专利名称：利用茉莉酸甲酯诱导雨生红球藻生产虾青素的方法
技术领域：
本发明提供一种利用茉莉酸甲酯诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，属于生物技 术领域。
背景技术：
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)被公认是目前自然界中天然虾青素含量 最高的生物，其积累量可高达细胞干重的4. 0%，是鲑鱼肉中的1000-4000倍，也远远高于 红发夫酵母(Phaffia rhodoxyma)发酵所生产的虾青素(0. 15% -0. 4% ) 0虾青素分子不 仅同其它类胡萝卜素一样具有很长的共轭双键，且在其共轭双键末端还具有不饱和的酮基 和羟基，而羟基和酮基又构成α-羟基酮，这种结构赋予了虾青素比一般类胡萝卜素更为 突出的生理功能，主要体现在以下两个方面第一，虾青素同其它类胡萝卜素一样具有抗氧 化活性，在生物体中表现为猝灭单线态氧，清除自由基，阻止脂质过氧化等功能，并且越来 越多的研究显示虾青素的抗氧化性显著强于胡萝卜素、玉米黄素、角黄质、维生素C和 维生素E ；第二，大量研究结果证明虾青素能显著提高动物的免疫能力，并且有预防癌症的 作用。因此，天然虾青素具有广泛的应用价值和巨大的市场潜力。目前，虾青素主要用作鱼 类(鲑鱼、鲟鱼、虹鳟鱼、真鲷等)和虾、蟹等甲壳类动物及家禽的饲料添加剂。此外，随着 虾青素生物功能研究的日益深入和药理药效试验的逐步完善，天然虾青素已被批准为安全 的人类食品添加剂，以用于食品的着色、保鲜及营养，并有开发成药物的趋势。过去关于刺激雨生红球藻积累虾青素的诱导因子研究大多集中在物理因子和化 学因子上，很少有研究涉及植物激素。同上述诱导因子相比较，植物激素具有用量小、效益 高、残毒少等优势。为一种抗逆激素，茉莉酸甲酯(JA)对植物生长发育和逆境条件下的抗 性起着重要调节作用，而雨生红球藻正是在逆境胁迫条件下才能大量积累虾青素。外源茉 莉酸甲酯能够激发植物防御基因的表达，诱导植物的化学防御，产生与机械损伤和昆虫取 食相似的效果。因此茉莉酸甲酯可能会诱导雨生红球藻大量积累虾青素。目前，国内市场上已经有一些生产虾青素的相关专利技术，如中山大学的“光生物 反应器促进雨生红球藻生长增殖及调控虾青素合成和积累的方法”(CN02134387. X)，涉及 几种可调控的全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器培养和促进雨生红球藻生长增 殖及提高种群密度和调控细胞内次生代谢产物虾青素合成和积累的方法。宁波大学的“大 规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法”(200610154678.0)公开了一种大规 模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及方法，整个培养装置由设置在固定架上的光生物 反应器系统、充气装置、培养液灌输装置和静细胞收集装置组成，固定架上设置浮沉控制装 置；“从甲壳质、壳聚糖生产废水中回收虾青素和蛋白质的方法”(CN200510047267. 7)，主 要是从甲壳质、壳聚糖生产废水中回收虾青素，虽然能变废为宝，但是虾青素的提取效率较 低。“一种培养雨生红球藻生产虾青素的方法(CN02138827.X)公开了一种培养雨生红球藻 生产虾青素的方法，包括培养基配方、一步法生产工艺、培养基的循环使用和用二氧化碳调 节培养液PH值诱导红球藻孢子的形成及虾青素积累的方法。“产虾青素的藻类和酵母混合培养发酵生产虾青素的方法”(CN03105314. 9)，公开了一种产虾青素的藻类和酵母混合培 养发酵生产虾青素的方法，属于生物法生产虾青素技术。该方法是在装有特定培养基的反 应器内，同时接种包括雨生红球藻在内的藻类和包括红发夫酵母在内的酵母进行混合培养 发酵生产虾青素。上述相关专利技术虽然先进，但均涉及光生物反应器等专业设施，对设备 要求比较高，技术工艺比较复杂，操作有难度，而且费用很高，这无疑增加了生产成本和技 术推广的难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够克服现有技术中存在的缺陷，技术工艺简单易行、 廉价高效且能显著提高雨生红球藻生产虾青素效率的利用茉莉酸甲酯诱导雨生红球藻生 产虾青素的方法。其具体的技术方案为一种利用茉莉酸甲酯诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于采用如下步 骤(1)制备藻液培养雨生红球藻细胞到对数生长期，获得诱导培养的藻液；(2)积累虾青素将质量浓度为95%的茉莉酸甲酯原液添加到上述已培养好的 藻液中至茉莉酸甲酯终浓度为4. 95 5. 05mg/L ；然后将上述添加了茉莉酸甲酯的藻液在 25 28°C、光强4500 50001χ、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培 养，直至光学显微镜下观察到雨生红球藻细胞完全变红，此时虾青素产量达到最高。所述的利用茉莉酸甲酯诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，步骤(1)中，雨生红 球藻采用712藻株，采用MCM培养基，在温度19 21 °C，光强1500 18001x，光暗比为 12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至培雨生红球藻细胞达到对数生长期，此时细胞浓度 达 IO8 个 /mL。所述的利用茉莉酸甲酯诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，茉莉酸甲酯采用 SIGMA公司生产的茉莉酸甲酯。本发明与现有技术相比，其优点是1、本发明简单易行、成本低廉，原材料雨生红球藻细胞可以按常规方法自行培养。2、本发明能大幅提高雨生红球藻中虾青素的积累效率，实验证明，添加4. 95 5. 05mg/L茉莉酸甲酯处理组比空白对照组雨生红球藻细胞完成虾青素积累的周期缩短了 45. 5 50. 0%，虾青素产量比对照提高了 57. 1 58. 9%，达18. 76 18. 97mg/L藻液。
