真菌抗性植物和它们的用途的利记博彩app

专利名称：真菌抗性植物和它们的用途的利记博彩app
真菌抗性植物和它们的用途本申请是申请日为2004年8月3日、发明名称为“真菌抗性植物和它们的用途”的 中国专利申请 200480022723. 6 (PCT/EP2004/008683)的分案申请。本发明涉及增加植物，尤其茄科(Solanaceae)植物，优选马铃薯和番茄对卵菌 (Oomycetes)门的植物病原体的抗性的新方法，所述方法包括增加本发明多肽的活性。本发 明还涉及多核苷酸和包含这些多核苷酸的载体。本发明还涉及相应的载体、细胞、转基因植 物和来自它们的转基因繁殖材料，涉及产生它们的方法，还涉及它们用于生产粮食、饲料、 种子、药物或者精细化学品的用途。植物生物技术工作的目的是产生具有有益的新性质的植物，例如，用于增加农 业生产力，增加粮食质量，或者产生特定化学品或者药物(Dimwell JM(2000)J Exp Bot 51Spec No:487-96)。植物对于病原体的天然防御机制通常是不足的。仅真菌病就导致每 年几亿美元的产量损失。导入来自植物、动物或者微生物来源的外来基因可以增加防御。实 例是通过表达处于35SCaMV启动子控制下的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) 内毒素保护烟草免于昆虫的摄食损害(Vaeck等人(1987)NatUre 328 :33_37)或者通过 表达处于CaMV启动子控制下的豆几丁质酶保护烟草免于真菌感染(Broglie等人(1991) Science 254:1194-1197)。然而，所描述的多数方法仅仅提供了对一种病原体或者窄范围 病原体的抗性。尽管19世纪中叶众所周知的爱尔兰马铃薯饥荒，晚疫仍然是农作物植物中所有 疾病最具破坏性的疾病之一。晚疫由卵菌真菌致病疫霉(Phytophthora infestans)导致， 致病疫霉是一种特化病原体，其主要在许多茄科物种，尤其马铃薯和番茄的叶子和果实上 导致疾病。首次在墨西哥观察到该真菌，由于几种原因，认为墨西哥是该真菌的起源中心。 在例如Toluca地区提取永久存在两种交配型Al和A2。而且，有报导在墨西哥的偏远地区 的当地茄属物种上存在致病疫霉。此外，在墨西哥发现具有块茎茄属的许多种具有对晚疫 的高水平抗性。预防农作物死亡或者产量减小的主流措施意味着应用杀真菌剂防止或者治 疗致病疫霉导致的感染。代替化学杀虫剂的大量使用用于控制晚疫的备选方法是有益的 使用栽培种，其具有对晚疫的部分或者完全抗性。为了得到晚疫抗性，培育者在过去专注于 来自墨西哥本地一种野生马铃薯种Solanum demissum的显性R基因的渐渗现象。已经鉴 定了 11种此类基因，它们的一些已经定位到马铃薯的遗传学图的特定基因座(Gebhardt和 Valkonen, 2001中综述)并且最近已经克隆了 Rl基因。Rl和R2分别位于5号和4号染色体。 R3、R6和R7位于11号染色体上。赋予对晚疫的品种特异抗性的未知R基因也已经在马铃薯 andigena 亚禾中(S. tuberosum ssp. andigena)禾口 S. berthaultii 与 S. pinnatisectum 中描 述。在任何情况下，这些R基因诱导的抗性(几乎)是完全的但是似乎不能持久。因为高水 平抗性和容易转移，所以许多栽培种含有S. demissum衍生的抗性。不幸的是，S. demissum 衍生的品种特异抗性尽管几乎是完全的，但是不是持久的。一旦在商业田间中以大规模生 长新近培育的马铃薯栽培种，就出现致病疫霉的新毒性，其使得该病原体能够克服渐渗的 抗性。在一些墨西哥和中南美洲茄属种中可以发现对晚疫的更持久的田间抗性，其通常可 以在本质上定量并且认为是品种非特异的。然而，通过杂交和表型选择通常难以将该类型的抗性转移到马铃薯栽培种中。来自墨西哥和危地马拉的二倍体S. bulbocastanum是一种具有块茎的物种，很久 以来就知道它对晚疫具有高水平抗性。不幸的是，由于倍性和胚乳平衡数(EBN)中的困难， 通常不能实施将抗性从茄属物种转移到培育的马铃薯的经典转移。尽管有这些困难，但是 S. bulbocastanum抗性性状的渐渗已经取得了成功。最近，发现S. bulbocastanum和马铃 薯的体细胞杂种和回交的种质即使在极大的疾病压力下也对晚疫是高度抗性的(Helgeson 等人，1998)。尽管有重组抑制的报导，但是回交材料中的抗性似乎在8号染色体内RFLP标 记CP53和CT64之间的约6cM间隔上。来自番茄RFLP探针CT88的CAPS标记与抗性共分 罔。因此，近年来，对卵菌门病原体抗性植物的开发稳步前进。然而，对可用的种质的 40年的深入和持续的研究和育种工作仍然没有导致在市场上引入抗性栽培种。近年来鉴定 的多数基因仅仅是品种特异抗性。此外，所实现的抗性不是持久的。此外，普遍认为植物保 护剂的应用造成环境负担。从而，在一些西方国家，法律变得更严格并且部分禁止应用特定 杀真菌剂，使得疾病的化学控制更加困难。此外，化学控制是昂贵的。最后，另一个限制是 世界上许多国家已经报导真菌产生了对特定杀真菌剂如甲霜灵的抗性。因此，本发明的根 本问题是提供有效保护植物免于晚疫和相关疾病的新手段和方法。通过提供权利要求中表征的实施方案解决了技术问题。因此，本发明涉及产生或者增加植物对卵菌门植物病原体的抗性的方法，其包括 增加植物或植物或其部分中组织、器官或细胞中Rpi_blb2蛋白质的活性。Rpi-blb2是LZ-NBS-LRR型R基因并且显示出与赋予对三种根结线虫 (Meloidogyne spp.)的抗性的番茄基因Mi-I以及与马铃薯蚜虫马铃薯长管蚜 (Macrosiphum euphorbiae) (Vos 等人，1998 ；Rossi 等人，1998 ；MiIligan 等人，1998)和与 粉虱(烟粉虱(Bemisia tabaci)) (Nombela等人，2003)的B-和Q-生物型的序列同源性。 如对于Rpi-blb所发现的，Rpi_blb2也赋予对携带多种毒性因子的一系列致病疫霉分离物 的完全抗性，并且还没有表现出品种特异性。术语“Rpi_blb2”指编码具有本文提到的Rpi_blb2蛋白质活性的多肽的多核苷酸 或者具有所述Rpi_blb2蛋白质活性的多肽。下文中术语“Rpi_blb2”涉及多肽还是多核苷 酸可以从其使用的上下文中明确。术语“产生”或“增加”或“刺激” “植物的抗性”指与参照相比，增加或产生或刺激 了植物或其部分的抗性。“赋予”、“现有”、“产生”、“刺激”或“增加”病原体抗性指在相同条件(例如，气候 条件、生长条件、病原体种类等等)下，与没有应用根据本发明方法的野生型植物相比，由 于应用了根据本发明的方法，特定植物种或者变种的防御机制对一种或多种病原体的抗性 增加。增加的抗性优选表现在疾病症状表现的减小，疾病症状除了包括上面提到的不利效 果外还包括例如病原体进入植物或者植物细胞的穿透效率或者病原体在植物或植物细胞 内部或者上面的繁殖效率。在该上下文中，疾病症状优选减小至少10%或至少20%，尤其 优选至少40 %或60 %，非常特别优选至少70 %或80 %，最优选至少90 %或95 %。术语“增加的”在此指基因产物活性比参照中的活性高。从而，术语“增加的”包 括如果在参照中没有发现活性(例如，本文描述的Rpi_blb2活性)，那么从头产生的该活性(例如，Rpi_blb2基因产物或者另一种基因产物的活性)。术语“增加的”还涉及基因产物 活性的刺激。可以以多种方法刺激基因的增加的表达，即它的活性，所述方法为例如对生物 应用化学品或者通过生物应激。例如，通过用寄生虫，例如，用致病疫霉感染可以激活针对 感染性寄生虫介导基因的抗性并且该抗性赋予对相同和/或其他病原体的增加的抗性。从而，在下文中，术语“增加”还包括术语“刺激”和“产生”。“病原体抗性”表示病原体感染后植物的疾病症状的减轻或者减弱。症状可以是多 样的，但是优选包括对植物的质量、产量、用作饲料或粮食的适宜性直接或间接具有不利影 响，或者使得播种、种植、收获或加工农作物困难的那些症状。在本发明范围内“病原体”作为实例但不作为限制指病毒或者类病毒、细菌、真菌、 动物害虫，如昆虫或者线虫。术语“Rpi_blb2”蛋白质涉及蛋白质或多肽，其在植物或植物部分中的表达与非抗 性株系相比赋予该植物或植物部分对本文描述的病原体的抗性。与具有相同遗传背景但是没有允许Rpi_blb2的表达必需的遗传元件的植物或者 其部分(本文称作“野生型”或者“参照”)相比，包含Rpi_blb2蛋白质的增加的活性的植 物或植物组织、或者细胞或者植物部分对于病原体，尤其卵菌门病原体，优选对于致病疫霉 的敏感性较低。测试植物或者其部分的抗性的测定法是本领域技术人员熟知的。对致病疫 霉的抗性可以定义为根据Flier，2001的孢子形成指数。Flier将孢子形成指数描述为每 Icm2孢子形成水平。从而，与野生型相比每Icm2孢子形成的20%减少在本文定义为抗性。 在阐明本发明的实施例中，孢子形成指数定义为每个病灶孢子形成的水平。从而，术语“抗 性”可以备选地指与野生型相比每个病灶孢子形成减少20%。优选后一定义。在优选实施方案中，在测定中孢子形成减少30 %，更优选减少50 %，甚至更优选 减少70%，更优选减少80%以上，更优选减少85%和90%。最优选减少95%或以上。因此，在本发明中，Rpi_blb2蛋白质的“活性”指蛋白质表达赋予孢子形成指数的 所述减少。此外，观察到含有Rpi_blb2的植物对致病疫霉感染的典型应答是在生长期结束 时存在小病灶，没有明显的孢子形成。从而，在一个实施方案中，Rpi_blb2的活性定义为在 所描述的实验中存在没有任何明显孢子形成的小病灶。Rpi_blb2抗性表现出坏死区域，其 含有低水平孢子形成。用离脱叶进行的实验例证了 Rpi_blb2的活性。该实验在实施例17 和

图18中描述。Rpi_blb2和其他致病疫霉抗性基因之间的差异是Rpi-blb2允许低水平孢 子形成(图18)。在其中Rpi-blb2基因型(ARD92-1197-16)上存在病灶的离脱叶测定显示 了低水平孢子囊，而含有S. demissum基因R2的基因型上完全没有孢子囊。孢子形成指数 为敏感表型(cv. Bintje)的仅1. 1%。田间实验也表明Rpi_blb2允许低水平感染。在生长期期间(图3，ARF87_801)或 者生长期结束时(图2，ARF87-601 ；图3，ARF87-507和ARF87-601)产生晚疫症状。从而，在一个实施方案中，Rpi_blb2的活性还定义为在植物中表达后导致坏死区 中含有如所述实验中描述的低水平孢子形成。从而，在一个实施方案中，本发明的方法产生显示出含有低水平孢子形成或更低 水平孢子形成的坏死区的植物。术语“参照”涉及生物或者其部分，例如，细胞，所述生物或者其部分在基因组、蛋 白质组和/或代谢组与相关生物或者其部分，例如细胞，例如，与本发明的植物基本相同。
从而，术语“参照”涉及例如生物或者其部分，例如，细胞，所述生物或者其部 分在遗传、蛋白质组和/或代谢上与本发明的生物或者其部分基本相同，但是由于在参 照的基因组、蛋白质组或者代谢组中存在相关差异，不能观察到它的特定基因产物(例 如，Rpi-blb2)的活性。从而，参照可以是不表达或者表达很少相关活性基因产物的植 物或者其部分，例如，它不编码Rpi_blb2或者不转录Rpi-blb2编码基因或者不翻译活 性Rpi-blb2mRNA。从而，参照不提供产生足量活性基因产物而导致所述表型的修饰。两 种植物是否基本上在遗传上相同可以用本领域技术人员已知的测定法测试，例如，如用 Roldan-Ruiz, Theor. Appl. Genet.，2001，1138-1150 描述的指纹分析测试。可以如本领 域描述的测试蛋白质的表达模式，例如，用通过凝胶电泳(一维、二维、三维)、质谱分析 禾口例如，在 www. waters, com，www. proteine. org. au，www. proteomesci. com，www. sdu. dk/ Nat/CPA中描述的其他方法进行。技术人员按照本领域描述的可以分析代谢组，例如，通过 HPLC, GC、OPLC, LC-MS, GC-MS, LC-MS-MS 和例如，在 www. metabolic-explorer, com, www. ki. se/icsb2002/pdf/ICSB_209. pdf, www. genomics, rug. nl/technologies, htm, Fiehn 等 人，Nature Biotech, 18(2000)，1157，Raamsdonk 等人，Nature Biotech, 19 (2991)，45-50， Buchholz，Anal. Biochem，295 (2001) 129-137，Soga等人，Anal Chem. 74 (2002) 2233-2239 中 描述的其他方法实施所述分析。为了增加对病原体的抗性，参照生物或者其部分对于病原体，例如植物病原体，例 如，致病疫霉的感染是敏感的。优选地，参照是生物的克隆，该克隆中例如，已经导入相关多核苷酸，例如，本发明 的多核苷酸，或者激活剂，例如，介导活性的相关基因产物的激活剂，例如，增加相关多核苷 酸或者所述多核苷酸衍生物的表达的激活剂，或者相关多肽，例如本发明多肽的激活剂，和 /或相应的相关基因产物编码载体。例如，本发明方法中的优选参照是生物或者其部分，其 是生物的克隆或者其部分，例如，细胞，所述克隆或者其部分已经用本发明的多核苷酸或者 载体转染或者转化。如果不能鉴定所述克隆，本领域技术水平是切除或者敲除或者关闭基本上介导相 关活性的那些元件，所述相关活性为例如介导增加的Rpi_blb2活性，例如，介导生物，例如 植物中增加的表达。本领域技术人员公知怎样减小或者抑制相关基因产物的活性，例如通 过减小或者抑制例如Rpi_blb2的表达。然后此类克隆可以与根据本发明的方法产生的生 物，例如，与致病疫霉抗性、表达Rpi-blb2的基因型生物比较。本文所用的术语“植物”指植物界的高等和低等植物的所有属和种。该术语包括 成熟植物、种子、芽和幼苗和它们的衍生部分、繁殖材料、植物器官、组织、原生质体、愈伤组 织和其他培养物，例如，细胞培养物，和给予功能或结构单位的任意其他类型的植物细胞分 组。“成熟植物”指幼苗之外的任意希望的发育阶段的植物。幼苗指在早期发育阶段的幼小 的不成熟植物。“植物”包括所有一年生和多年生单子叶植物和双子叶植物。本发明范围 内优选为用作粮食或者饲料的那些植物，例如，单子叶或者双子叶属，尤其种，像上述种，例 如，分别谷类种或者茄科的成员，最优选马铃薯和番茄。如本领域技术人员已知的，本发明的方法还包括选择那些植物，在所述植物中与 参照植物相反或相比，对至少一种所述病原体的抗性已经存在或者增加。关于其中与参照植物相反或相比，对至少一种所述病原体的抗性已经存在或者增加的植物的“选择”指适于识别针对病原体的现有或者增加的抗性的所有那些方法。这些 可以是病原体感染的症状，但是也可以包括本文描述的症状，其涉及植物的质量、产量、用 作饲料或者粮食的适宜性等等。因此，在本发明方法的一个实施方案中，Rpi_blb2蛋白质由包含核酸分子的多核 苷酸编码，所述核酸分子选自a)编码SEQ ID NO 2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；b)核酸分子，其包含编码所述多肽的至少成熟形式的如SEQ IDNO :1或3，或5或 6中描绘的编码序列；c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遗传密码简并产生；d)核酸分子，其编码的多肽通过从(a)到(C)的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序 列的一个或几个氨基酸的替代、缺失和/或加入从(a)到(c)的多核苷酸编码的多肽衍生；e)核酸分子，其编码的多肽的序列与(a)或(b)的核酸分子编码的多肽的氨基酸 序列具有70%或以上的同一性；f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一项的核酸分子编码的多肽的片段或者具有表 位的部分；g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物，尤其ARFlF和ARFlR从 核酸文库扩增的核酸分子的序列；h)核酸分子，其编码(a)到(g)任一项编码的多肽的以氨基酸1、30、50、100、 200、300、500 或 1000 开始并以氨基酸 1276、1000、500、300、200、50、30、或 1 结束的片段；i)包含(a)或(d)任一项的多核苷酸的至少20个核苷酸的核酸分子；j)核酸分子，其编码的多肽被针对(a)到(h)任一项的核酸分子编码的多肽产生 的单克隆抗体识别；k)核酸分子，其可以通过用具有(a)到(j)任一项的核酸分子或者其至少15个， 优选30、60、100或更多核苷酸的片段的序列的探针在严格条件下筛选适宜文库得到；和1)核酸分子，其互补链在严格条件下与(a)或(k)任一项的核酸分子杂交；或者(a)到(1)任一项的互补链；或者表达Solanum bulbocastanum的连锁群6的区段编码的多肽，所述区段与选 自表3A的标记共分离，并且所述多肽介导对病原体，尤其选自卵菌门病原体的抗性。在一个实施方案中，本发明方法的多核苷酸不由Seq. ID NO. :7和/或9中描述的 序列组成和/或不由编码Seq. ID NO. :8和/或10中描述的蛋白质的核酸分子的序列组 成。在一个实施方案中，本发明方法的多核苷酸不由Mil. 1或者Mil. 2的核酸分子的 序列组成和/或不由编码Mil. 1或者Mil. 2蛋白质的核酸分子的序列组成。从而，在一个实施方案中，本发明方法的多核苷酸不由Rossi等人1998，PNAS USA 95 :9750-9754，Milligan 等人，1998. Plant Cell 10 1307-1319 ；和 / 或 WO 9806750 中所 示的序列组成。在图15和17中显示了 Rpi-blb2,Mil. 1和Mil. 2的序列比较。本文所用术语“连锁群”涉及两种或多种性状和/或基因座和/或基因和/或标 记，它们由于所述性状和/或基因座和/或基因和/或标记之间的关联而倾向于一起遗传。 性状和/或基因座和/或基因和/或标记越密切，在DNA修复或者复制过程，如真核生物中有丝分裂或减数分裂期间它们分离的概率越低，从而它们将一起遗传的概率越大。连锁群 与染色体的同源对一样多。术语“连锁群6”涉及与6号染色体关联的马铃薯或番茄的连锁群，通过基于 Bernatzky和Tanksley (1986)和Tanksley等人(1992)发表的工作鉴定已知染色体位置的 标记建立此类关联。连锁群具有与它们的各自染色体相同的编号。在番茄中，根据粗线期 测量的染色体的长度对染色体编号。此类编号已经由BartOn(1950)采用；1号染色体是最 长的，12号染色体是最短的。除了长度，诸如着丝粒的位置和异染色质的量和分布的特征 用于鉴定每个染色体。短臂通过“S”表示，长臂用“L”表示；从而如在Barton，D.W. (1950) American Journal of Botany. 37,639-643, Bernatzky, R.禾口 Tanksley, S. D. (1986) Genetics 112，887-898，Tanksley，S.D.，等人，(1992) Genetics 132，1141-1160 中，“IS” 表示1号染色体的短臂。本文所用术语“共分离”涉及两种或多种紧密连锁的性状和/或基因座和/或基 因和/或标记倾向于一起遗传。例如，6号染色体的与Rpi_blb2共分离的更具体的区域是短臂，其在番茄中具有 形态学标记Mi。因此，在一个实施方案中，本发明涉及本发明的方法，其中Rpi_blb2蛋白质由本 发明的多核苷酸编码，例如，由Seq. ID. 1或3或5或6中所示的多核苷酸或者其片段编码。基于BLASTX检索，与所鉴定的Rpi_blb2序列具有最高同源性的所鉴定基因是 Mil. 1和Mil. 2基因和蛋白质；见图15和17。两种基因都与Seq. ID. 1或3或5或6中描述 的序列具有高同一性但是不赋予对卵菌门植物病原体的抗性。因此，Mil. 1和Mil. 2的活性 不同于本发明多肽活性。Mil. 1和Mil. 20RF的序列和编码蛋白质在本文中以Seq. ID NO. 7到10显示。此外，申请EP 401764. 4涉及Mi-基因。现有技术Mil. 1-和Mil. 2-基因的 序列排除在本发明多核苷酸之外，具体排除Seq. ID NO. :7和9。还包括编码Seq. ID N0. 8或10的多肽的多核苷酸序列。从而，在一个实施方案中，还排除编码Mil. 1和Mil. 2蛋白 质的序列。与本发明的多核苷酸编码的多肽具有较低同源性的蛋白质是Hero抗性蛋白质 1 和 2(Genbank 检索号gi26190252 和 gi26190254)、番茄斑萎病毒(Tospovirus)抗性蛋 白质 A、B、C、D 禾口 E[Genbank 检索号gil5418709、gil5418710、gil5418712、gil5418713、 gi 15418714] ；Rl [Genbank 检索号gi 17432423]和 Prf [Genbank 检索号gi8547237]，它们 的序列或者编码的序列也排除在本发明的序列之外。本文中所用术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、或者“核酸分 子”指任意长度的核苷酸的聚合形式，可以为核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸。该术语仅指 分子的一级结构。从而，该术语包括双链和单链DNA和RNA。它还包括已知类型的修饰，例如，甲基 化、一个或多个天然发生的核苷酸用类似物的“帽”替代。优选地，本发明的DNA序列包含 编码本文定义的多肽的编码序列。“编码序列”是核苷酸序列，当置于适宜的调节序列的控制下时，所述核苷酸序列 转录成mRNA和/或翻译成多肽。由5’末端的翻译起始密码子和3’-末端的翻译终止密码 子决定编码序列的界限。编码序列可以包括，但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或者基 因组DNA，而在某些条件下也可以存在内含子。
