 32. 5 μ 1,
50 μ 1。反应程序94°C预变性5min ；PCR扩增:94°C变性，40s ；57°C退火，40s ；72°C延伸， lmin，共35个循环，最后72°C延伸lOmin。电泳检测PCR结果(图6)，其中34个植株中有 28个转OsXLS阳性株系，取3株(分别命名为Τ-13、Τ46、Τ-34)进行下面的耐逆性检测。二、耐逆性检测本步骤设置空载体对照用KpnI和BioI酶切pJIT163，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果后回收含Double 35S启动子的DNA条带。将pCAMBIA1300用KpnI和SalI酶切，回收大片段。XhoI和SalI 是同尾酶，回收到的两个片段用T4连接酶连接过夜，构建成163-1300空载体。按照获得上述转OsXLS阳性株系的方法，将163-1300空载体转入日本晴中获得空载体对照。1、耐盐性检测1) 1-2叶期实验将阳性株系T-34、空载体对照分别进行如下实验在1-2叶期分别用0mM、50mM、 100mM、125mM、150mM不同浓度Nacl盐处理，在处理后的3天拍照观察。图7-1中A为不加盐处理的转空载体对照材料(WT)，B为IOOmM盐处理的转基因植株T-34，C为IOOmM盐处理的转空载体对照材料WT。结果如图7-1可知，盐处理的水稻(B、C)比未经处理的(A)生长明显滞后，而盐处理的材料中，转空载体对照材料WT(C)比转基因的植株T-34(B)生长均要滞后，并且由图 7-II可知，C的叶片明显发生卷曲。2) 3-4叶期实验
本步骤与上述1-2叶期实验的区别在于将盐处理时间改为在3-4叶期处理3天时间，其余步骤相同。在处理后的第3天和第10天分别进行拍照观察。由图8A(左图为T-34，右图为空载体对照)可知，IOOmM盐处理的第3天转基因植株的表现基本正常，转空载体对照材料(WT)大部分出现叶片卷曲的现象，由图8B(左图为 T-34，右图为空载体对照)可知，IOOmM盐处理的第10天转基因植株大部分存活(存活率 90%)，转空载体对照材料基本上死亡(存活率10%)。以上结果说明转OsXLS基因的植株耐盐性比空载体对照明显增强。2、耐旱性检测1)聚乙二醇(PEG)模拟干旱实验步骤将Τ-13、Τ46、Τ-34、空载体对照和野生型对照分别在3叶期进行10% PEG、15% PEG,25% PEG的干旱模拟处理。将3叶期的植株放在盛有不同浓度PEG的的塑料杯中，在第3天，第7天和第10天分别观察表型变化。由图9A可知，10% PEG处理的第3天大部分材料均出现叶片变黄、卷曲的现象，转 OsXLS基因植株、转空载体对照材料(WT)和野生型对照差异不明显。由图9B可知，10% PEG 处理的第10天转OsXLS基因植株T-13大部分恢复生长(存活率100% )，叶片展开颜色变绿。而转空载体对照材料(WT)全部死亡(存活率0% )。以上结果说明转基因的植株耐旱性比转空载体对照材料明显增强。2)缺水干旱实验实验步骤T-13、空载体对照在3-4叶期进行干旱处理，将植株用吸水纸吸干水分后置于干燥的培养皿进行干旱处理，使植株处于完全缺水的状态，记录表型变化，第4天复水，并观察表型差异。由图IOA可知，干旱处理的第3天，转空载体对照材料(WT)所有植株均出现叶片变黄、卷曲的现象，转基因植株Τ-13生长正常。第4天转基因植株Τ-13也出现叶片变黄、卷曲的现象，在此时给植株复水，观察其恢复情况。由图IOB可知，复水之后转基因植株Τ-13 大部分植株叶片展开、颜色变绿并恢复生长(存活率30%)。而转空载体对照材料(WT)全部死亡(存活率0%)。以上结果进一步说明转基因的植株耐旱性比转空载体对照材料(WT) 明显增强。
权利要求
1.一种培育耐逆转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示的蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐逆性强于所述目的植物的转基因植物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述序列表中序列2所示的蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1的第16-177位；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；3)在严格条件下与1)或幻的基因杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述序列表中序列2所示的蛋白的编码基因通过重组表达载体导入所述目的植物中的；所述重组表达载体的制备包括如下构建步骤将序列表中序列2所示的蛋白的编码基因插入质粒pJIT163的多克隆位点，得到的中间载体；将所述中间载体用KpnI和B10I酶切得到的含Double 35S启动子和所述编码基因的DNA片段与经KpnI和Mil酶切pCAMBIA1300得到的大片段连接，得到重组表达载体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述耐逆性是耐盐和/或耐旱。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述植物为双子叶植物或单子叶植物， 优选是水稻。
6.序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在培育耐逆转基因植物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述序列表中序列2所示的蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1的第16-177位；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；3)在严格条件下与1)或幻的基因杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述耐逆性是耐盐和/或耐旱。
9.如权利要求6-8中任一所述的应用，其特征在于所述植物为双子叶植物或单子叶植物，优选是水稻。
全文摘要
本发明公开了一种培育耐逆转基因植物的方法。该方法，是将序列表中序列2所示的蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐逆性强于所述目的植物的转基因植物。实验证明无论在在1-2叶期、还是在3-4叶期，转OsXLS基因的植株耐盐性比空载体对照和野生型对照明显增强；在耐旱性检测实验中，转OsXLS基因植株大部分植株叶片展开、颜色变绿。而转空载体对照材料和野生型对照基本上死亡，说明转基因的植株耐旱性比转空载体对照材料(WT)和野生型对照明显增强。
文档编号C12N15/63GK102443588SQ201010512359
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者夏新界, 李莉 申请人:中国科学院亚热带农业生态研究所, 湖南杂交水稻研究中心