专利名称：一种芝麻枯萎病菌的分离和纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种从干燥芝麻枯萎病株材料中分离和纯化枯萎病菌的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
芝麻枯萎病是一种芝麻维管束病害，其病原枯萎病菌(镰刀菌)是一种根部侵染真菌。目前关于芝麻枯萎病菌分离多采用活体根部、茎杆切段直接进行分离，由于木质部、 韧皮部等非维管束杂菌存在，给枯萎病菌的分离造成很大的困难。枯萎病菌的纯化多是在菌落边缘挑取菌块再次接种纯化方式，或在显微镜的帮助下，进行单孢分离操作，如此，不容易得到完全纯化的枯萎病菌菌株且操作困难、繁琐、效率低。目前急需探讨一种既能有效解决杂菌污染、提高菌落纯化效率，又能确保得到可靠芝麻枯萎病原菌的方法，为芝麻枯萎病菌的研究和开发奠定基础。
发明内容
本发明目的在于提供一种高效无杂菌污染的芝麻枯萎病菌的分离和纯化方法。为实现本发明目的，采取如下技术方案1、枯萎病菌的分离1)收集芝麻枯萎病病株在阴凉处干燥感染了枯萎病的芝麻茎杆；2)将接近枯萎病芝麻杆根部的茎杆切成2-3cm小段，用70%质量百分比酒精对其表面消毒1分钟，用无菌水冲洗3-4次；3)用无菌切割刀把茎杆小段从中部纵切成两半，使髓部维管束组织显露出来；4)用镊子镊取中央维管束组织，放于含有100 μ g/ml链霉素的PDA平板上；5)含有维管束组织PDA平板25°C下培养7 后，有真菌菌落出现，即分离得到无杂菌污染的枯萎病菌菌株。以上2)、3)和4)步骤均在超净工作台上作业。2、枯萎病菌的单孢分离纯化技术1)分离菌株转接到另一含有100 μ g/ml链霉素的PDA平板上，后，根据菌落颜色白色、紫红色、蓝色和具有大、小两种分生孢子等生物学特性，初步鉴定病原为芝麻枯萎病菌(镰刀菌)；2)经病原初步鉴定为枯萎病菌后，在PDA平板接种处切取一 0. 4X0. 8cm PDA菌块，放置于1.5ml离心管中；3)加800 μ 1无菌水于离心管中，剧烈振荡lmin，使菌块上的分生孢子充分释放于水中，制备成分生孢子悬浮液；4)吸取分生孢子悬浮液15 μ 1，用血球计数器测量分生孢子浓度；5)取出离心管中PDA菌块并把孢子悬浮液配制成浓度为100-1000个/ml的分生孢子悬浮液；
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6)吸取100 μ 1分生孢子悬浮液均勻涂布于PDA平板上；7) 250C下平板培养60h后，生长出多个单孢菌落，挑选部分单孢菌落于PDA试管斜面或另一 PDA平板上，用于保存、研究，即完成芝麻枯萎病菌的单孢分离纯化。该分离方法利用病原引起维管束病害，茎杆干燥时维管束组织与木质部容易分离，直接挑取维管束组织进行分离，病株外围木质部等作为天然屏障隔离其它非枯萎病菌， 减少茎杆表面、韧皮部和木质部非致病性镰刀菌等杂菌污染；且这种分离菌落从已经有明显症状的芝麻茎杆维管束组织中获得，保证了该菌接种芝麻的高发病率和该病原即为芝麻枯萎病菌。本发明优点在于本发明既有效地解决了杂菌污染，提高了菌落纯化率，又确保得到了可靠的芝麻枯萎病原菌，是芝麻枯萎病菌研究中的一项重要成果。采用该方法在比较忙碌的生产季节，可以在不同时间、地区采集芝麻枯萎病病株，经统一干燥、分离、纯化，提高了工作效率；在菌落纯化过程中，采用小PDA菌块制备一定浓度分生孢子悬浮液并涂平板培养，能够简单、快速挑取单孢菌落，避免了纯化不彻底和通过显微观察挑取菌落的低效性。该方法高效、准确地分离和纯化出芝麻枯萎病菌，同时也适用于其它植物维管束病害引起的枯萎病菌分离及其纯化。
图1是接近枯萎病芝麻杆根部茎杆2-3cm的茎段；图2是枯萎病芝麻杆根部茎杆中部纵切后的维管束组织；图3是镊取用于枯萎病芝麻杆根部茎杆病原分离的维管束组织；图4是本发明枯萎病芝麻杆根部茎杆病原分离的维管束组织在PDA培养基上接种 96h后菌落；图5是在显微镜下观察到的本发明分离纯化的大、小两种分生孢子；图6是本发明100 μ 1浓度为100个/ml分生孢子悬浮液涂板后60h所产生的单孢分离菌落；图7是本发明100 μ 1浓度为1000个/ml分生孢子悬浮液涂板后60h所产生的单