“杂交”指此类核酸分子在常规杂交条件下，优选在如Sambrook(Molecular Cloning ；A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor，NY(1989))描述的严格条件下杂交。此类严格杂交条件的一个实例是在 4XSSC 65°C下杂交，然后在0. IXSSC 65°C下洗涤1小时。备选地，代表性严格杂交条 件是在50%甲酰胺，4XSSC中，42°C下。此外，洗涤步骤期间的条件可以选自低严格条件 (约2XSSC 50°C下)和高严格条件(约0.2XSSC 50°C，优选65°C下)界定的条件范围 (20XSSC:0. 3M柠檬酸钠，3M NaCl，pH 7.0)。此外，洗涤步骤期间的温度可以从室温，约 22°C的低严格条件升高到约65°C的高严格条件。两种参数盐浓度和温度可以同时改变或 者两个参数之一可以保持恒定而仅另一个改变。在杂交期间可以使用变性剂，如甲酰胺或 者SDS。在50%甲酰胺存在下，优选在42°C实现杂交。下面显示了杂交和洗涤步骤条件的 一些其他实例(1)例如，可以从下面的条件选择杂交条件a) 4 X SSC 65 °C,b) 6 X SSC 45 °C,c) 6 X SSC, 100mg/ml 变性片段化鱼精 DNA，68°Cd)6XSSC,0. 5% SDS, 100mg/ml 变性鲑精 DNA，68°C，e)6XSSC，0. 5% SDS, 100mg/ml 变性片段化鲑精 DNA，50% 甲酰胺，42°C，f) 50% 甲酰胺，4 X SSC 42 V,g)50% (体积/体积)甲酰胺，0. 牛血清白蛋白，0. l%Ficoll,0. 聚乙烯吡 咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH 6. 5,750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，42°C，h)2X 或 4XSSC，50°C (低严格条件)，或i)30到40%甲酰胺，2X或4XSSC，42°C (低严格条件)。(2)例如，可以从下面的条件选择步骤a)0. 015M NaCl/0. 0015M 柠檬酸钠/0. 1% SDS, 50°C,b)0. IXSSC 65°C,c)0. 1XSSC,0. 5% SDS,68°C,d)0. 1XSSC，0. 5% SDS，50% 甲酰胺，42°C，e)0. 2XSSC,0. 1% SDS,42°C,f)0. 2X SSC 65 °C (低严格条件)。在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含多核苷酸，其与包含或者由 具有Seq ID No. 1或3或5或6所示序列或者其片段的核酸分子组成的核酸分子杂交。所 述片段包含或者优选由 Seq ID No. 1 或 3 或 5 或 6 的 15、20、30、40、70、100、300、500、700、 1000或更多残基组成。在优选实施方案中，本发明的多核苷酸包含在“严格”杂交条件下与包含或者由具 有Seq ID No. 1或3或5或6所示序列或者其片段的核酸分子组成的核酸分子杂交的多核 苷酸。本文所用的术语“在严格杂交条件下”指任一种本文提到的严格杂交条件。在 另一实施方案中，术语“在严格杂交条件下”指在实施例中提及或在Sambrook(Molecular Cloning ；A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY(1989)中所用的杂交条件。在一个优选实施方案中，本文所用的术语“在严格杂交条件下”指所有本文提到的 严格杂交条件，表示多核苷酸在所有提到的严格条件下杂交。来自其他生物的Rpi_blb2可以由其他DNA序列编码，所述序列在松弛杂交条件 下与Seq ID No. 1或3或5或6中所示序列杂交并且表达时编码具有Rpi_blb2的活性的 肽。此外，一些应用必须在低严格杂交条件下进行，对杂交的特异性没有任何影响。例如，可 以用本发明的多核苷酸探测总DNA的DNA印迹分析并在低严格条件(55°C，2XSSPE，0. 1% SDS中)下洗涤。杂交分析可以揭示仅编码Rpi_blb2的基因的简单模式。此类低严格杂交 条件的另一实例是4X SSC 50°C下，或者用30到40%甲酰胺在42°C杂交。此类分子包含本 发明的Rpi_blb2的片段、类似物或者衍生物并且例如通过单独或组合的氨基酸和/或核苷 酸缺失、插入、替代、加入和/或重组或本领域已知的任何其他修饰而与上述氨基酸序列或 者它们潜在的核苷酸序列不同。然而，优选使用高严格杂交条件。术语“同源”指各自核酸分子或者编码的蛋白质在功能和/或结构上等价。与上述 核酸分子同源并且是所述核酸分子衍生物的核酸分子为例如，所述核酸分子代表修饰的变 异，其具有相同的生物功能，尤其编码具有相同或基本上相同生物功能的蛋白质。它们可以 是天然发生的变异，如来自其他植物变种或品种的序列，或者突变。这些突变可以天然发生 或者可以通过诱变技术得到。等位基因变异可以是天然发生的等位基因变体以及合成产生 或者基因工程化的变体。通过例如，测试所述多肽与抗体的结合可以鉴定结构等价物。结 构等价物具有相似的免疫学特征，例如，包含相似的表位。术语“片段”、“序列的片段”或“序列的部分”指所指的最初序列的截短的序列。截 短的序列(核酸或者蛋白质序列)可以在长度上变化很大；最小尺寸是提供具有所指最初 序列的相当功能和/或活性的序列的足够大小的序列；而最大尺寸不是关键的。在一些应 用中，最大尺寸通常不显著大于提供最初序列的所希望的活性和/或功能所需的尺寸。通常，截短的氨基酸序列将长为约5到约1260个氨基酸。然而，更典型地，该序列 将最大长约1000个氨基酸，优选最大约500或100个氨基酸。通常希望选择具有至少约 10、12或15个氨基酸，多达最大约20到约25个氨基酸的序列。术语“表位”涉及抗原内的特异免疫反应位点，也称作抗原决定簇。这些表位可以 是聚合成分中单体的线阵-如蛋白质中的氨基酸-或者组成为或者包含更复杂的二级或者 三级结构。技术人员将认识到所有免疫原(即，能够引起免疫应答的物质)都是抗原；然 而，一些抗原(如半抗原)不是免疫原，但是通过偶联载体分子可以称为免疫原性的。术语 “抗原”包括对物质的参考，可以产生针对该物质的抗体和/或该抗体对该物质是特异免疫 反应的。在一个实施方案中，本发明涉及Rpi_blb2的表位。术语“一个或几个氨基酸”涉及至少一个氨基酸但是不多于将导致低于70%同一 性的同源性的氨基酸数。优选地，同一性多于75%或80%，更优选为85%、90%或95%，甚 至更优选为96%、97%、98%或99%同一性。术语“多核苷酸”和“核酸分子”还涉及“分离的”多核苷酸或者核酸分子。“分离 的”核酸分子是与存在于该核酸的天然来源的其他核酸分子分离的核酸分子。优选地，“分 离的”核酸没有这样的序列，其天然地在所述核酸所来源的生物的基因组DNA中所述核酸的 侧翼(即，位于所述核酸的5’和3’末端的序列)。例如，在多种实施方案中，本发明的多核苷酸可以含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb或更少的核苷酸序列，其天然 位于所述核酸所来源的生物的基因组DNA中所述核酸分子的侧翼。此外，本发明的多核苷 酸，尤其“分离的”核酸分子，如cDNA分子，当通过重组技术产生时可以基本上无其他细胞 材料，或者培养基，或者当化学合成时可以基本上无化学前体或者其他化学品。此外，本发明的多核苷酸包含与上述多核苷酸的核苷酸序列之一或者其部分互补 的核酸分子。与Seq ID No. 1或3或5或6中所示核苷酸序列之一互补的核酸分子是与 Seq ID No. 1或3或5或6中所示核苷酸序列之一足够互补的序列，从而它可以与Seq ID No. 1或3或5或6中所示核苷酸序列杂交，从而形成稳定的双链体。本发明的多核苷酸还包含与Seq ID No. 1或3或5或6中所示的核苷酸序列或者 其部分至少约70 %，优选至少约75 %，更优选至少约80 %、90 %或95 %，甚至更优选至少约 96%、97%、98%、99%或以上同源的核苷酸序列。本发明的多核苷酸包含与Seq ID No. 1 或3或5或6中所示的核苷酸序列或者其部分杂交，优选在本文定义的严格条件下杂交的 核苷酸序列。此外，本发明的多核苷酸可以包含SEQ ID No :1或3或5或6的序列之一的编码 区的仅一部分，例如，可以用作探针或者引物的片段或者编码Rpi_blb2蛋白质编码基因的 生物活性部分的片段。从当前Rpi_blb2蛋白质编码基因克隆确定的核苷酸序列允许产生 探针和引物，它们设计用于鉴定和/或克隆它在其他细胞类型和生物中的同源物。探针/引 物通常包含基本上纯化的寡核苷酸。寡核苷酸通常包含核苷酸序列区，其在严格条件下与 例如，SEQ ID No :1或3或5或6中提出的序列之一的反义链的至少约12、15个，优选约20 或25个，更优选约40、50或75个连续核苷酸杂交，例如与SEQ ID No :1或3或5或6中给 出的序列之一的反义序列或者其天然发生的突变体杂交。基于本发明核苷酸的引物可以用 于PCR反应中克隆Rpi-blb2同源物，例如，使用本发明的实施例中描述的引物，如表3a或 3b中所示的引物，优选引物ARFlF和ARF1R。用引物univ24R和univl4L进行的PCR将导致 Rpi-blb2的片段，其可以如本文描述的使用。所述引物组可以互换。本领域技术人员已知 组合所述引物以得到所希望的产物，例如，得到全长克隆或者部分序列。基于Rpi_blb2核 苷酸序列的探针可以用于检测编码相同或者同源蛋白质的转录物或者基因组序列。探针可 以还包含连接该探针的标记物组，例如，标记物组可以是放射性同位素、荧光化合物、酶、或 者酶辅因子。此类探针可以用作基因组标记测试试剂盒的部分用以鉴定表达Rpi_blb2的 细胞，如通过测量细胞样品中Rpi_blb2编码核酸的水平，例如，通过检测Rpi_blb2mRNA水 平或者测定基因组Rpi_blb2基因是否已经突变或者缺失进行所述鉴定。本发明的多核苷酸编码多肽或者其部分，所述多肽或者其部分包括与SEQ ID No 2或4的氨基酸足够同源的氨基酸序列从而蛋白质或者其部分保持参与对病原体抗性，尤 其植物中实施例中所描述的Rpi_blb2蛋白质活性的能力。如本文所用的，术语“足够同源 的”指蛋白质或者其部分的氨基酸序列包括最小数目的与SEQ ID No :2或4的氨基酸序列 相同或等价(例如，氨基酸残基与本发明的多肽序列之一中的氨基酸残基具有相似侧链) 氨基酸残基，从而所述蛋白质或者其部分能够参与植物对所述病原体的抗性。在本文描述 了 Rpi-blb2蛋白质活性的实例。从而，Rpi-blb2蛋白质的功能直接或者间接有助于对植 物病原体，优选对本文提到的病原体，更优选对致病疫霉的抗性。所述蛋白质至少约70 %，优选至少约75 %，更优选至少约80 %、90 %、95 %，最优选至少约96%、97%、98%、99%或以上同源于SEQ ID No :2或4的完整氨基酸序列。本发明的多核苷酸编码的蛋白质的部分优选具有生物活性。如本文提到的，术语“生物活性部分”意在包括部分，例如，结构域/基序，所述部 分赋予对卵菌植物病原体和/或烟粉虱(Bemisia tabaci)和/或蚜虫的抗性或者具有免 疫学活性从而它结合特异结合Rpi_blb2蛋白质的抗体或者它具有实施例中给出或者本文 描述的活性。通过分离SEQ ID No 1或3或5或6中序列之一的一部分，表达Rpi_blb2蛋白质 或者肽的编码部分(例如，通过体外重组表达)并评估蛋白质的编码部分的活性可以制备 编码本发明多肽的生物活性部分的额外的核酸片段。本发明还包括由于遗传密码简并性而与SEQ ID No 1或3或5或6 (和其部分) 中所示核苷酸序列之一不同从而编码SEQ ID No :2或4中所示序列编码的Rpi_blb2多肽 的多核苷酸。此外，本发明的多核苷酸具有编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有SEQ ID No :2或4中所示氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明的多核苷酸编码全长蛋白质， 其与SEQ ID No :2或4中所示氨基酸序列基本上同源。此外，本领域技术人员将理解在群体(例如，S.bulbocastanum群体)内可以存在 DNA序列多态性，其导致氨基酸序列中的改变。由于自然变异，Rpi_blb2基因中此类遗传多 态性可以存在于群体内的个体间。如本文所用的，术语“基因”和“重组基因”指包含编码Rpi_blb2，优选 S.bulbocastanum Rpi_blb2的可读框的核酸分子。此类天然变异通常可以导致Rpi_blb2 基因的核苷酸序列中1-5%变异。本发明范围内意在包括由于天然变异导致并且不改变 Rpi-blb2的功能活性的Rpi_blb2中的任意和所有此类核苷酸变异和所得氨基酸多态性。使用本发明的多核苷酸或者其部分作为杂交探针，根据标准杂交技术，在严格杂 交条件下，可以基于与本文公开的S. bulbocastanum Rpi_blb2多核苷酸的同源性分离相应 于Rpi-blb2cDNA的天然变体和非S. bulbocastanum同源物的多核苷酸。因此，在另一实施 方案中，本发明的多核苷酸长为至少20个核苷酸。优选地，它在严格条件下与包含本发明 多核苷酸的核苷酸序列，例如，SEQ ID No :1或3或5或6的核酸分子杂交。在其他实施方 案中，所述核酸长为至少20、30、50、100、250或更多个核苷酸。术语“在严格条件下杂交” 如上定义并且意在描述杂交和洗涤条件，在该条件下相互至少65%同一的核苷酸序列通常 保持相互杂交。优选地，所述条件使得相互至少约70%，更优选至少约75%或80%，甚至更 优选至少约85%、90%或95%或以上同一的序列通常保持相互杂交。优选地，在严格条件 下与SEQ ID No :1或3或5或6的序列杂交的本发明的多核苷酸相应于天然发生的核酸分 子。如本文所用的，“天然发生的”核酸分子指具有天然发生的核苷酸序列的RNA或者 DNA分子(例如，编码天然蛋白质)。优选地，所述多核苷酸编码天然的S.bulbocastanum Rpi-blb2。除了可能存在于群体中的Rpi_blb2序列的天然发生的变体外，技术人员将还理 解通过突变可以向编码Rpi-blb2的多核苷酸的核苷酸序列中引入改变，从而导致所编码 的Rpi-blb2的氨基酸序列的改变，而不改变Rpi_blb2的功能能力。例如，可以在编码 Rpi-blb2的核苷酸的序列中，例如，在SEQID No :1或3或5或6中进行导致在“非必需”氨基酸残基处氨基酸替代的核苷酸替代。“非必需”氨基酸残基是可以从Rpi_blb2蛋白 质的野生型序列改变而不改变所述Rpi-blb2蛋白质活性的残基，而“必需”氨基酸残基是 Rpi-blb2蛋白质活性所需的。然而，其他氨基酸残基(例如，在具有Rpi_blb2活性的结构 域中不保守或者仅半保守的那些残基)可能对活性不是必需的，从而可能顺从改变而不改 变Rpi-blb2活性。因此，本领域技术人员已知生物之间的密码子选择可以不同。因此，他将使得本发 明的多核苷酸的密码子选择适于所述多核苷酸或者多肽在其中表达的生物的选择。因此，本发明涉及编码Rpi_blb2的多核苷酸，所述Rpi_blb2含有对Rpi_blb2活 性不是必需的氨基酸中的改变。此类Rpi_blb2的氨基酸序列与SEQ ID No :2或4中所含 序列不同，但是仍然保持本文所述的Rpi_blb2活性。所述多核苷酸可以包含编码多肽的 核苷酸序列，其中所述多肽包含与SEQ ID No :2或4的氨基酸具有至少约70%同一性的氨 基酸序列并且能够参与对植物病原体的抗性。优选地，所述核酸分子编码的蛋白质与SEQ IDNo :2或4中的序列具有至少约70%同一性，更优选与SEQ ID No :2或4中序列之一具有 至少约75%同一性，甚至更优选与SEQ ID No :2或4中序列具有至少约80%、90%、95%同 源性，最优选与SEQ ID No :2或4中序列具有至少约96%、97%、98%或99%同一性。为了确定两条氨基酸序列(例如，SEQ ID No :2或4的序列之一和其突变形式)或 者两条核酸之间的百分数同一性，为了最优比较目的将序列进行比对(例如，在一个蛋白 质或者核酸的序列中引入缺口以与另一蛋白质或者核酸进行最优比对)。然后比较相应氨 基酸位置或者核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当一条序列(例如，SEQ ID No:2或4 的序列之一)中的位置被与另一条序列(例如，所选序列的突变形式)中相应位置相同的 氨基酸残基或核苷酸占据时，这两个分子在该位置同源(即，本文所用的氨基酸或者核酸 “同源性”等价于氨基酸或核酸“同一性”)。两条序列之间百分数同源性是所述序列共有的 相同位置数的函数(即，％同源性=相同位置数/位置总数X 100)。借助于程序算法GAP (Wisconsin Package 版本 10. 0，University offfisconsin, Genetics Computer Group(GCG), Madison, USA ；Altschul 等人(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389，参照以下)通过比较可以计算同源性，设置下面的参数缺口权重50 长度权重3平均匹配10 平均错配0例如，在核酸水平与SEQ ID NO 1的序列具有至少80%同源性的序列理解为指一 个序列，其当通过上面的程序算法使用上面的参数设置与SEQ ID NO :1的序列比较时，具有 至少80%同源性。两条多肽之间的同源性理解为指借助于程序算法GAP(WiSCOnSin Package版本 10. 0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA), ^cBT" 面的参数缺口权重8 长度权重2平均匹配2912 平均错配_2003，通过比较计算的每条完整序列长度上氨基酸序列的同一性。例如在蛋白质水平与序列SEQ ID NO :2具有至少80%同源性的序列理解为指一 个序列，其当通过上面的程序算法使用上面的参数设置与SEQID NO 2的序列比较时，具有至少80%同源性。在本申请中，用可以在驟w. ebi.ac.uk/tools找到的程序clustalW，选择序列分 析并选择选项clustalW(多序列比对)确定同源性。