具体实施例方式实施例1 步骤1、制备藻液雨生红球藻选用712藻株，采用MCM培养基，在温度19 °C、 15001x光强、光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数 生长期，细胞浓度达IO8个/mL，即获得诱导培养的藻液；步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素茉莉酸甲酯采用SIGMA公司生产的茉莉酸甲 酯。将质量百分浓度为95%的茉莉酸甲酯原液添加到上述已培养好的藻液中至茉莉酸甲酯 浓度为4. 95mg/L ；然后将上述添加了茉莉酸甲酯的藻液与空白对照组藻液同时在25°C、光 强45001x、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，24天后雨生红球藻细胞完全变红，即完成虾青素积累，此时虾青素含量达到最高。实施例2:步骤1、制备藻液雨生红球藻选用712藻株，采用MCM培养基，在温度20°C、光强 18001x、光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数生长 期，细胞浓度达IO8个/mL，即获得诱导培养的藻液；步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素茉莉酸甲酯采用SIGMA公司生产的茉莉酸甲 酯。将质量百分浓度为95%的茉莉酸甲酯原液添加到上述已培养好的藻液中至茉莉酸甲酯 浓度为5. Omg/L ；然后将上述添加了茉莉酸甲酯的藻液与空白对照组藻液同时在26°C、光 强48001x、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，23天后雨生红球藻 细胞完全变红，即完成虾青素积累，此时虾青素含量达到最高。实施例3 步骤1、制备藻液雨生红球藻选用712藻株，采用MCM培养基，在温度21°C、光强 16001x、光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数生长 期，细胞浓度达IO8个/mL，即获得诱导培养的藻液；步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素茉莉酸甲酯采用SIGMA公司生产的茉莉酸甲 酯。将质量百分浓度为95%的茉莉酸甲酯原液添加到上述已培养好的藻液中至茉莉酸甲酯 浓度为5. 05mg/L ；然后将上述添加了茉莉酸甲酯的藻液与空白对照组藻液同时在28°C、光 强50001χ、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，22天后雨生红球藻 细胞完全变红，即完成虾青素积累，此时虾青素含量达到最高。采用以下方法对本发明中含有茉莉酸甲酯的藻液及空白对照组藻液定期进行显 微观察，具体是每天取少量藻液样品在光学显微镜下观察藻细胞的颜色变化以及虾青素积 累情况；然后按以下步骤对本发明含有茉莉酸甲酯的藻液及空白对照组藻液中的虾青素含 量进行测定①每三天各取出3ml上述两种藻液，5000r/min离心5min，弃上清得到藻细胞 沉淀；②分别向两种藻细胞沉淀加入5% KOH和30%甲醇破坏叶绿素5min后，5000r/min离 心收集沉淀；③在收集的沉淀中分别加入3ml 二甲亚砜，利用超声波破壁后(3次15sec破 壁/5sec间歇，输出功率40W)，于70°C水浴中处理lOmin，抽提至藻体发白；④然后IOOOOr/ min离心lOmin，分别取上清于490nm下测定OD值；⑤按公式C(mg/L) = (4. 5A X 490 X Va)/ Vb计算两种上清中的虾青素含量，其中A表示OD值，Va表示二甲亚砜的体积，Vb表示藻液 体积。结果表明空白对照组雨生红球藻细胞完全变红的时间为44天，此时虾青素含量 为11. 94mg/L藻液，茉莉酸甲酯处理组的藻细胞比空白对照组完全变红的周期缩短45. 5 50. 0%，虾青素产量比对照提高了 57. 1 58. 9%，达18. 76 18. 97mg/L藻液。
权利要求
一种利用茉莉酸甲酯诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于采用如下步骤(1)制备藻液培养雨生红球藻细胞到对数生长期，获得诱导培养的藻液；(2)积累虾青素将质量浓度为95％的茉莉酸甲酯原液添加到上述已经培养好的藻液中至茉莉酸甲酯终浓度为4.95～5.05mg/L；然后将上述添加了茉莉酸甲酯的藻液.在25～28℃、光强4500～5000lx、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，直至光学显微镜下观察到雨生红球藻细胞完全变红，此时虾青素产量达到最高。
2.根据权利要求1所述的利用茉莉酸甲酯诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特 征在于步骤⑴中，雨生红球藻采用712藻株，采用MCM培养基，在温度19 21°C，光强 1500 18001x，光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至培雨生红球藻细胞达到 对数生长期，此时细胞浓度达IO8个/mL。
3.根据权利要求1所述的利用茉莉酸甲酯诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征 在于茉莉酸甲酯采用SIGMA公司生产的茉莉酸甲酯。
全文摘要
本发明提供一种利用茉莉酸甲酯诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，采用如下步骤(1)培养雨生红球藻细胞到对数生长期，获得诱导培养的藻液；(2)积累虾青素将质量浓度为95％的茉莉酸甲酯原液添加到上述已培养好的藻液中至茉莉酸甲酯终浓度为4.95～5.05mg/L；然后将上述添加了茉莉酸甲酯的藻液在25～28℃、光强4500～5000lx、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，直至光学显微镜下观察到雨生红球藻细胞完全变红，即完成虾青素积累，此时虾青素产量达到最高。本发明简单易行，成本低廉，能大幅缩短雨生红球藻细胞完全变红的时间，并显著增加虾青素产量，从而大大提高雨生红球藻生产虾青素的效率。
文档编号C12R1/89GK101974600SQ201010505970
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者叶乃好, 孟春晓, 王依涛, 罗韬, 高政权, 高瑞照 申请人:山东理工大学