孢分离菌落。
具体实施例方式为对本发明进行更好的说明，举实例如下实施例1. 09F0-027芝麻枯萎病菌的分离及其纯化方法1)收集芝麻枯萎病病株取在阴凉处充分干燥保存3个月的枯萎病芝麻茎杆，用无菌水冲洗其表面的灰尘杂质；2)将接近枯萎病芝麻杆根部的茎杆切成2-3cm小段，用70%质量百分比酒精对其表面消毒1分钟，用无菌水冲洗3-4次；见附图1。3)用无菌切割刀把茎杆小段从中部纵切(如附图2)成两半，使髓部维管束组织显露出来；4)用镊子轻轻镊取中央维管束组织(如附图3)，放于含有100 μ g/ml链霉素的 PDA平板上；
5)含有维管束组织PDA平板25°C下7 后有真菌菌落出现，即分离得到无杂菌污染的枯萎病菌。以上2)、3)和4)步骤均在超净工作台上作业。6)分离菌株转接到新的含有100 μ g/ml链霉素的PDA平板上，后，根据菌落表面白色，接种中心底面白色中略带有红色，具有大、小两种分生孢子等生物学特性，确定病原为枯萎病菌09F0-027菌株，(如附图4)；7)在PDA平板接种处切取一 0. 4X0. 8cm PDA菌块，放置于1. 5ml离心管中；8)加800 μ 1无菌水于离心管中，剧烈振荡lmin，使菌块上的分生孢子充分释放于水中，制备成分生孢子悬浮液；9)吸取分生孢子悬浮液15 μ 1，用血球计数器测量分生孢子浓度； 10)把上述分生孢子悬浮液配制成浓度为100-1000分生孢子/ml的分生孢子悬浮液，混勻；11)吸取100 μ 1浓度为1000个/ml分生孢子悬浮液均勻涂布于PDA平板；12)平板放置于25°C培养60h后，生长出多个单孢菌落，挑选部分单孢菌落于PDA 试管斜面或新的PDA平板上，用于保存、研究。即完成芝麻枯萎病菌的单孢分离纯化。就得到09F0-027芝麻枯萎病菌单孢菌落， (如附图7)。
权利要求
1. 一种芝麻枯萎病菌的分离和纯化方法，其特征在于，通过以下步骤实现A、枯萎病菌的分离1)收集芝麻枯萎病病株在阴凉处干燥感染了的枯萎病芝麻茎杆；2)将接近枯萎病芝麻杆根部的茎杆切成2-3cm小段，用70%质量百分比酒精对其表面消毒1分钟，用无菌水冲洗3-4次；3)用无菌切割刀把茎杆小段从中部纵切成两半，使髓部维管束组织显露出来；4)用镊子镊取中央维管束组织，放于含有100μg/ml链霉素的PDA平板上；5)含有维管束组织PDA平板25°C下培养7 后，有真菌菌落出现，即分离得到无杂菌污染的枯萎病菌菌株；以上2)、3)和4)步骤均在超净工作台上作业；B、枯萎病菌的单孢分离纯化1)将上述步骤分离得到的菌株转接到另一含有100μ g/ml链霉素的PDA平板上，邪h 后，得到芝麻枯萎病菌；2)在PDA平板接种处切取一0.4X0. 8cm PDA菌块，放置于离心管中；3)加无菌水于离心管中，剧烈振荡，使菌块上的分生孢子充分释放于水中，制备成分生孢子悬浮液；4)吸取分生孢子悬浮液，用血球计数器测量分生孢子浓度；5)把孢子悬浮液配制成浓度为100-1000个/ml的分生孢子悬浮液；6)吸取100μ 1分生孢子悬浮液均勻涂布于PDA平板上；7)250C下平板培养60h后，生长出多个单孢菌落，挑选部分单孢菌落于PDA试管斜面或另一 PDA平板上，即完成芝麻枯萎病菌的单孢分离纯化。
全文摘要
本发明公开了一种芝麻枯萎病菌的分离和纯化方法，属于生物技术领域。该方法采用无杂菌污染分离技术及单孢分离纯化技术，分离到无杂菌污染的芝麻枯萎病菌(镰刀菌)。本发明既有效地解决了杂菌污染，提高了菌落纯化率，又确保得到了可靠的芝麻枯萎病原菌。采用该方法在比较忙碌的生产季节，可以在不同时间、地区采集芝麻枯萎病病株，经统一干燥、分离、纯化，提高了工作效率；在菌落纯化过程中，采用小PDA菌块制备一定浓度分生孢子悬浮液并涂平板培养，能够简单、快速挑取单孢菌落，避免了纯化不彻底和通过显微观察挑取菌落的低效性。该方法高效、准确地分离和纯化出芝麻枯萎病菌，同时也适用于其它植物维管束病害引起的枯萎病菌分离及其纯化。
文档编号C12N1/14GK102443544SQ20101050595
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者张海洋, 杜华, 梁慎, 苏银玲, 苗红梅, 魏利斌 申请人:河南省农业科学院