所有选项在标准条件下进行，如下比对完全；输出格式aln w/numbers ；输出顺序对准的；颜色调整无; ktup (字号):def ；窗口长def ；得分类型百分数；topdiag :def ；pairgap :def ；矩阵 def ；缺口打开:def ；结束缺口 :def ；缺口延伸:def ；延伸距离:def ；cpu模式单个；树图/ 类型进化树；树图/距离隐藏；种系发生树/树类型无；种系发生树/校正距离关；种 系发生树/忽略缺口 关。因此，优选根据clustalW的同源性计算。通过替代、插入或者缺失，从根据本发明的SEQ ID No :2或4所示的多肽之一衍生 的功能等价物与根据本发明的SEQ ID No :2或4所示的多肽之一具有至少70%，优选至少 80 %，优选至少90 %，特别优选至少95 %，非常特别优选至少98 %同一性并且通过具有与 SEQ ID No :2或4中所示多肽基本上相同的性质区别开来。通过替代、插入或者缺失从根据本发明的SEQ ID No :1或3或5或6所示的核苷酸 序列衍生的功能等价物与根据本发明的SEQ ID No :2或4所示的多肽之一具有至少70%， 优选至少80 %，优选至少90 %，特别优选至少95 %，非常特别优选至少98 %同一性并且编 码具有与SEQ ID No :2或4中所示多肽基本上相同的性质的多肽。功能等价物的“基本上相同的性质”尤其理解为指赋予病原体抗性表型或者赋予 或者增加对至少一种病原体的抗性而增加所述功能Rpi_blb2等价物在植物或者植物组 织、部分或细胞中的蛋白质的量、活性或者功能。感染后孢子形成和病灶表型联合功能等价 物的蛋白质量、活性或功能的所述增加理解为基本性质。编码与SEQ ID No :2或4的蛋白质序列同源的Rpi_blb2的核酸分子可以通过在 本发明的多核苷酸的核苷酸序列，尤其SEQ ID No :1或3或5或6中引入一个或多个核苷 酸替代、加入或缺失来产生，从而向所编码的蛋白质中引入一个或多个氨基酸替代、加入或 缺失。通过标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变可以向例如SEQ ID No :1或3或5或 6的序列中弓I入突变。优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸替 代。“保守氨基酸替代”是其中将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换的替代。本 领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基 酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具 有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、 半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨 酸)和芳香族侧链氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。从而，Rpi_blb2中 预测的非必需氨基酸残基优选用来自相同家族的另一氨基酸残基替换。备选地，在另一实 施方案中，例如，通过饱和诱变可以沿着Rpi_blb2编码序列的所有或部分随机导入突变， 并且可以对所得突变体筛选本文描述的Rpi_blb2活性以鉴定保持Rpi-blb2活性的突变 体。SEQ ID No :1或3或5或6的序列之一诱变后，可以重组表达所编码的蛋白质并且可 以使用例如，本文描述的测定法(见实施例)测定所述蛋白质的活性。在一个实施方案中，在本发明的方法中，Rpi_blb2蛋白质和另一抗性蛋白质的活 性增加了。
预计在田间条件下一种以上的抗性基因，尤其赋予对相同病原体的抗性的基因的 存在是有益的。对于存在能够克服一种R-基因的抗性的病原体分离物(例如，致病疫霉品 种)的情况下，其他一种或多种R基因仍然是有功能的，使得所述病原体不能感染植物。两 种未打败的R基因的存在大大减小了病原体，尤其致病疫霉品种能够突变成克服两种或多 种R基因的品种的机会。在下文中“抗性多肽”或者“抗性蛋白质”涉及多肽，其(增加的)活性将赋予 对敏感基因型(“野生型”或“参照”)的抗性。因此，Rpi_blb2是抗性蛋白质以及例如， Rpi-blb (或者RB或Sbul)。“另一种抗性蛋白质”涉及不同于本发明蛋白质的另一种抗性 蛋白质，而术语“抗性蛋白质”包含本发明的多肽以及一种或多种抗性蛋白质。还理解术语 “和另一种抗性蛋白质”涉及一种或多种其他抗性蛋白质。从而，可以增加一种或多种抗性 蛋白质的活性。在下文中描述了其他抗性蛋白质。然而，通常任意其他已知的抗性蛋白质 可以与本发明的多肽共表达或者可以通过本文描述的关于Rpi_blb2的任意方法增加它的 活性。在优选实施方案中，另一种抗性蛋白质包含LRR结构域和P环。超过30种以上赋予对细菌、真菌、卵菌、病毒、线虫或者昆虫抗性的植物疾病抗 性(R)基因的克隆和分子表征允许不管病原体特异性而对它们在结构类别中进行分类 (Dangl和Jones，2001中综述)。预测所表征的R基因的最丰富的类别(包含拟南芥属基 因组中预测的基因的约0. 5% )编码细胞外蛋白质，其携带在其他受体和信号转导蛋白质 中也发现的富含亮氨酸重复单位(LRR)和核苷酸结合位点(NBS)结构域、基序。NBS-LRR R 蛋白质主要在N-末端不同，所述N-末端显示出与果蝇Toll蛋白质和哺乳动物白介素-1 受体结构域(TIR-NBS-LRR)的序列相似性，或者编码卷曲螺旋结构(CC-NBS-LRR)，有时为 亮氨酸拉链(LZ-NBS-LRR)的形式。尽管可能是膜结合的，但是预测NBS-LRR蛋白质为细胞 质的。相比，预测携带LRR的R蛋白质的两个其他类别跨越细胞膜，具有胞外LRR结构域 LRR-跨膜(LRR-TM) Cf蛋白质和LRR-TM-激酶Xa21蛋白质。所表征的缺少LRR的R蛋白质 是来自番茄的Pto基因、来自甜菜的HsIpm-1基因、来自大麦的mlo基因、来自拟南芥的RpwS 基因和来自大麦的Rpgl基因。根据基因对基因(gene-for-gene)假说，疾病抗性遵循具有无毒性(Avr)功能的 病原体效应分子的植物R蛋白质的观点，其中通过某种引发子(elicitor)识别复合体引发 信号转导途径，导致超敏反应(HR)。与其他受体一起，通常认为NBS-LRR R蛋白质具有调节 结构，其具有分开的识别和发信号结构域，其中LRR是候选识别结构域并且N-末端区包括 NBS——主要的发信号结构域。重组R蛋白质的功能分析表明识别特异性实际上存在于LRR 中。此外，LRR是与相关NBS-LRR蛋白质紧密相关的最多变区并且处于分叉选择下。然而， 不断积累的证据表明LRR也通过涉及推定的分子内相互作用的负向调节有助于信号转导。 当前，已经从马铃薯克隆了 5种R基因，包括赋予对晚疫抗性的两种R基因，并且所有基因 都属于植物R基因的CC/LZ-NBS-LRR类。尽管S. demissum来源的Rl基因赋予对晚疫的品 种特异抗性，但是最近克隆的S. bulbocastanum来源的基因Rpi-blb (或者RB或者Sbul) 赋予对携带多种毒性因子的一系列致病疫霉分离物的完全抗性，并且还没有表现品种特异 性。此外，如前描述，在墨西哥的田间实验中，含有Rpi-blb的体细胞杂种的子代植物不受 晚疫的影响，在所述田间中发现几乎每个品种的真菌。阐明了通过培养的马铃薯和番茄中敏感表型的互补，通过用单一克隆的R基因可能实现广谱晚疫抗性从两性不相容的宿主物 种向培养的茄科的种间转移的可能性。US 6，127，607描述了具有LRR结构域和P环的抗 性蛋白质。本文引用US 6，127，607的内容作为参考。具体地，6到8列和11列描述了 LRR 结构域和 P 环。此外，Song，2003，PNAS 100 (16)，9128-9133 说明了图 4 中 Rpi-blb LRR 基 序的比较并且在第9132上给出关于LRR结构域的概述。在图14以及图15中显示了本发 明多肽的结构域。优选地，选自Rpi-blb (同义词 RB 或 Sbul)、Rpi-ABPTU Rpi_blb3、Rpi-mcd、Rl、 R-ber (同义词 R12)、Rpil、R2、R3a、R3b、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、Rll、Ph_l、Ph_2 和 Ph_3 构成的组的一种或多种抗性蛋白质的活性增加了。优选除了 Rpi_blb2之外，至少Rpi-blb 的活性也增加了。在本发明的一个实施方案中，例如，转基因的Rpi_blb2蛋白质的表达增加了，并 且另一转基因抗性基因的表达增加了。与Rpi_blb2(或者RB或者Sbul)共表达的抗性蛋 白质优选为本文提到的抗性蛋白质之一，尤其Rpi-blb、Rpi-ABPTU Rpi_blb3、RU Rpil、 R-ber、Rpi-mcd、R2、R3a、R3b、R6、R7、Ph_l、Ph_2或Ph_3，但是也可以是本领域技术人员已 知的赋予对植物病原体的其他抗性之一的蛋白质。如所提到的，根据本发明的术语“增加的表达”也包括多核苷酸或者多肽的从头表达。最优选的是通过本发明多肽与Rpi-blb的共表达增加抗性。如在实施例和Song 2003，PNAS 100 (16)，9128中描述的，Rpi-blb和Rpi-blb2在离脱叶测定中提供了对致病疫 霉分离物的完全抗性。所述抗性赋予基因例如描述于RB 或者 Sbul (Rpi-blb 的同义词):AY336128[gi =32693280], (Song 等人，2003)。 包含Rpi-blb基因的BAC克隆177013和CB3A14已经保藏在GenBank，检索号AY303171和 AY303170 ；Rl :AF447489[gi 9117432422], (Ballvora 等人，2002)；Rpil :Kuhl, J. C. , Hanneman, R. Ε,禾口 Havey, Μ. J, (2201) Ch aracterization and mapping of Rpil,a late blight resistance locus fromdiploid(IEBN)Mexican Solanum pinnatisectum. Molecular genet. Genomics 265 :977_985 ;R-ber :Ewing, Ε. Ε. , Simko, I. , Smart, C. D. , Bonierbale, M. W, Mizubuti, E. S. G, May, G. D,禾口 Fry, W. E, (2000)Genetic mapping fromfield tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthorainfestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanumberthaultii. Molecular breeding 6 25-36 ；R2 :Li, X. ，vanEck, H. J. ，vander Voort, J. N. A. M, Huigen, D. J, Stam, P,禾口 Jacobsen,E. (1998)Autotetraploids and genetic mapping usingcommon AFLP markers the R2 allele conferring resistance toPhytophthora infestans mapped on potato chromosome 4.Theoretical andApplied Genetics 96(8) :1121_112 ;R3、R6、R7 :Elkharbotly, A, Palominosanchez, C, Salamini, F, Jacobsen, EjP Gebhardt,C. 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Crop FunctionalGenomics 2004, July 2004, Jeju, Korea, 93 页；R3a 禾口 R3b Huang, S.，Vleeshouwers, V. G. A. A, Weri j，J. S, Hutten, R. C. B, Van Eck, H.J, Visser, R. G. F,禾口 Jacobsen, E. (2004). The R3resistance to Phytophthora infestans in potato is conferred by two closelylinked R genes with distinct specificities. MPMI 17(4)，428-435 ；在一个实施方案中，根据本发明，Rpi_blb2的活性增加了，例如，本发明多核苷酸 的表达增加了并且编码 Rpi-blb、Rpi-ABPTl、Rpi-blb3、Rpi-mcd Rl、R_ber、Rpil、R2、R3a、 R3b、R6、R7、Ph-l、Ph-2和/或Ph_3的至少一种核酸分子的表达增加了，其中所述核酸分子 选自a)核酸分子，其编码至少如下的至少成熟形式Rpi-blb (或者 RB-或者 Sbul-)多肽，优选由 GenBank 检索号 AY336128[gi 32693280]中所示的序列编码；Rl多肽，优选由GenBank检索号AF447489 [gi9117432422]中所示的序列编码；Rpi-blb3、Rpi-ABPTl 和 / 或Rpi-mcd 多月太，优选由 Park，T. H，Vander Vossen,Ε.， Vleeshouwers, V. G. A. A, Tan, A, Visser, R. G. F.禾口 VanEck, H. J. 2004. Major resistance genes for tuber and leaf resistance toPhytophthora infestans in potato :An outline of a PhD project. CropFunctional Genomics 2004, July 2004, Jeju,Korea,93 页中所示或者其中的信息可以推导的序列编码；R3a 和 / 或 R3b 多肽，优选由 Huang，S.，Vleeshouwers, V. G. A. A, Weri j, J. S.， Hutten, R. C. B, Van Eck, H. J, Visser, R. G. F,禾口 Jacobsen, E. (2004). The R3 resistance to Phytophthora infestans in potato isconferred by two closely linked R genes with distinct specificities. MPMI17 (4)，428-435中所示或者其中的信息可以推导的序 列编码；和/或病原体，优选致病疫霉抗性赋予蛋白质，其如所描述的作图和表征，例如，对于 Rpil 在 Kuhl, J. C, Hanneman, R. E，禾口 Havey，Μ. J, (2001) Characterization and mapping of Rpi1, a late blight resistance locus fromdiploid(IEBN)Mexican Solanum pinnatisectum. Molecular genet. Genomics 265 :977_985 中；
R-ber ^ Ewing, Ε. Ε, Simko, I. ， Smart, C. D. ，Bonierbale, Μ. W，Mizubuti, Ε·S.G，May，G. D，禾口 Fry，W. Ε，(2000)Genetic mapping fromfield tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthorainfestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanumberthaultii. Molecular breeding 6 :25_36 中；对于 R2 在 Li，Χ.，vanEck，H. J.，vanderVoort, J. N. A. M，Huigen, D. J.，Stam，P，禾口 Jacobsen,E. (1998)Autotetraploids and genetic mapping usingcommon AFLP markers the R2 allele conferring resistance toPhytophthora infestans mapped on potato chromosome 4.Theoretical andApplied Genetics 96(8) :1121_1128 中；对于 R3、R6、R7 在 Elkharbotly，A，Palominosanchez, C，Salamini, F，Jacobsen， Ε.，禾口 Gebhardt， C. (1996)R6 and R7 alleles of potatoconferring race-specific resistance to Phytophthora infestans(Mont)deBary identified genetic loci clustering with the R3 locus on chromosomeXi. Theoretical and Applied. Genetics 92(7) 880-884 中；对于Ph-I 在 Bonde 和 Murphy (1952)Main Agric. Exp. Stn. Bull. No497 ；或对于 Ph-2 在 Moreau, P，Thoquet, P. ，Olivier, J， Laterrot, H，禾口 Grimsley， N. H. (1998)Genetic mapping of Ph_2，a single locus control1ingpartial resistance to Phytophthora infestans in tomato. Molecular PlantMicrobe Interactions 11(4) 259-269中；和/或对于 Ph-3 在 Chunwongse, J，Chunwongse, C.，Black，L.，禾口 Hanson，P. (2002) Molecular mapping of the Ph_3 gene for late blight resistance intomato. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 77(3) :281_286 中；或者赋予病原体抗性的多肽，优选从所述出版物可以推导的赋予致病疫霉抗性的 多肽；b)核酸分子，其核苷酸序列是(a)的核苷酸序列由于遗传密码简并导致的序列；c)核酸分子，其编码的多肽通过从(a)或(b)的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序 列的一个或几个氨基酸的替代、缺失和/或加入从(a)或(b)的多核苷酸编码的多肽衍生；d)核酸分子，其编码的多肽的序列与(a)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具 有70%或以上的同一性；e)核酸分子，其包含(a)到(d)任一项的核酸分子编码的多肽的片段或者具有表 位的部分；f)核酸分子，其编码(a)到(e)任一项编码的多肽的以氨基酸1、30、50、100、 200、300、500 或 1000 开始并以氨基酸 1276、1000、500、300、200、50、30、或 1 结束的片段；g)包含(a)或(b)任一项的多核苷酸的至少20个核苷酸的核酸分子；h)核酸分子，其编码的多肽被针对(a)到(f)任一项的核酸分子编码的多肽产生 的单克隆抗体识别；i)核酸分子，其可以通过用具有(a)到(h)任一项的核酸分子或者其至少20个， 优选30或更多核苷酸的片段的序列的探针在严格条件下筛选适宜文库得到；和j)核酸分子，其互补链在严格条件下与(a)或(i)任一项的核酸分子杂交；或者(a)到(j)任一项的互补链。
因此，本发明的方法赋予本发明的所述植物之一、植物组织或者植物细胞对卵 菌门植物病原体的抗性，优选对腐霉目(Pythiales)或者Peronosperales，更优选对腐 霉科或者霜霉科(Peronosporaceae)，更优选对疫霉属(Phytophthora)或者盘梗霉属 (Bremia)或者霜霉属(Peronospera)或者单轴霉属(Plasmopara)病原体的抗性，最优选 iife^^^lJ^f^^J^^iSeje^iji^l^ft (Phytophthora parasitica var. nicotianae) (导致烟草黑柄等)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)(导致大豆中疫霉根部腐烂)、辣椒 疫霉(Phytophthora capsici)(导致胡椒、葫芦和番茄中腐烂)、红腐疫霉(Phytophthora erythroseptica)(导致马铃薯中粉红色腐烂)、葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)(导 致葡萄藤霜霉病)、莴苣盘梗霉(Bremia lactuca)(导致莴苣中霜霉病)或者Peronospora tabaci (导致烟草中蓝色霉)的物种。通过本领域技术人员公知和例如，在Sambrook等人，Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY, 1989中描述的方法可以在根据本发明的植物、植物细胞、植物组织、 植物器官或植物部分中增加、产生或者刺激Rpi_blb2的活性。从而，在优选实施方案中，本发明涉及本发明的方法，其中表达是从头表达。术语细胞、组织或者生物或者其部分中的“从头表达”在本文理解为涉及基因产物 的表达，而以前所述基因产物或者所述基因产物的活性，尤其相应多肽或者多核苷酸在细 胞、组织、或者生物或者其部分中是不可检测的。优选地，编码细胞、组织、或者生物或者其 部分中的多肽或者多核苷酸并且应该从头表达的基因不存在于细胞、组织、或者生物或者 其部分中的基因组中。如果在细胞、组织、或者生物或者其部分中不能检测到基因产物的表 达，那么通常认为在细胞、组织、或者生物或者其部分中没有发生表达。因此，如果不能检测 到活性，那么通常认为没有相应活性存在。然而，本领域技术人员已知检测方法和手段发展 到更高灵敏性。从而，在优选实施方案中，术语“从头表达”涉及系统中新的和额外的表达， 其中例如由于低水平表达或者表达几乎无活性的基因产物而活性水平太低以致不能赋予 对植物病原体，尤其对致病疫霉的抗性。敲除株系和低和/和高表达株系表型的比较可以 表明是否可以观察到针对本文提到的病原体的抗性中的差异。因此，在本发明的另一实施方案中，Rpi_blb2和/或另一种抗性蛋白质的内源活 性增加了。通过本领域技术人员已知的方法可以增加细胞中表达水平。本文描述了几种技 术，例如，本发明的多核苷酸或者多肽的转基因表达。多核苷酸或者多肽可以是外源来源。 优选地，导入与宿主细胞、植物细胞、植物组织或者植物相同遗传起源的多核苷酸。通过一些方法可以增加活性，尤其内源活性，还增加转基因表达的Rpi_blb2的活 性。因此，在优选实施方案中，通过一个或多个下面的步骤增加本文描述的抗性蛋白质的活 性a)稳定抗性蛋白质；b)稳定编码抗性蛋白质的mRNA ；c)增加抗性蛋白质的比活；d)表达用于抗性表达的同源或者人工转录因子或者增加用于抗性表达的同源或 者人工转录因子的表达；e)通过外源诱导因子刺激抗性蛋白质活性；
f)表达转基因抗性基因；和/或g)增加抗性编码基因的拷贝数。通常，通过增加生物中特定蛋白质，即抗性蛋白质的量可以增加所述生物，尤其植 物细胞、植物、或者植物组织中的活性。“蛋白质的量”理解为生物、组织、细胞或者细胞隔室 中多肽，优选Rpi_blb2的量。蛋白质的量的“增加”指在相同条件下(例如，培养条件、植 物年龄等等)，与没有应用该方法的相同属和种的野生型相比，生物、组织、细胞或者细胞隔 室中蛋白质的量的数量增加(例如，通过下文描述的方法之一)。所述增加达到至少10%， 优选至少20 %或至少50 %，尤其优选至少70 %或90 %，非常特别优选至少100 %，最优选至 少200%或以上。活性的“增加”理解为指在相同条件下(例如，培养条件、植物年龄等等)，与没有 应用该方法的相同属和种的野生型相比，生物、组织、细胞或者细胞隔室中蛋白质的总活性 的增加。所述增加达到至少10%，优选至少20%或至少50%，尤其优选至少70%或90%， 非常特别优选至少100%，最优选至少200%或以上。在该上下文中，与当增加SEQ ID NO :2或4中所示Rpi_blb2蛋白质之一所得值 相比，病原体抗性的功效可以向下或者向上偏离。优选的功能等价物为其中病原体抗性功 效(例如，通过病原体的穿透功效或者如本文描述的测量)与通过减去如SEQ ID N0:2或 4中所示Rpi_blb2蛋白质所得的比较值相差不超过50%，优选不超过25%，尤其优选不超 过10%的功能等价物。特别优选的是那些序列，其中基于减去如SEQ ID NO :2或4中所示 Rpi-blb2蛋白质之一所得的比较值，所述增加将病原体抗性的功效定量增加50%以上，优 选100 %，尤其优选500 %，非常特别优选1000 %。优选在类似条件下进行比较。“类似条件”指所有条件，如培养或生长条件、测定条 件(如缓冲液、温度、底物、病原体浓度等等)在待比较的实验间保持相同并且设置仅在待 比较的Rpi_blb2多肽的序列、它们的生物来源，如果适宜，和病原体方面不同。当选择病原 体时，每个比较需要所选的病原体最相似于其他等价物，考虑物种专一性。由于增加的Rpi_blb2活性，植物或者其部分的抗性增加了。在优选实施方案中， 本发明的方法导致与野生型相比，用致病疫霉感染后孢子形成指数减小至少30 %，更优选 减小50 %，甚至更优选为70 %，甚至更优选大于80 %，最优选为85 %和90 %。最优选为 95%或以上。因此，本发明还涉及如上定义的编码Rpi_blb2蛋白质的本发明的所述多核苷酸， 其包含核酸分子，所述核酸分子选自a)编码SEQ ID NO 2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；b)核酸分子，其包含如SEQ ID NO 1或3或5或6中描绘的编码序列编码所述多 肽的至少成熟形式；c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遗传密码简并产生；d)核酸分子，其编码的多肽通过从(a)到(C)的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序 列的一个或几个氨基酸的替代、缺失和/或加入从(a)到(c)的多核苷酸编码的多肽衍生；e)核酸分子，其编码的多肽的序列与(a)或(b)的核酸分子编码的多肽的氨基酸 序列具有70%或以上的同一性；f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一项的核酸分子编码的多肽的片段或者具有表位的部分；g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物，尤其ARFlF和ARFlR从 核酸文库扩增的核酸分子的序列；h)核酸分子，其编码(a)到(g)任一项编码的多肽的以氨基酸1、30、50、100、 200、300、500 或 1000 开始并以氨基酸 1267、1000、500、300、200、50、30、或 1 结束的片段；i)包含(a)或(d)任一项的多核苷酸的至少20个核苷酸的核酸分子；j)核酸分子，其编码的多肽被针对(a)到(h)任一项的核酸分子编码的多肽产生 的单克隆抗体识别；k)核酸分子，其可以通过用具有(a)到(j)任一项的核酸分子或者其至少15个， 优选30、60、90或更多个核苷酸的片段的序列的探针在严格条件下筛选适宜文库得到；和1)核酸分子，其互补链在严格条件下与(a)或(k)任一项的核酸分子杂交；或者(a)到(1)任一项的互补链；或者编码Solanum bulbocastanum的6号染色体或连锁群6的区段编码的多肽， 所述区段与选自表3a或3b的标记共分离，并且所述多肽介导对植物病原体，尤其选自卵菌 门病原体的抗性。在一个实施方案中，本发明多核苷酸不由Seq. ID NO. :7和/或9中描述的序列组 成和/或不由编码Seq. ID NO. :8和/或10中描述的蛋白质的核酸分子的序列组成。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸不由Mil. 1或者Mil. 2的核酸分子的序列 组成和/或不由编码Mil. 1或者Mil. 2蛋白质的核酸分子组成。从而，在一个实施方案中，本发明的多核苷酸不由Rossi等人1998，PNAS USA 95 9750-9754，Milligan 等人，1998. Plant Cell 10 1307-1319 ；和 / 或 WO 9806750 中所示的
序列组成。在另一实施方案中，本发明的多核苷酸来自或者分离自生物的基因组，所述生物 izfe 自 tfliS Systema Naturae 2000, Brands, S. J, Amsterdam 白勺胃胃禾4" (Menyanthaceae)、 爺禾斗、厚壳树禾斗(Sclerophylacaceae)、核果爺禾斗(Duckeodendraceae)Goetzeaceae> 旋 花禾斗(Convolvulaceae)、宽丝子禾斗(Cuscutaceae)、花惹禾斗(Polemoniaceae)禾口田基麻 科(Hydrophyllaceae)构成的组或者具有其来源，更优选选自由根据Systema Naturae 2000, Brands, S. J, Amsterdam ^IjS^nM (Atropa) > Browal 1 ia> #^fiJM (Brunfelsia) > 辣椒属(Capsicum)、夜香树属(Cestrum)、Cyphomandra> 曼陀罗属(Datura)、Fabiana> Frariciscea、天仙子属(Hyoscyamus)、枸杞属(Lycium)、爺参属(Mandragora)、假 酸浆属(Nicandra)、烟草属(Nicotiana)、碧冬茄属(Petunia)、酸浆属(Physalis)、 Schizanthus和茄属(Solanum)构成的组或者具有其来源，甚至更优选地选择茄科，优 选 S. bulbocastanum、马铃薯(S. tuberosum)、番爺(S. Iycopersicum)、矮牵牛、树番爺 (S. betaceum) >pearmelon (S. muricatum)禾口爺子(S. melongena)。甚至更优选地，将番爺或 者马铃薯或者S. bulbocastanum作为本发明多核苷酸来源。最优选地，将S. bulbocastanum 作为来源。已经从来自ABPT的马铃薯材料分离Rpi_blb2。从而，从分类学观点，所描述的 Rpi-blb2也是马铃薯来源的。然而，所述基因存在于可能来自S. bulbocastanum的渐渗片 段上。许多马铃薯变种含有相关茄属的渐渗片段，但是仍然是马铃薯。因此，根据分类学系统，马铃薯也可以是本发明的多核苷酸的来源，尤其ABPT来源的马铃薯，以及以类似方式 衍生的其他茄属变种的其他变种。因此，在另一实施方案中，本发明的多核苷酸来自马铃薯。使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息可以分离本发明的多核苷酸，例 如，具有Seq ID NO 1或3或5或6的核苷酸序列或者其部分的核酸分子。例如，使用本发 明多核苷酸的序列之一的所有或者部分作为杂交探针和标准杂交技术(例如，Sambrook等 人,Molecular Cloning :ALaboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY, 1989 中描述)可以从文 库分离Rpi-blb2cDNA。此外，通过聚合酶链反应，使用基于该序列(例如，包含本发明的多 核苷酸序列之一的所有或部分的核酸分子)设计的寡核苷酸引物可以分离包含本发明的 多核苷酸序列之一的所有或部分的多核苷酸。例如，可以从例如，S.bulbocastanum或者另 一种植物分离 mRNA(例如，通过 Chirgwin 等人(1979)Biochemistry 18 :5294_5299 的硫 氰酸胍提取方法)，并且使用逆转录酶(例如，Moloney MLV逆转录酶，可以从Gibco/BRL， Bethesda, MD 得到，或者 AMV 逆转录酶，可以从 SeikagakuAmerica，Inc.，St. Petersburg, FL得到)可以制备cDNA。基于SEQ ID No :1或3或5或6中所示核苷酸序列之一可以设 计用于聚合酶链反应扩增的合成的寡核苷酸引物。使用cDNA，备选地，使用基因组DNA作为 模板和适宜的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术可以扩增本发明的多核苷酸。可以将 如此扩增的多核苷酸克隆到适宜的载体中并通过DNA序列分析鉴定。此外，通过标准合成 技术，例如，使用自动化DNA合成仪可以制备相应于Rpi_blb2核苷酸的寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，由Solanum bulbocastanum或者马铃薯的6号染色 体或者连锁群6的区段编码Rpi-blb2蛋白质。此外，本发明包含Solanum bulbocastanum或者马铃薯的6号染色体或者连锁群 6的区段。在本发明方法的一个优选实施方案中，所表达的Rpi_blb2蛋白质由多核苷酸编 码，其包含S. bulbocastanum的6号染色体或者连锁群6的区段。优选地，所述区段还包含 顺式作用元件，例如，启动子、增强子、结合位点等等，或者反式作用元件，像辅因子、激活剂 或者其他抗性蛋白质，其赋予增加的抗性。在Seq. ID NO. :5和6中描绘了包含Rpi_blb2 基因和其他调节元件的基因组片段。本领域技术人员已知怎样得到染色体区段，例如，通过将染色体片段克隆到BAC， 如Song，2003，. PNAS 100 (16)，9128或者本文和所引用的参考文献中描述。因此，在另一实施方案中，本发明的多核苷酸或者编码Rpi_blb2蛋白质的多核苷 酸与选自表3a的标记共分离或者包含所述标记的复制位点或杂交位点。如实施例中详细 描述的，用表3a或者3b中描绘的标记可以对致病疫霉抗性作图。由于标记距离基因越近， 品系，即子代克隆中所述基因与所述标记共分离的百分数越高。因此，在优选实施方案中， 本发明的多核苷酸与标记E40M58、CTl 19和/或CT216共分离。在另一实施方案中，本发明涉及制备重组载体的方法，其包括将本发明的多核苷 酸插入到载体中或者将所述多核苷酸和另一抗性蛋白质插入到载体中。因此，在另一实施方案中，本发明涉及含有本发明的多核苷酸或者所述多核苷酸 和通过本发明的方法产生的另一抗性基因的载体。如本文所用的术语“载体”指能够运输其所连接的多核苷酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指环状双链DNA环，其中可以连接额外的DNA区段。另一种类型的载 体是病毒载体，其中可用将额外的DNA或者RNA区段连接到病毒基因组中。某些载体(例 如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们所导入的宿主细胞 中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)当引入宿主细胞中时整合到宿主 细胞的基因组，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基 因的表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。通常，重组DNA技术所用的表达载体通常 是质粒形式的。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常用 的形式。然而，本发明意在包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷逆转录 病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们起等价功能。本发明还涉及通常用于基因工程的粘粒、病毒、噬菌粒和其他载体，它们含有 根据本发明的核酸分子。本领域技术人员熟知的方法可以用于构建多种质粒和载体; 见，例如，Sambrook, Molecular Cloning A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N. Y.禾口 Ausube1, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates andffiley Interscience,N. Y. (1989)中描述的技术。备选地,可 以将本发明的核酸分子和载体重构到脂质体中用以递送到靶细胞。在另一实施方案中，本发明的载体或者本发明的方法的特征在于编码Rpi_blb2 蛋白质的多核苷酸或者另一抗性蛋白质有效连接表达控制序列和/或连接编码转基因表 达调节信号的核酸序列，所述调节信号允许在原核或者真核宿主细胞中表达。在优选实施方案中，本发明涉及本发明的载体或者本发明的方法，其中编码 Rpi-blb2蛋白质和/或另一抗性蛋白质的多核苷酸有效连接与所述编码Rpi_blb2蛋白质 和/或另一抗性蛋白质的多核苷酸具有相同物种来源的表达控制序列。对于根据本发明的核酸分子在细胞中表达的情况，原则上可能如此修饰编码序列 使得蛋白质位于植物细胞的任意希望的隔室中。这些隔室包括细胞核、内质网、液泡、线粒 体、质体样造粉体、叶绿体、色质体、质外体、细胞质、细胞外空间、油体、过氧化物酶体和植 物细胞的其他隔室(综述见，Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15，4 (1996)，285-423 和其中 引用的参考文献)。然后多核苷酸可以有效融合适宜的多核苷酸(例如，载体)，其编码用 于转运到所希望的隔室的信号。本发明的另一优选实施方案涉及载体，其中本发明的多核苷酸有效连接表达控制 序列，其允许在原核或真核宿主细胞中表达。此类控制序列的性质取决于宿主生物而不同。 在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，一般 的控制序列包括启动子、终止子和在一些情况中，包括增强子、反式作用子或者转录因子。术语“控制序列”意在至少包括表达必需的组分，并且可以还包括额外的有益组 分。术语“有效连接”指并列，其中所描述的组分处于允许它们以它们的所希望的方式 发挥功能的关系中。“有效连接”编码序列的控制序列以如此方式连接使得在与控制序列相 容的条件下实现编码序列的表达。对于控制序列是启动子的情况，对于技术人员显然的是 使用双链核酸。有效连接将理解为指例如，启动子与待表达的核酸序列和如果适宜，其他调节元 件，如终止子以如此方式顺序排列使得当核酸序列重组表达时，每个调节元件都可以实现其功能，这取决于核酸序列关于有义或者反义RNA的排列。为此，不一定需要化学意义上的 直接键合。遗传控制序列，如增强子序列在距离他DNA分子遥远的位置上也可以对靶序列 发挥它们的功能。优选排列为其中待重组表达的核酸序列位于作为启动子的序列之后，从 而两个序列相互共价连接。启动子序列和待重组表达的核酸序列之间的距离优选小于200 个碱基对，特别优选小于100个碱基对，非常特别优选小于50个碱基对。通过例如在 Maniatis T, Fritsch EF 禾口 Sambrook J(1989)MolecularCloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor(NY),Silhavy TJ, Berman ML 禾口 Enquist Lff(1984)Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor (NY), Ausubel FM等人(1987) Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience 禾口 Gelvin 等 人(1990)Plant Molecular Biology Manual中描述的常规重组和克隆技术可以产生有效 连接和表达盒。然而，作为具有限制酶的特异切割位点的接头，或者作为信号肽的其他序列 也可以位于两个序列之间。序列的插入也可以导致融合蛋白质的表达。优选地，由启动子 和待表达的核酸序列连接组成的表达盒可以以载体整合的形式存在并且可以例如通过转 化插入到植物基因组中。此类调节序列描述于例如，Goeddel :Gene Expression Technology :Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)或参见Gruber禾口Crosby, :Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology,CRC Press,Boca Raton,Florida,编者 Glick和Thomson，第7章，89-108，包括其中的参考文献。调节序列包括指导核苷酸序列在 许多类型宿主细胞中表达的那些序列和指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞或者在某些条 件下表达的那些序列。本领域技术人员将理解表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿 主细胞的选择、所希望的蛋白质的表达水平等因素。可以将本发明的表达载体导入宿主细 胞，从而产生本文描述的多核苷酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白质或者肽。可以设计本发明的重组表达载体用于所述抗性蛋白质，优选Rpi_blb2在原核或 真核细胞中的表达。例如，编码本发明的多核苷酸的基因可以在细菌细胞(如大肠杆菌 (E. coli)、百合棒杆菌(C. glutamicum)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens))、昆 虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母和其他真菌细胞(见Romanos，(1992)，Yeast 8 423-488 ；van den Hondel, (1991) J. W. Bennet&L. L. Lasure，编者，396-428 页Academic Press :San Diego ；禾口 van den Hondel, (1991) :Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy,编者，1-28 页，Cambridge University Press :Cambridge))、藻类(Falciatore 等人，1999，Marine Biotechnology. 1,3 :239_251)和多细胞植物细胞(见 Schmidt, R. (1988), Plant Cell Rep. :583_586) ；Plant Molecular Biology andBiotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, 6/7 $， S. 71-119(1993) ；F. F. White, B. Jenes 等 人，Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, 卷 1，Engineering and Utilization,编 # :Kung 禾口 R. Wu, Academic Press (1993)，128-43 ；Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991)，205-225 (和其中引用的参考文献)或者哺 乳动物细胞中表达。适宜的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression Technology =Methods inEnzymology 185，Academic Press, San Diego, CA (1990)中进一步讨论。备选地，可以在 体外转录和翻译重组表达载体，例如，使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
通常用载体实施蛋白质在原核生物中的表达，所述载体含有指导融合或者非融合 蛋白质表达的组成型或者可诱导的启动子。融合载体向其中编码的蛋白质加入许多氨基 酸，通常加在重组蛋白质的氨基末端，但是也加在C-末端或者与所述蛋白质的适宜区域融 合。此类融合载体通常起三种目的1)增加重组蛋白质的表达；2)增加重组蛋白质的溶解 性；和3)通过作为亲和纯化中的配体帮助纯化重组蛋白质。此外，融合载体可以还编码额 外的蛋白质，其表达支持Rpi_blb2活性的增加或者针对植物病原体的植物抗性的增加，例 如，所述额外的蛋白质为其他抗性蛋白质。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋 白质的接点引入蛋白酶剪切位点以便使得可以在纯化融合蛋白质后分离重组蛋白质与所 述融合部分。此类酶和它们的同族识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX (Pharmacia Biotech Inc ；Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988)Gene 67 :31_40)、pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA)禾口 pRIT5(Pharmacia, Piscataway, NJ)。适宜的可诱导的非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc (Amann (1988) Gene 69 :301_315)禾口 pETlId (Studier 等人’ Gene ExpressionTechnology :Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, C alifornia(1990)60-89。最大化重组蛋白质表达的一种策略是在蛋白酶剪切所述重组蛋白质的能力受损 的宿主细菌中表达所述蛋白质(Gottesman, S, Gene ExpressionTechnology :Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego，California(1990) 119—128)。另一种策略是 改变待插入到表达载体中的核酸的核酸序列从而每个氨基酸的各个密码子是选择用于表 达的细菌(如大肠杆菌或者百合棒杆菌)中优先使用的密码子(Wada等人(1992) Nucleic AcidsRes. 20 :2111_2118)。可以通过标准DNA合成技术实施本发明的核酸序列的此类改 变。此外，载体可以是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(S. cerivisae)中表达 的载体的实例包括 pY印Secl (Baldari，等人，(1987) Embo J. 6 :229_234)、pMFa (Kurjan 和 Herskowitz, (1982)Cell 30 :933_943)、pJRY88 (Schultz 等人，(1987)Gene 54:113-123) 禾口 pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)。优选地，本发明或者本文描述的多核苷酸有效连接植物表达控制序列，例如表达 盒。植物表达盒优选含有能够驱动植物细胞中基因表达的调节序列，并且所述调节序列有 效连接从而每个序列都可以完成其功能，如转录终止，如多腺苷酸化信号。优选的多腺苷酸 化信号为来自根癌农杆菌t-DNA的多腺苷酸化信号，如已知为Ti质粒pTiACH5的章鱼碱合 酶的基因3 (Gielen等人，EMBO J. 3 (1984)，835ff)或者其功能等价物，在植物中具有功能 活性的所有其他终止子也是适宜的。植物基因表达通常不限于转录水平，因为植物表达盒优选含有其他有效连接的序 列，像翻译增强子，如含有来自烟草花叶病毒的5’ -未翻译的前导序列的超驱动序列，其增 强蛋白质/RNA 比率(Gallie 等人，1987，Nucl. Acids Research 15:8693-8711)。因此，本文描述的多核苷酸可以有效连接适宜的启动子，其赋予适时、细 胞或组织特异的方式的基因表达。优选为驱动组成型表达的启动子(Benfey等 人，EMBO J. 8(1989)2195-2202)，像来自植物病毒如 35S CAMV(Franck 等人，Cell 21 (1980) 285-294)、19S CaMV (s 也见 US5352605 和 W08402913)的启动子，或者植物启动子，像US 4962028中描述的来自Rubisco小亚基的启动子。术语“植物特异启动子”理解为指原则上能够控制基因，尤其外来基因在植物、或 植物部分、植物细胞、植物组织或者植物培养物中表达的启动子。在该上下文中，表达可以 为例如，组成型的、可诱导的或者依赖发育的。优选下面的启动子a)组成型启动子优选的载体为使得可以在植物中组成型表达的那些载体(Benfey等人(1989) EMBO J 8:2195-2202)。“组成型”启动子理解为指在植物发育的重要时期内，优选植物 发育的所有阶段，确保在许多，优选所有组织中表达的那些启动子。具体地，优选使用植 物启动子或者来自植物病毒的启动子。尤其优选CaMV花椰菜花叶病毒35S转录物的启 动子(Franck 等人(1980)Cell 21:285_294 ；Odell 等人(1985)Nature 313 :810_812 ； Shewmaker 等人(1985) Virology 140 :281_288 ;Gardner 等人(1986)Plant Mol Biol6 221-228)或者 19S CaMV 启动子(US 5，352，605 ；WO 84/02913 ；Benfey 等人(1989) EMBO J 8:2195-2202)。另一适宜的组成型启动子是“Rubisco小亚基(SSU) ”启动子(US 4，962，028)、豆球蛋白B启动子(GenBank检索号X03677)、农杆菌胭脂氨酸合成酶启动子、 TR二元启动子、农杆菌OCS(章鱼碱合成酶)启动子、泛蛋白启动子(Holtorf S等人(1995) Plant Mol Biol 29 :637_649)、泛蛋白 1 启动子(Christensen等人(1992)Plant Mol Biol 18:675-689 ；Bruce等人(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86 :9692_9696)、Smas启动子、肉 桂醇脱氢酶启动子(US 5，683，439)、液泡ATP酶亚基的启动子或者来自小麦的富含脯氨酸 蛋白质的启动子(W0 91/13991)，和基因的其他启动子，其中所述基因在植物中的组成型表 达是技术人员已知的。b)组织特异性启动子还优选对花药、子房、花、叶、茎干、根和种子具有特异性的启动子。种子特异启动子例如，菜豆蛋白启动子(US5，504, 200 ；Bustos MM 等人(1989)PlantCell 1(9) :839-53)、2S 白蛋白基因启动子(Joseffson LG 等人(1987) J BiolChem 262 12196-12201)、豆球蛋白启动子(ShirsatA 等人(1989)Mol GenGenet 215(2) :326_331)、 USP(未知的种子蛋白质)启动子(Baumlein H等人(1991)Mol Gen Genet 225(3) 459-67)、油菜籽蛋白基因启动子(US5, 608，152 ;Stalberg K 等人(1996)L Planta 199 515-519)、蔗糖结合蛋白质启动子(W0 00/26388)或者豆球蛋白B4启动子(LeB4 ； Baumlein H 等人(1991)Mol Gen Genet 225 :121_128 ;Baeumlein 等人(1992)Plant Journal 2(2) 233-9 ；Fiedler U 等人(1995) Biotechnology (NY) 13 (10) :1090f)、拟南芥 油质蛋白启动子(W0 98/45461)、芸苔(Brassica)Bce4启动子0^091/13980)。其他适宜的 种子特异启动子为编码高分子量麦谷蛋白(HMWG)、麦醇溶蛋白、分枝酶、ADP葡萄糖焦磷酸 酶(AGPase)或者淀粉合酶的基因的启动子。还优选允许在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、 黑麦、稻等中种子特异表达的启动子。可以有利地使用下面的Ipt2或者Iptl基因的启动 子(W095/15389、W0 95/23230)或者WO 99/16890中描述的启动子(大麦醇溶蛋白基因、谷 蛋白基因、水稻素基因、醇溶蛋白基因、麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、 kasirin基因或者裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。
块茎_、贮藏根_、或者根_特异启动子，如I类patatin启动子(B33)、马铃薯组织 蛋白酶D抑制剂启动子。叶特异启动子如马铃薯胞质溶胶FBPase启动子(W097/05900)、马铃薯的Rubisco (核酮糖-1， 5_ 二磷酸羧化酶)SSU (小亚基)启动子或者ST-LSI启动子(Stockhaus等人(1989) EMBO J 8:2445-2451)。非常特别优选的是表皮特异启动子，如OXLP基因(草酸氧化酶样蛋白质) 启动子(Wei 等人(1998)Plant Mol. Biol. 36 :101_112)。花特异启动子例如，八氢番茄红素合酶启动子(W0 92/16635)或者P_rr基因的启动子(W0 98/22593)。花药特异启动子如5126 启动子(US 5，689，049,US 5，689，051)、glob_I 启动子和 Y -玉米醇溶蛋
白启动子。c)化学可诱导的启动子表达盒还可以包含化学可诱导的启动子(综述文章Gatz等人(1997) Armu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48 :89_108)，通过所述启动子可以控制植物中的外源基因 在特定时间点表达。同样可以使用诸如，PRPl启动子(Ward等人(1993)Plant Mol Biol 22 :361-366)、水杨酸可诱导的启动子(W0 95/19443)、苯磺酰胺可诱导的启动子(EP O 388 186)、四环素可诱导的启动子(Gatz等人(1992) Plant J 2 :397_404)、脱落酸可诱导 的启动子(EP O 335 528)或者乙醇或者环己酮可诱导的启动子(W0 93/21334)的启动于。d)胁迫_或者病原体可诱导的启动子其他优选的启动子为通过有生命或者无生命的胁迫可以诱导的启动子，如PRPl 基因的病原体可诱导的启动子(Ward等人(1993)Plant MolBiol 22 :361_366)、番茄高温 可诱导的hsp70或者hsp80启动子(US 5，187，267)、马铃薯低温可诱导的α -淀粉酶启动 子(W0 96/12814)、光可诱导的PPDK启动子，或者创伤可诱导的pinll启动子(ΕΡ375091)。病原体可诱导的启动子包括由于病原体感染诱导的基因的启动子，所述基因为 例如，I3R蛋白质、SAR蛋白质、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等的基因(例如，Redolfi等 人(1983)Neth J Plant Pathol 89 245-254 ；Uknes,等人(1992)The Plant Cell 4 645-656 ；Van Loon(1985)Plant Mol Virol 4 :111_116 ;Marineau 等人(1987)Plant Mol Biol 9 335-342 ；Matton ^A (1987)Molecular Plant-Microbe Interactions 2 325-342 ；Somssich ^ 人(1986)ProcNatl Acad Sci USA 83 :2427_2430 ;Somssich 等 人(1988)MolGen Genetics 2 :93_98 ；Chen 等人(1996) Plant J 10 :955_966 ；Zhang 和 Sing(1994)Proc Natl Acad Sci USA91 2507-2511 ；Warner 等人(1993)Plant J 3 191-201 ；Siebertz 等人(1989) Plant Cell 1 :961_968 (1989)。还包括创伤可诱导的启动子，如pinll基因的启动子(Ryan (1990) AnnRev Phytopath 28 :425_449 ;Duan 等人(1996) Nat Biotech 14 :494_498)、wunl 和 wun2 基因的 启动子(US 5，428，148)、winl 和 win2 基因的启动子(Stanford 等人(1989)Mol Gen Genet 215 :200-208)、系统素的启动子(McGurl 等人(1992) Science 225 1570-1573)、WIPl 基 因的启动子(Rohmeier 等人(1993)Plant Mol Biol 22 :783_792 ;Eckelkamp 等人(1993)FEBS Letters 323 :73_76)、MPI 基因的启动子(Corderok 等人(1994)ThePlant J 6(2) 141-150)等等。e)发育依赖性启动子其他适宜的启动子为例如，果实成熟特异启动子，如番茄果实成熟特异启动子(W0 94/21794、EP 409 625)。发育依赖性启动子部分包括组织特异启动子，因为个体组织本质 上以发育依赖性方式发育。本发明的多肽仅在本文提到的病原体感染或者穿透的组织中具有活性或者具有 增加的活性是有利的。特别优选组成型启动子和叶和/或茎干_特异的、病原体可诱导和 表皮特异的启动子，最优选病原体可诱导的和表皮特异的启动子。还优选天然启动子，其例 如包含在Seq. ID NO. 5和6中描绘的基因组片段中。此外，其他启动子可以有效连接待表达的核酸序列，所述启动子使得可能在其他 植物组织或者其他生物，例如，大肠杆菌细菌中表达。适宜的植物启动子原则上为所有上述 启动子。术语“遗传控制序列”在广义上理解并且指对根据本发明的表达盒的实体化或者 功能具有影响的所有那些序列。例如，遗传控制序列修饰原核或者真核生物中转录和翻译。 优选地，根据本发明的表达盒包含待重组表达的所述核酸序列的5’上游的对胚表皮和/或 花具有特异性的启动子，和3’下游终止子序列作为额外的遗传控制序列和，如果适宜，其他 常规调节元件，在每种情况中，它们都有效连接待重组表达的核酸序列。遗传控制序列还包含其他启动子、启动子元件、或者最小启动子，它们都可以修饰 表达控制性质。从而，例如，由于遗传控制序列，组织特异表达还可以额外地依赖于某些 应激子。已经关于例如，水胁迫、脱落酸(LamE和Chua NH, J Biol Chem 1991 ；266 (26) 17131-17135)和热胁迫(SchofflF 等人，Molecular & General Genetics 217(2-3) 246-53,1989)描述了此类元件。其他有利的控制序列为例如，革兰氏阳性启动子amy和SP02，酵母或者真菌启动 子 ADCl、MFa, AC、P-60、CYCl、GAPDH、TEF、rp28、ADH。原则上，它们的调节序列像上述调节序列的所有天然启动子都可以用于根据本发 明的方法。此外，也可以有利地使用合成启动子。遗传控制序列还包括基因的5’非翻译区、内含子和非编码3’区，如肌动蛋白-1内 含子或者Adhl-S内含子1、2和6(—般参考The MaizeHandbook，第116章，Freeling和 Walbot，编著，Springer, New York(1994))。已经阐明它们在基因表达的调节中起重要作 用。从而，已经阐明5’非翻译序列可以增强异源基因的瞬时表达。可以提及的翻译增强子 的实例为烟草花叶病毒5，前导序列(Gallie等人(1987)Nucl Acids Res 15:8693-8711) 等等。此外，它们可以促进组织特异性(Rouster J等人(1998)Plant J 15:435-440)。表达盒可以有利地包含一个或多个所称作的增强子序列，其有效连接启动子，使 得核酸序列的增强的重组表达成为可能。额外有利的序列，如其他调节序列或者终止子也 可以插入待重组表达的核酸序列的3’末端。基因构建体中可以存在待重组表达的核酸序 列的一个或多个拷贝。在一个实施方案中，使用Seq ID No. :5和/或6中描绘的基因组片段中包含的天 然终止子序列。
适宜作为控制序列的多腺苷酸化信号为植物多腺苷酸化信号，优选基本上相应于 来自根癌农杆菌的T-DNA多腺苷酸化信号的多腺苷酸化信号，尤其Ti质粒pTiACHS (Gielen 等人(1984)EMB0 J3 :835et seq.)的T-DNA(章鱼碱合酶)3’的基因或者其功能等价物。 特别适宜的终止子序列的实例是OCS(章鱼碱)终止子和NOS(胭脂碱合酶)终止子。控制序列还进一步被理解为使得可以同源重组或者插入到宿主生物的基因组或 者允许从基因组除去的控制序列。对于同源重组，例如，具体基因的天然启动子可以与对胚 表皮和/或花具有特异性的启动子交换。诸如cre/lox技术的方法允许组织特异性，如果 适宜可诱导地从宿主生物的基因组除去表达盒(Sauer B (1998)Methods. 14(4) :381_92)。 在该方法中，特定侧翼序列(Iox序列)附着到靶基因，所述侧翼序列以后允许通过ere重 组酶除去。表达盒和从其衍生的载体可以包含其他功能元件。术语功能元件将在广义上理解 并且指对根据本发明的表达盒、载体或者转基因生物的产生、扩增或功能具有影响的所有 那些元件。作为实例但不作为限制，可以提及下面的a)选择标记，其赋予对代谢抑制剂，诸如2-脱氧葡萄糖_6_磷酸(W098/45456)、 抗生素或者杀生物剂，优选除草剂，如卡那霉素、G418、博来霉素或者潮霉素，或者膦丝菌素 等等的抗性。特别优选的选择标记是赋予除草剂抗性的那些选择标记。可以提及的实例 为编码膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)和失活谷氨酰胺合酶抑制剂(bar和pat基因)的 DNA序列；5-烯醇-丙酮酸基莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSN合酶基因)，其赋予对草苷膦 (N-(膦酰基甲基)甘氨酸)的抗性；gox基因，其编码草苷膦降解酶(草苷膦氧化还原酶)； deh基因(编码失活茅草枯的脱卤素酶)；失活磺酰脲和咪唑啉酮的乳酸乙酰合酶；和bxn 基因，其编码降解溴草腈的腈水解酶；aasa基因，其赋予对抗生素apectinomycin的抗性； 链霉素磷酸转移酶(SPT)基因，其允许对链霉素的抗性；新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因， 其赋予对卡那霉素或者geneticidin的抗性；潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因，其介导对潮霉 素的抗性；乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其赋予对磺酰脲除草剂的抗性(例如，具有S4和/或 Hra突变的突变ALS变体)。b)报道基因，其编码容易定量的蛋白质和，通过它们的颜色或者酶活性，使得可能 评估转化功效、表达部位或者表达时间。在该上下文中非常特别优选的是编码报道蛋白的 基因(Schenborn E,Groskreutz D. MolBio-technol. 1999 ；13(1) 29-44)，所述报道蛋白为 例如，绿色荧光蛋白(GFP) (Sheen 等人(I995)Plant Journal 8(5) :777_784 ;Haseloff■等 A (1997)Proc Natl Acad Sci USA 94(6) :2122_2127 ；Reichel 等人(1996)Proc NatlAcad Sci USA 93(12) :5888_5893 ；Tian等人(1997)Plant Cell Rep 16 :267_271 ；WO 97/41228 ； Chui WL等人(1996) Curr Biol 6 325-330 ；Leffel SM等人(1997) Biotechniques. 23 (5) 912-8)、氯霉素转移酶、萤光素酶(Ow等人(1986) Science 234 :856_859 ；Millar等人 (1992)Plant Mol Biol Rep 10 :324_414)，和水母发光蛋白基因(Prasher 等人(1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3) 1259-1268), β -半乳糖苷酶 R 基因座基因(其编 码调节植物组织中产生花色素苷色素(红色)的蛋白质从而使得可以直接分析启动子活 性而不加入额外的辅助物质或者显色底物；Dellaporta等人Chromosome Structure and Function Impact of NewConcepts,18th Stadler Genetics Symposium,11 :263_282, 1988)，特别优选 β -葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson 等人，EMBO J. 1987，6，3901-3907)。
c)复制起点，其确保根据本发明的表达盒或者载体在例如大肠杆菌中的扩增。所 提及的实例为 ORI (DNA 复制起点)、pBR322ori 或者 P15A ori (Sambrook 等人=Molecular Cloning. A Laboratory Manual,第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。d)农杆菌介导的植物转化必需的元件，如T-DNA或者vir区的右边界或者左边界。为了选择成功经历同源重组的细胞，或者选择经转化的细胞，通常必须还导入选 择标记，其赋予已经成功经历重组的细胞对杀生物剂(例如，除草剂)、代谢抑制剂(如 2_脱氧葡萄糖-6-磷酸(W0 98/45456))或者抗生素的抗性。选择标记允许从未转化的细 胞选择转化的细胞(McCormick 等人(1986)Plant Cell Reports 5:81-84)。可以有利地使用包含表达盒的载体实现根据本发明的表达盒向生物或者其细胞、 组织、器官、部分或者种子的导入(优选导入植物或植物细胞、组织、器官、部分或者种子 中)。可以通过适宜的限制性切割位点将表达盒导入载体(例如，质粒)中。首先将所形成 的质粒导入大肠杆菌中。选择、生长正确转化的大肠杆菌并通过技术人员熟悉的方法得到 重组质粒。限制性分析和测序可以用于验证克隆步骤。用于在特定植物部分中表达的其他启动子为例如，来自油菜籽的油菜籽蛋白 基因启动子、来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(Baeumlein等人，Mol Gen Genet, 1991，225 (3) :459_67)、来自拟南芥的油质蛋白启动子(W09845461)、来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子(US5504200)，来自芸苔的Bce4_启动子(W09113980)或者豆 球蛋白 B4 启动子(LeB4 ；Baeumlein 等人，1992，Plant Journal, 2 (2) :233_9)以及在像玉 米、大麦、小麦、黑麦、稻等的单子叶植物中赋予种子特异表达的启动子。所提及的适宜启动 子为来自大麦的Ipt2或者Iptl基因启动子(W09515389和W09523230)或者在W09916890 中描绘的那些启动子(来自大麦醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻醇溶蛋白 基因、小麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高 梁kasirin基因、黑麦黑麦醇溶蛋白基因的启动子)。此外，可以将本发明的多核苷酸以反义方向克隆到表达载体中。即，DNA分子有效 连接调节序列，所述连接的方式允许表达(通过DNA分子的转录)本发明的多核苷酸编码 的mRNA反义的RNA分子。可以选择有效连接以反义方向克隆的核酸的调节序列，其指导所 述反义RNA分子在多种细胞类型中连续表达，例如，可以选择指导反义RNA的组成型、组织 特异的或者细胞类型特异表达的病毒启动子和/或增强子，或调节序列。反义表达载体可 以为重组质粒、噬菌粒或者减毒病毒的形式，其中所产生的反义核酸分子处于高效率调节 区的控制下，所述调节区的活性可以通过确定载体所导入的细胞类型确定。关于使用反义 基因调节基因表达的讨论，见Weintraub，H.等人，Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1 (1) 1986 禾口 Mol 等人，1990, FEBS Letters268 :427_430。在一个实施方案中，本发明涉及产生重组宿主细胞的方法，其包括向宿主细胞导 入本发明的载体或者多核苷酸或者所述载体或所述多核苷酸和表达另一种抗性蛋白质的 载体。可以通过常规转化或转染技术向原核或真核细胞导入载体DNA。本文所用的术语 “转化”和“转染”、接合和转导意在指多种本领域已知的将外源核酸(例如，DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、天然感受态、 化学介导的转移，或者电穿孔。转化或者转染宿主细胞(包括植物细胞)的适宜的方法可 以参见 Sambrook，等人(Molecular Cloning :A Laboratory Manual.第二片反，ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press， ColdSpring Harbor， NY, 1989)和其他实验室手册，如 Methods in MolecularBiology，1995，卷 44，Agrobacterium protocols，编者Gar land 禾口 Davey，Humana Press，Totowa, New Jersey。为了稳定转染真核细胞，已知取决于所用的表达载体和转染技术，仅一小部分细 胞可以将外来DNA整合到它们的基因组。为了鉴定和选择这些整合体，通常将选择性标记 (例如，对抗生素的抗性)随目的基因导入宿主细胞。优选的选择性标记包括赋予对药物 (如G418、潮霉素和氨甲蝶呤)抗性的那些选择性标记或者在植物中为赋予对除草剂如草 苷膦或草铵膦的抗性的选择性标记。可以将编码选择性标记的核酸导入宿主细胞中与编码 本发明多肽相同的载体上或者导入单独的载体。用所导入的核酸稳定转染的细胞可以通 过例如，药物选择鉴定(例如，具有所掺入的选择性标记基因的细胞将存活，而其他细胞死 亡)。可以产生其他宿主细胞，其含有允许所导入的基因的受调节的表达的选择系统。 例如，将本发明的多核苷酸包括在载体中处于Iac操纵子控制下允许仅在存在IPTC时表达 该多核苷酸。此类调节系统是本领域公知的。优选地，所导入的核酸分子是宿主细胞外来的。“外来的”指核酸分子关于宿主细胞是异源的，这意味着来自具有不同基因组背景 的细胞或者生物，或者所述核酸分子关于宿主细胞是同源的但是位于不同于所述核酸分子 的天然发生的对应物的基因组环境中。这意味着，如果核酸分子关于所述宿主细胞是同源 的，其不位于所述宿主细胞的基因组中的天然位置，尤其它被不同的基因包围。在该情况 中，核酸分子可以处于其自身启动子控制下或者处于异源启动子控制下。宿主细胞中存在 的根据本发明的载体或者核酸可以整合到宿主细胞的基因组或者可以以某种形式保持在 染色体外。在该方面，还理解本发明的核酸分子可以用于通过同源重组恢复或者产生突变 基因(Paszkowski (编者)，HomologousRecombination and Gene Silencing in Plants. Kluwer Academic Publishers (1994))。因此，在另一实施方案中，本发明涉及用本发明的多核苷酸或者本发明的载体，或 者用所述载体或所述多核苷酸和用于表达另一种抗性蛋白质的载体或者多核苷酸基因工 程化的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中互换使用。将理解此类术语不仅指 具体受试者细胞，而且指此类细胞的后代或者潜在后代。因为由于某些突变或者环境影响， 在连续世代中可以发生某些修饰，所以此类后代可能实际上不与亲代细胞相同，但是仍然 包括在本文所用的术语的范围内。例如，可以将本发明的多核苷酸导入细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞或者哺乳动物 细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或者COS细胞)、藻类、纤毛虫、植物细胞或者真菌中。适 宜的宿主细胞是本领域技术人员已知的。优选大肠杆菌、杆状病毒、农杆菌或者植物细胞。此外，还可以转化宿主细胞从而(过)表达其他酶和蛋白质，所述表达支持植物对 病原体抗性的增加。优选地，还表达另一抗性基因，优选还表达一种或多种抗性基因，优选本文提及的基因。最优选地是Rpi_blb2和Rpi-blb的共表达。进一步优选的是本文提及的植物之一，尤其上面提及的茄科植物之一的细胞，最 优选马铃薯、番茄、矮牵牛、树番茄、pear melon或者茄子的细胞。在另一实施方案中，本发明涉及产生本发明的多肽，尤其具有Rpi_blb2活性的蛋 白质的方法，其包括培养本发明的宿主细胞并从培养基或细胞回收所述多核苷酸编码并且 宿主细胞表达的所述多肽。术语“表达”指在细胞中产生蛋白质或者核苷酸序列。然而，所述术语还包括在无 细胞体系中表达蛋白质。它包括从编码产物的DNA转录成RNA产物，转录后修饰和/或翻 译成蛋白质产物或者多肽，以及可能的翻译后修饰。取决于所用的特定构建体和条件，可用从细胞、培养基或者两者回收蛋白质。对于 本领域技术人员，公知不仅可以表达天然蛋白质，而且可以表达作为融合多肽的蛋白质或 者加入指导蛋白质到达宿主细胞的特定隔室，例如，确保蛋白质分泌到培养基等等的信号 肽。此外，此类蛋白质和其片段可以经化学合成和/或根据例如下文描述的标准方法修饰。本发明的宿主细胞，如培养中的原核或者真核宿主细胞可以用于产生(即表达) 本发明的多核苷酸编码的多肽，优选具有Rpi_blb2活性的多肽。此外，通过电穿孔或者农 杆菌介导的基因转移通过直接转移DNA到正发育的花中也可以应用备选方法。因此，本发 明还提供了使用本发明的宿主细胞产生Rpi-blb2的方法。在一个实施方案中，所述方法包 括在适宜的培养基中培养本发明的宿主细胞从而产生本发明的多肽。此外，所述方法包括 从培养基或者宿主细胞分离和/或回收所述多肽。优选通过重组DNA技术产生本发明的多肽。例如，将编码蛋白质的核酸分子克隆 到表达载体(如上述)中，将表达载体导入宿主细胞(如上述)并且在该宿主细胞中表达 所述多肽。然后通过适宜的纯化方案，使用标准蛋白质纯化技术从细胞分离所述多肽。重 组表达的备选方案是可以使用标准肽合成技术化学合成本发明的多肽或者肽。此外，例如， 使用下文描述的本发明的抗体，尤其抗Rpi_blb2抗体从细胞(例如，内皮细胞)分离天然 Rpi-blb2，通过标准技术，使用本发明的多肽或者其片段，即本发明的多肽可以产生所述抗 体。在一个实施方案中，本发明涉及Rpi_blb2蛋白质或者具有Rpi_blb2活性的蛋白质。在一个实施方案中，本发明涉及具有本发明的多核苷酸编码的氨基酸序列或者可 以通过本发明的方法得到的多肽。在一个实施方案中，所述多肽不由Seq. ID NO. :8禾Π /或10中描绘的序列组成和 /或不由Seq. ID NO. :7和/或9中描绘的核酸分子编码的序列组成。在一个实施方案中，本发明的多肽不由Mil. 1或者Mil. 2蛋白质的序列组成和/ 或不由编码Mil. 1或者Mil. 2蛋白质的核酸分子编码的蛋白质组成。从而，在一个实施方案中，本发明的多肽可以不由Rossi等人1998，PNAS USA 95 9750-9754，Milligan 等人，1998. Plant Cell 10 1307-1319 ；和 / 或 WO 9806750 中所示的 序列组成。用于本申请中的术语“蛋白质”和“多肽”是可以互换的。“多肽”指氨基酸的聚合 物(氨基酸序列)并且不涉及分子的特定长度。从而多肽的定义中包括肽和寡肽。该术语还指或者包括多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等等。所述定义包括例如， 含有氨基酸的一个或多个类似物(包括例如，非天然氨基酸等等)的多肽、具有取代的连接 的多肽，以及本领域已知的天然发生和非天然发生的其他修饰。优选地，所述多肽是分离的。“分离的”或者“纯化的”蛋白质或者其生物活性部分 当通过重组DNA技术产生时基本上细胞材料，或者当化学合成时基本上无化学前体或者其 他化学品。术语“基本上无细胞材料”包括本发明多肽的制备物，其中所述蛋白质与天然或者 重组产生该蛋白质的细胞中的细胞组分分离。在一个实施方案中，术语“基本上无细胞材 料”包括具有小于约30% (按照干重)“污染性蛋白质”，更优选小于约20% “污染性蛋白 质”，更优选小于约10% “污染性蛋白质”，最优选小于约5% “污染性蛋白质”的制备物。 术语“污染性蛋白质”涉及不是本发明的多肽的多肽。当重组产生本发明的多肽或者其生 物活性部分时，还优选基本上无培养基，即，培养基为蛋白质制备物体积的约20%以下，更 优选约10%以下，最优选约5%以下。术语“基本上无化学前体或者其他化学品”包括制备 物，其中本发明的主题，例如，本发明的多肽与涉及该蛋白质合成的化学前体或者其他化学 品分离。术语“基本上无化学前体或者其他化学品”包括制备物，其具有小于约30% (按干 重计)化学前体或者非Rpi_blb2化学品，更优选小于约20%化学前体或者非Rpi-blb2化 学品，更优选小于约10%化学前体或者非Rpi-blb2化学品，最优选小于约5%化学前体或 者非Rpi-blb2化学品。在优选实施方案中，分离的蛋白质或者其生物活性部分缺少污染性 蛋白质，其中所述污染性蛋白质与本发明的多肽来自相同生物。通常，通过重组DNA技术产 生此类蛋白质。本发明的多肽或者其部分可以优选包含与SEQID No :2或4的氨基酸序列足够同 源的氨基酸序列，从而所述蛋白质或者其部分保持赋予本发明的抗性的能力。所述蛋白质 的部分优选为本文描述的生物活性部分。优选地，本发明的多肽具有与SEQID No :2或4中 所示相同的氨基酸序列。此外，所述多肽可以具有由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述 核苷酸序列与本发明的多核苷酸的核苷酸序列杂交，优选在上文描述的严格杂交条件下杂 交。因此，所述多肽具有核苷酸序列编码的氨基酸序列，其与SEQ IDNo 2或4的氨基酸序 列之一具有至少约70 %，优选至少约75 %，更优选至少约80 %、90 %、95 %，甚至更优选至 少约96%、97%、98%、99%或以上的同源性。本发明的优选的多肽优选具有本文描述的至 少一种Rpi-blb2蛋白质活性，例如，其抗性或者免疫活性。本发明的优选多肽包括核苷酸 序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与SEQID No :1或3或5或6的核苷酸序列杂交， 优选在严格条件下与所述核苷酸序列杂交，或者与所述核苷酸序列同源(如上定义的)。因此，如本文详述，本发明的多肽可以由于天然变异或者诱变在氨基酸序列中与 SEQID No :2或4不同。因此，所述多肽可以包含与SEQ ID No 1或3或5或6的完整氨 基酸至少约70 %，优选至少约75 %，更优选至少约80 %、90 %、95 %，最优选至少约96 %、 97%、98%、99%或以上同源的氨基酸序列。本发明多肽的生物活性部分包括包含来源于Rpi_blb2蛋白质的氨基酸序列的氨 基酸序列，例如，SEQ ID No :2或4中所示的氨基酸序列或者与其同源的蛋白质的氨基酸序 列，其包括的氨基酸少于全长Rpi_blb2蛋白质的氨基酸或者少于如下全长蛋白质的氨基 酸，所述全长蛋白质与本文描绘的Rpi-blb2蛋白质同源并且显示出Rpi_blb2蛋白质的至少一种活性。通常，生物(或者免疫学)活性部分，即肽，例如，长为5、10、15、20、30、35、36、 37、38、39、40、50、100或更多氨基酸的肽包含具有Rpi_blb2蛋白质的至少一种活性或表位 的结构域或者基序。此外，其中缺失多肽的其他区域的其他生物活性部分可以通过重组技 术制备并且评估本文描述的一种或多种活性。本发明的Rpi_blb2多核苷酸的操作可以导致产生具有与野生型Rpi_blb2蛋白质 功能不同的Rpi_blb2。这些蛋白质可以在效率或者活性方面得到提高，可以以比通常更大 的数目存在于细胞中，或者效率或活性减小。Rpi-blb2的诱变策略导致所述化合物的所述抗性增加或者对另一种植物病原体 种或者前述提到的植物病原体种的另一种株系的抗性增加，所述诱变策略不意在限制；这 些策略的变通方案是本领域技术人员显而易见的。使用此类策略，并且整合本文公开的机 制，可以用本发明的多核苷酸和多肽产生植物或其部分，其表达野生型Rpi_blb2或者突变 的Rpi-blb2多核苷酸和蛋白质分子从而所希望的化合物的生产的产率、产量和/或效率提 高了。该所希望的化合物可以是植物的任意天然产物，其包括生物合成途径的终产物和天 然发生的代谢途径的中间物，以及在所述细胞的代谢中不天然发生的分子，但是其通过本 发明的所述细胞产生。本发明还提供了嵌合或融合蛋白质。本文所用的“嵌合蛋白质”或者“融合蛋白质”包含有效连接非Rpi_blb2多肽的 多肽。"Rpi-blb2多肽”指具有相应于具有Rpi_blb2活性的多肽的氨基酸序列的多肽， 而“非Rpi-blb2多肽”指具有相应于不基本上同源于Rpi-blb2的蛋白质的氨基酸序列的多 肽，例如，不赋予本文描述的抗性，尤其不赋予对致病疫霉抗性和来源于相同或不同生物的 蛋白质。在融合蛋白质中，术语“有效连接”意在表示Rpi_blb2多肽和非Rpi-blb2多肽相 互融合，从而两条序列都完成所用序列的计划的功能。非Rpi-blb2多肽可以与Rpi-blb2多 肽的N-末端或者C-末端融合。例如，在一个实施方案中，融合蛋白质是GST-LMRP融合蛋白 质，其中Rpi_blb2序列融合GST序列的C-末端。此类融合蛋白质可以方便重组Rpi_blb2 的纯化。在另一实施方案中，融合蛋白质是在其N-末端含有异源信号序列的Rpi-blb2。在 某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，通过使用异源信号序列可以增加Rpi_blb2 的表达和/或分泌。优选地，通过标准重组DNA技术产生本发明的Rpi_blb2嵌合或者融合蛋白质。例 如，根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段连接在框内，例如，通过平末端或者交错 末端用于连接，用限制酶消化以提供适宜的末端，如果适宜，填充粘性末端，碱性磷酸酶处 理以避免不希望的连接，和酶连接。通过常规技术(包括自动化DNA合成仪)可以合成融 合基因。备选地，可以用锚定引物实施基因片段的PCR扩增，所述引物在两个连续基因片 段之间形成互补突出端，所述基因片段可以随后退火并再扩增产生嵌合基因序列(见，例 如，Current Protocols in Molecular Biology，编者Ausubel 等人，John Wiley&Sons 1992)。此外，可以通过商业途径得到已经编码融合部分(例如，GST多肽)的许多表达载 体。可以将本发明的多核苷酸克隆到此类表达载体中从而融合部分在框内连接所编码的蛋 白质。此外，使用适宜的计算机程序可以进行本发明蛋白质的结构基序的折叠模拟和计算机再设计(Olszewski，Protein 25 (1996)，286-299 ；Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995)，675-679)。蛋白质折叠的计算机建模可以用于详细的肽和蛋白质模 型的构象和能量分析(Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012 ；Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995)，37-45)。具体地，可以用适宜的程序鉴定促有丝分裂的cyplin及其受体 的相互作用位点，并通过互补肽序列的计算机辅助搜索鉴定它的配体或者其他相互作用蛋 白质(Fassina，Immunomethods (1994)，114-120。用于设计蛋白质和肽的其他适宜的计算 机系统描述于现有技术，例如，Berry, Biochem, Soc. Trans. 22(1994), 1033-1036 ；ffodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987)，1-13 ；Pabo，Biochemistry 25 (1986)，5987-5991。从上述计 算机分析得到的结果可用于例如，制备本发明蛋白质或者其片段的肽模拟物。所述蛋白质 的天然氨基酸序列的此类假肽类似物可以非常有效地模拟母蛋白质(Benkirane，J.Biol. Chem. 271 (1996)，33218-33224)。例如，容易得到的非手性Q-氨基酸残基向本发明蛋白质 或者其片段的掺入导致脂肪族链的聚亚乙基单位对酰胺键的取代，从而提供构建假肽的方 便的策略(Banerjee, Biopolymers 39 (1996)，769—777)。在现有技术中描述了其他系统中小肽激素的强效肽模拟类似物(Zhang，Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996)，327-331)。通过连续酰胺烷基化合成肽模拟物组合文库， 并测试所得化合物的例如，结合和免疫活性，也鉴定了本发明蛋白质的适宜的肽模拟物。产 生和使用肽模拟物组合文库的方法在现有技术，例如，在OstreshJethods in Enzymology 267 (1996)，220-234 和 Dorner，Bioorg. Med. Chem. 4 (1996)，709-715 中描述。此外，可以用本发明蛋白质的三维和/或晶体结构设计本发明蛋白质的生物活性 的肽模拟物抑制剂(Rose，Biochemistry 35 (1996)，12933-12944 ；Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4(1996)，1545-1558)。在另一实施方案中，本发明涉及特异结合本发明的多肽或者部分，即此类蛋白质 的特定片段或者表位的抗体。本发明的抗体可以用于鉴定和分离任意生物中的Rpi-blb和基因，优选以本文中 描述的植物制备的植物中的Rpi-blb和基因。这些抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体或 者合成抗体以及抗体片段，如Fab、Fv或者ScFv片段等等。例如，通过最初在K5hler和 Milstein, Nature 256 (1975)，495，和 Galfr6, Meth. Enzymo 1. 73(1981)，3 中描述的技术制 备单克隆抗体，所述技术包括将小鼠骨髓瘤细胞与来自经免疫的哺乳动物的脾细胞融合。此夕卜，通过使用例如，Harlow 禾口 Lane" Antibodies, A LaboratoryManual" ，CSH Press, Cold Spring Harbor，1988中描述的方法可以得到针对前述肽的抗体或者其片段。 这些抗体可以例如，用于根据本发明的蛋白质的免疫沉淀和免疫定位，以及用于监视例如， 重组生物中此类蛋白质的合成，和用于鉴定与根据本发明的蛋白质相互作用的化合物。例 如，用于BlAcore系统中的表面等离子体共振可以用于增加噬菌体抗体选择的效率，从 结合本发明蛋白质表位的噬菌体抗体的单个文库产生亲和力的高度增加(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7 (1996),97-105 ；Malmborg, J. Immunol. Methods 183(1995), 7-13)。在许多情况中，抗体对抗原的结合现象等价于其他配体/抗配体结合。在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的多肽的互补序列的反义核酸分子。修饰表达水平和/或活性的方法是本领域技术人员已知的并且包括例如过表达、 共抑制、使用核酶、有义和反义策略、基因沉默方法。“有义链”指双链DNA分子的链，其与其mRNA转录物同源。“反义链”含有与“有义链”的序列互补的倒置序列。“反义”核酸分子包含与编码蛋白质的“有义”核酸分子互补，例如，与双链cDNA分 子的编码链互补或者与mRNA序列互补的核苷酸序列。因此，反义核酸分子可以通过氢键结 合有义核酸分子。反义核酸分子可以与整个Rpi_blb2编码链互补，或者仅与其一部分互 补。因此，反义核酸分子可以为本发明多核苷酸的核苷酸序列的编码链的“编码区”的反义 序列。术语“编码区”指包含密码子的核苷酸序列区，所述密码子翻译成氨基酸残基。此外， 反义核酸分子是编码Rpi_blb2的核苷酸序列的编码链的“非编码区”反义的。术语“非编码 区”指编码区侧翼的5’和3’序列，其不翻译成多肽，即也称作5’和3’非翻译区(5’ -UTR 或者 3’ -UTR)。考虑到编码本文公开的Rpi_blb2的编码链序列，可以根据Watson和Crick碱基 配对法则设计本发明的反义核酸分子。反义核酸分子可以与Rpi_blb2mRNA的完整编码区 互补，但是也可以是与Rpi_blb2mRNA的编码或者非编码区的仅一部分反义的寡核苷酸。例 如，反义寡核苷酸可以与Rpi_blb2mRNA的翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸可 以长为例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50个核苷酸。使用化学合成和酶促连接 反应，用本领域公知的方法可以构建本发明的反义核酸分子。例如，使用天然发生的核苷 酸或者设计用于增加分子的生物学稳定性或者增加反义和有义核酸之间形成的双链体的 物理稳定性的多种经修饰的核苷酸可以化学合成反义核酸分子(例如，反义寡核苷酸)，例 如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。经修饰的核苷酸的实例可以用于产 生反义核酸，包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、
4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基-氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧 基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、日-0-半乳糖基(11^0&1^、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、 1-甲基鸟嘌呤、1-甲基-肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲 基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基 氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基que0Sine、5’ -甲氧基羧基甲基-尿嘧啶、5-甲氧 基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(ν)、wybutoxosine、假 尿嘧啶、q ue0Sine、2-巯基胞嘧啶、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2_硫代-尿嘧啶、4_硫尿嘧啶、
5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基-乙酸(ν)、5_甲基-2-硫尿嘧 啶、3-(3_氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)W、和2，6_ 二氨基嘌呤。备选地，可以使 用表达载体通过生物学方法产生反义核酸，其中已经以反义方向将多核苷酸亚克隆到所述 表达载体(即，从所插入的多核苷酸转录的RNA将为与目的靶多核苷酸反义方向，在下面的 小节中进一步描述)。通常将本发明的反义核酸分子施用于细胞或者原位产生从而它们与编码 Rpi-blb2的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或者结合，从而例如，通过抑制转录和/或翻 译抑制蛋白质的表达。杂交可以通过常规核苷酸互补形成稳定的双链体，或者例如，对于结 合DNA双链体的反义核酸分子，通过双螺旋的大沟中的特异相互作用。可以修饰反义分子 从而其特异结合表达于所选细胞表面上的受体或者抗原，例如，通过将反义核酸分子连接 到结合细胞表面受体或者抗原的肽或者抗体实现所述特异结合。使用本文描述的载体也可 以递送反义核酸分子。为了实现反义分子的足够细胞内浓度，优选其中反义核酸分子置于 强原核生物、病毒或者真核生物(包括植物)启动子的控制下的载体构建体。
在另一实施方案中，本发明的反义核酸分子可以是异头核酸分子。α-异头核酸分 子与互补RNA形成特异双链杂合分子，其中与常规单位相反，所述链相互平行(Gaultier等 人(1987) Nucleic Acids. Res. 15 :6625_6641)。反义核酸分子还可以包含2’_0_甲基-核 糖核苷酸(Inoue 等人(1987) NucleicAcids Res. 15 :6131_6148)或者嵌合的 RNA-DNA 类似 物(Inoue 等人(1987)FEBS Lett. 215 :327_330)。此外，本发明的反义核酸分子可以是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化 性DNA分子，其能够切割与其有互补区的单链核酸，如mRNA。从而，核酶(例如，锤头核酶 (在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334:585-591)中描述)可以用于催化性切割 Rpi-blb2mRNA转录物从而抑制mRNA的翻译。可以基于本文公开的Rpi_blb2cDNA的核苷酸 序列或者基于将根据本发明中教导的方法分离的异源序列设计对编码Rpi_blb2的核酸分 子具有特异性的核酶。例如，可以构建四膜虫L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷 酸序列与编码mRNA中待切割的核苷酸序列互补。见，例如，Cech等人美国专利号4，987,071 和Cech等人美国专利号5，116，742。备选地，可以用Rpi_blb2mRNA从RNA分子库选择具有 特异核糖核酸酶活性的催化性RNA。见，例如，Bartel，D.和Szostak，J. W. (1993) Science 261 :1411-1418。本发明的反义分子还包含多核苷酸，其包含与Rpi_blb2核苷酸序列的调 节区(例如，其启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，例如，以形成三螺旋结构，其防 止靶细胞中基因的转录。一般见，Helene, C. (1991)Anticancer Drug Des. 6(6) :569_84 ； Helene, C.等人(1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660 :27_36 ；和 Maher, L. J. (1992) Bioassays 14(12) :807-15。此外，在一个实施方案中，本发明涉及产生转基因植物、植物细胞或者植物组织 的方法，其包括将本发明的多核苷酸或者载体导入所述植物、植物组织或者植物细胞的基 因组。在优选实施方案中，所述载体或者所述多核苷酸在用于表达另一抗性基因，尤其 Rpi-blb的载体或多核苷酸之前、之后或一起导入所述植物、植物组织或者植物细胞的基因组。为了在植物细胞中以有义或者反义方向表达根据本发明的核酸分子，将分子置于 确保在植物细胞中表达的调节元件的控制下。这些调节元件可以关于待表达的核酸分子以 及关于待转化的植物种类是异源或同源的并且在上文中详细描述。通常，此类调节元件包含在植物细胞中有活性的启动子。为了得到转基因植物 的所有组织中的表达，例如，使用组成型启动子，如CaMV的35S启动子(Odell，Nature 313 (1985)，810-812)或者玉米的聚泛蛋白(polyubiquitin)基因的启动子(Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982)，675-689)。为了实现转基因植物中特定组织的表达，可能使用 组织特异启动子(见，例如，Stockhaus, EMBO J. 8 (1989)，2245-2251)。还已知在马铃薯的 块茎或者不同植物种，如玉米、蚕豆、小麦、大麦等的种子中具有特异活性的启动子。可以用 诱导型启动子以便能够精确控制表达。诱导型启动子也包含通过植物的感染诱导的启动 子。其他实施方案在上文描述。在一个实施方案中，本发明涉及产生抗卵菌门病原体的植物或其部分的方法，其 包括步骤在植物或其部分中表达本发明的多肽和另一抗性蛋白质。因此，在另一实施方案中，本发明涉及本发明的或者根据本发明方法产生的转基 因植物或植物组织，其当存在所述多核苷酸或载体时抗所述病原体。
经转化的生物(或者转化的细胞或组织)的产生需要向相关宿主细胞导入所述 DNA、RNA或者蛋白质。许多方法可用于该步骤，其称作转化(或者转导或转染)(Keown等 人(1990)Methods in Enzymology 185:527-537)。例如，通过微注射或者用DNA包被的微 粒轰击可以直接导入DNA或RNA。而且，例如，使用聚乙二醇可以化学透化细胞，从而DNA可 以通过扩散进入细胞。还可以通过原生质体与其他含有DNA的单位，如小细胞(minicell)、 细胞、溶菌酶或者脂质体融合导入DNA。导入DNA的另一种适宜的方法是电穿孔，其中通 过电脉冲可逆地透化细胞。已经描述了适宜的方法(例如，Bilang等人(1991)Gene 100 247-250 ；Scheid 等人(1991)Mol Gen Genet 228 :104_112 ；Guerche 等人(1987)Plant Science 52 :111_116 ;Neuhause 等人(1987)Theor Appl Genet 75 :30_36 ;Klein 等人
(1987)Nature327 :70_73 ；Howell 等人(1980)Science 208 1265 ；Horsch 等人(1985) Science 227 :1229_1231 ;DeBlock 等人(1989)Plant Physiology 91 694-701 ；Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach 禾口 Weissbach,编著)Academic Press Inc.
(1988)；禾口Methods in Plant MolecularBiology (Schuler 禾口 Zielinski，编著)Academic Press Inc. (1989))。在植物中，上述从植物组织或植物细胞转化和再生植物的方法用于瞬时和稳定转 化。适宜的方法特别为通过聚乙二醇诱导的DNA摄入的原生质体转化、使用基因枪的生物 射弹方法(其也称作微粒轰击方法)、电穿孔、将干燥胚胎在含有DNA的溶液中孵育，和微注 射。除了这些“直接”转化技术，通过根癌农杆菌或者毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的细菌感染也可以实现转化。农杆菌介导的转化最适于双子叶植物细胞。所 述方法由例如，Horsch RB 等人(1985) Science225 :1229f 描述。当使用农杆菌时，表达盒必需整合到特定质粒中，可以整合到穿梭载体或者中间 载体，或者整合到双元载体中。如果用Ti或者Ri质粒进行转化，Ti或者Ri质粒T-DNA的 至少右边界，但是在多数情况中，右边界和左边界以侧翼区的形式连接待导入的表达盒。优选使用双元载体。双元载体能够在大肠杆菌和农杆菌中复制。通常，它们包含 选择标记基因和接头或多接头，其侧翼是右和左T-DNA边界序列。可以将它们直接转移到 农杆菌中(Holsters等人(1978)Mol Gen Genetl63 181-187)。选择标记基因允许选择所 转化的农杆菌并且为，例如，nptll基因，其赋予对卡那霉素的抗性。作为宿主生物的农杆 菌在该情况中应该已经含有具有vir区的质粒。vir区是将T-DNA转移到植物细胞所需的。 以这种方法转化的农杆菌可以用于转化植物细胞。T-DNA用于转化植物细胞的用途已经详 细研究禾口描述(EP 120516 ；Hoekema, The Binary PlantVector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V.，Alblasserdam, V 章；An 等人(1985) EMBO J 4 :277_287)。多种双元载 体是已知的，它们的一些可以通过商业途径得到，如ρΒΙΙΟΙ. 2或者pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA)。已经描述了适宜在植物中表达的其他启动子(Rogers等人(1987) Methin Enzymol 153 :253_277 ；Schardl 等人(1987) Gene 61 :1_11 ；Berger 等人(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86 :8402_8406)。直接转化技术适于任意生物和细胞类型。对于DNA或者RNA注射或者电穿孔到植物细胞的情况，所用的质粒不必满足任何具体要求。可以使用简单质粒，如PUC系列的质粒。如果将从所转化的细胞再生完整植物， 必需额外的选择标记基因位于质粒上。选择标记是所导入的DNA的部分时，可以从未转化的细胞选择稳定转化的细胞， 即含有整合到宿主细胞的DNA的所导入DNA的那些细胞。可以作为标记的基因的实例为能 够赋予抗生素或者除草剂(如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或者膦丝菌素)抗性的基 因(见上文)。表达此类标记基因的转化细胞能够在相应抗生素或除草剂的一定浓度存在 下存活，而所述抗生素或除草剂杀死未转化的野生型。实例在上文描述并且优选包含bar 基因，其赋予对除草剂膦丝菌素的抗性(Rathore KS等人(1993)PlantMol Biol 21(5) 871-884)，还包括nptll基因，其赋予卡那霉素抗性；hpt基因，其赋予潮霉素抗性，或者 EPSP基因，其赋予除草剂草甘膦抗性。选择标记允许从未转化的细胞选择经转化的细胞 (McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5 :81_84)。可以以常规方式培育和杂交所得 植物。为了确保基因组整合是稳定和可遗传的，应该生长两代或更多代。上述方法描述于例如，SD Kung和R Wu编著的Jenes B等人(1993) Techniques for Gene Transfer Transgenie Plants,卷 1, Engineering andUtilization, Academic Press,128-143 页禾口 Potrykus(1991)Annu Rev PlantPhysiol PlantMolec Biol 42: 205-225)。优选将待表达的构建体克隆到适于农杆菌转化的载体，例如，pBinl9中(Bevan 等人(1984)Nucl Acids Resl2 :8711f)。一旦已经产生了经转化的植物细胞，就可以使用技术人员已知的方法得到完整植 物。例如，愈伤组织培养物用作起始材料。可以用该还未分化的细胞生物量以已知方式诱 导芽和根的发育。所得的芽可以移植到户外并繁殖。技术人员熟悉从植物细胞和植物部分再生完整植物的方法。再生方法描述于例 如，Fennell 等人(1992)Plant Cell Rep. 11 :567_570 ；Stoeger 等人(1995)Plant Cell Rep. 14 273-278 Jahne 等人(1994)Theor Appl Genet 89 :525_533。根据本发明的方法可以有利地与产生病原体抗性(例如，对昆虫、真菌、细菌、线 虫等的抗性)、胁迫抗性和植物性质的另一种改善的其他方法联合使用。实例由Dimwell JM,Transgenic approaches to crop improvement,JExp Bot. 2000 ；51Spec No ;487_96页 提及。农杆菌的适宜株系和载体以及农杆菌的转化和适宜的生长和选择培养基 是技术人员公知的并且描述于现有技术中(GV31 01 (pMK90RK)，Koncz, Mol. Gen. Genet. 204(1986)，383-396 ；C58C1(pGV 3850kan)，Deblaere, Nucl. Acid Res. 13(1985)， 4777 ；Bevan, Nucleic. Acid Res. 12(1984) , 8711 ；Koncz, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86(1989),8467-8471 ；Koncz, Plant Mol. Biol. 20(1992),963-976 ；Koncz, Specialized vectors for gene tagging andexpression studies. In :Plant Molecular Biology Manual 卷 2, Gelvin 禾口 Schilperoort(Eds. ), Dordrecht,荷兰Kluwer AcademicPubl. (1994),1-22 ；EP-A-120 516 ；Hoekema :The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V. , Alblasserdam(1985), Chapter V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci.，4，1-46 ；An, EMBO J. 4 (1985)，277-287)。尽管在本发明方法中优选使用根癌农杆菌，但是如果希望所述株系赋予的表型， 也可以使用其他农杆菌株系，如毛根农杆菌。
使用上述方法可能转化多数双子叶植物。但是对于单子叶植物的转化，也已经开 发了一些成功的转化技术。这些技术包括使用例如，上述生物射弹方法转化以及原生质体 转化、部分透化细胞的电穿孔、使用玻璃纤维导入DNA，等等。本文所用的术语“转化”指将外源多核苷酸转移到宿主细胞，而不管用于转移的方 法。可以将多核苷酸瞬时或者稳定导入宿主细胞并且可以例如作为质粒或者作为嵌合连接 保持不整合，或者备选地，可以整合到宿主基因组。然后所得转化的植物细胞可以用于以技 术人员已知的方式再生经转化的植物。因此，在一个实施方案中，本发明涉及植物细胞，其包含本发明的或者通过本发明 方法可以得到的多核苷酸或载体。优选地，细胞包含赋予另一抗性的多核苷酸或者载体，更 优选地，为编码Rpi-blb的载体或者多核苷酸。从而，本发明还涉及转基因植物细胞，其含有(优选稳定整合到基因组)根据本发 明的多核苷酸，其连接到允许在植物细胞中表达所述多核苷酸的调节元件，并且其中所述 多核苷酸是转基因植物细胞外来的。对于外来的含义，见上文。从而，本发明还涉及包含根据本发明的转基因植物细胞的转基因植物和转基因植 物组织。由于本发明多肽的(过)表达，所述植物或植物组织抗植物病原体，尤其抗卵菌。 优选地，所述植物还抗其他病原体，例如，抗吮吸性植物病原体。本文描述了其他病原体。优 选所述植物或者植物组织抗疫霉种，最优选地抗致病疫霉。例如，为了得到表达Rpi_blb2基因的转基因植物，可以将其编码区克隆到例如， pBinAR 载体(HSfgen和 Willmitzer，Plant-Science，66，1990，221-230)中。例如，根据 聚合酶链反应(PCR)技术，可以用实施例和附图，例如，表3b中所示引物，尤其用ARFl F和 ARFl R扩增Rpi_blb2的编码区。可以纯化所得PCR片段并随后将该片段克隆到载体中。 可以将所得载体转移到根癌农杆菌中。该株系可以用于转化并且可以选择转基因植物。在 另一实施方案中，本发明涉及包含本发明的植物细胞的转基因植物或者植物组织。例如，关于核酸序列、包含所述核酸序列的表达盒或者载体或者用所述核酸序列、 表达盒或者载体转化的生物，“转基因的”指通过重组方法产生的所有那些构建体，在所述 构建体中，a) Rpi-blb2核酸序列，或者b)有效连接Rpi_blb2核酸序列的遗传控制序列，例如，启动子，或c) (a)和(b)不位于它们的天然遗传环境中或者已经通过重组方法修饰，修饰的一个实例是替 代、加入、缺失、倒置或者插入一个或多个核苷酸残基。天然遗传环境指最初生物中天然染 色体基因座，或者指存在于基因组文库中。对于基因组文库，优选保持，至少部分保持核酸 序列的天然遗传环境。所述环境在核酸序列侧翼的至少一边并且具有长为至少50bp，优 选至少500bp，特别优选至少lOOObp，非常特别优选至少5000bp的序列。天然发生的表达 盒_例如，Rpi_blb2启动子与相应Rpi_blb2基因的天然发生的组合-当用非天然的、合成 的“人工“方法如诱变修饰时，变成转基因表达盒。已经描述了此类方法(US 5，565，350 ；WO 00/15815 ；也见上文)。此外，还可以转化植物细胞、植物组织或者植物，从而(过)表达其他酶和蛋白 质，所述表达支持植物或者植物组织抗性的增加，例如，Rpi-blb (同义词Rpi-blbl、RB或Sbul)、Rl、Rpi-mcd、R-ber (同义词 R12)、Rpil、Rpi_blb3、Rpi-ABPTU R2, R3a 或 R3b、R4、 R5、R6、R7、R8、R9、RIO、Rll、Ph_l、Ph_2 和 / 或 Ph_3_ 蛋白质。优选 Rpi-blb 和 Rpi_blb2
共表达。本发明还涉及包含如上述的转基因植物细胞的培养的植物组织，所述植物细胞显 示出根据本发明的蛋白质的表达。根据上面的定义，优选作为转基因生物的宿主和起始生 物主要是植物。本发明的范围内包括植物界高等和低等植物的所有属和种。还包括具有增 加的Rpi-blb2活性的成熟植物、种子、芽和幼苗，和部分、繁殖材料和从中得到的培养物， 例如，细胞培养物。成熟植物指幼苗之外的任意发育阶段的植物。术语幼苗指早期发育阶 段的年幼的不成熟的植物。根据本发明得到的任意转化的植物可以用于常规育种方案中或者用于体外植物 繁殖以产生更多具有相同特征的经转化的植物和/或可以用于在相同或相关种的其他品 种中引入相同特征。此类植物也是本发明的部分。从经转化植物得到的种子在遗传上也含 有相同的特征并且是本发明的部分。如前面提到的，本发明原则上可以应用于可以用本领 域技术人员已知的任意转化方法转化的任意植物和农作物。通常，可以根据本发明修饰并且显示出根据本发明的蛋白质的过表达或者此类蛋 白质合成减少的植物可以来自任意希望的植物种。它们可以是单子叶植物或者双子叶植 物，优选它们属于在农业、林业或者园艺上重要的植物种，如农作物植物(例如，玉米、稻、 大麦、小麦、黑麦、燕麦等等)、马铃薯、产油植物(例如，油菜籽、向日葵、花生、大豆等等)、 棉花、甜菜、甘蔗、豆科植物(例如，豆类、豌豆等等)、产木材植物，优选树等等。然而，优选 可以受疫霉种感染的植物。因此，在一个实施方案中，本发明的或者根据本发明方法产生的植物、植物细胞或 者植物组织选自根据Systema Naturae 2000, Brands, S. J, Amsterdam的荇菜科、茄科、厚 壳树科、核果茄科、Goetzeaceae、旋花科、菟丝子科、花惹科和田基麻科(Hydrophyllaceae) 构成的组或者具有其来源。优选地，本发明的或者根据本发明方法产生的所述植物、植物 细胞或者植物组织为茄科，优选选自根据Systema Naturae 2000，Brands, S. J, Amsterdam 的由颠茄属、Browallia、番茉莉属、辣椒属(Capsicum)、夜香树属、Cyphomandra、曼陀罗 属(Datura)、Fabiana> Franciscea、天仙子属(Hyoscyamus)、枸杞属(Lycium)、爺参属 (Mandragora)、假酸浆属(Nicandra)、烟草属(Nicotiana)、碧冬茄属(Petunia)、酸浆属 (Physalis)、Schizanthus和茄属(Solanum)构成的组或者具有其来源。更优选地，本发明的或者根据本发明方法产生的植物、植物细胞或者植物组织 为 S. bulbocastanum、马铃薯(S. tuberosum)、番爺(S. Iycopersicum)、矮牵牛、树番爺 (S. betaceum)、pear melon(S. muricatum)和茄子(S. melongena)。甚至更优选地，所述植 物、植物组织或植物细胞是马铃薯或番茄。最优选地为马铃薯。在其他系统中，分类将是 类似的。本领域技术人员已知所述差异，例如，更通常，番茄被系统命名为Lycopersicon lycopesicum(L.)Karsten ex Farwell0在再一方面，本发明还涉及根据本发明的转基因植物的可收获部分和繁殖材料， 其含有表达根据本发明的核酸分子和/或多肽的转基因植物细胞或者含有显示出本发明 多肽的增加的水平的细胞。可收获部分原则上可以为植物的任意有用的部分，例如，花、花粉、幼苗、块茎、叶子、茎干、果实、种子、根等等。繁殖材料包括例如，种子、果实、插条、幼苗、块茎、根茎等等。 优选马铃薯、番茄、eggfruits或者pear melons作为可收获的或者繁殖材料。对于本发明 的植物为矮牵牛的情况，本发明在一个实施方案中涉及矮牵牛的花作为可收获的部分。本发明还涉及根据本发明的转基因生物和(对于转基因植物生物)从它们来源的 细胞、细胞培养物、部分，例如，根、叶等等，和转基因繁殖材料(如种子或果实)的用途，用 于生产食品或饲料、药物或者精细化学品。具体地，马铃薯可以用于产生精细化学品。因此，在另一实施方案中，本发明涉及本发明的多核苷酸、植物、植物细胞或者植 物组织、载体或者多肽的用途，用于制备脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、脂类、蜡 酯、(多)糖和/或聚羟基链烷酸酯，和/或其代谢产物，尤其类固醇激素、胆固醇、前列腺 素、甘油三酯、胆汁酸和/或酮体产生细胞、组织、和/或植物。有许多机制，通过这些机制 可以实现脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、蜡酯、脂类、(多)糖和/或聚羟基链烷 酸酯，和/或其代谢产物，尤其类固醇激素、胆固醇、甘油三酯、前列腺素、胆汁酸和/或酮体 或者掺入此类经改变的蛋白质的上面定义的精细化学品的产生、生产和/或生产效率。对 于植物，例如，通过增加乙酰辅酶A的表达，可能增加所产生的所述化合物的量，从而允许 更容易收获和纯化，或者对于植物，更有效分配，乙酰辅酶A是细胞中许多产物的基础，所 述产物为例如，脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、脂类、(多)糖、蜡酯、和/或聚羟 基链烷酸酯，和/或其代谢产物，尤其前列腺素、类固醇激素、胆固醇、甘油三酯、胆汁酸和/ 或酮体。此外，可能需要一种或多种所述代谢产物、增量辅因子、前体分子，和适宜的生物 合成途径的中间化合物。因此，通过增加参与营养(如碳源(即糖)、氮源(即，氨基酸、铵 盐)、磷酸和硫)输入的转运蛋白的数目和/或活性，由于除去了对生物合成过程的营养供 给限制，可以提高如上所述的乙酰辅酶A和其代谢产物的产生。具体地，可以提高植物中所 述化合物的产生、生产和/或生产效率，所述化合物为例如，脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二 烯、维生素、脂类、(多)糖、和/或聚羟基链烷酸酯，和/或其代谢产物，尤其类固醇激素、 胆固醇、前列腺素、甘油三酯、胆汁酸和/或酮体分子。进一步优选的是在宿主生物中重组产生药物或者精细化学品的方法，其中用上述 表达盒之一转化宿主生物，并且该表达盒包含一种或多种结构基因，其编码所希望的精细 化学品或者催化所希望的精细化学品的生物合成，培养所转化的宿主生物，并从培养基分 离所希望的精细化学品。该方法可以广泛应用于精细化学品如酶、维生素、氨基酸、糖、脂肪 酸，和天然和合成调味剂、香料物质和着色剂。特别优选的是产生生育酚和生育三烯酸和类 胡萝卜素类。培养所转化的生物并通过技术人员公知的方法从宿主生物或者培养基分离产 物。药物，如抗体或者疫苗的产生由 Hood EE,Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999Aug ； 10(4) 382-6 ；Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol. 1999 ；236 :275_92 描述。在一个实施方案中，本发明还涉及本发明的多核苷酸、载体或者多肽的用途，用于 产生具有所述抗性的植物或植物或其部分的组织、器官或者细胞。此外，在一个实施方案中，本发明涉及鉴定刺激对所述植物病原体的抗性的化合 物的方法，其包括a)在细胞培养条件下将表达本发明多肽或者其mRNA的细胞与候选化合物接触；b)测定所述多肽或者所述mRNA的表达的增加；c)比较不存在所述候选化合物时，做出的对标准应答的表达水平；其中相对于标准增加的表达表明所述化合物刺激抗性。所述化合物可以化学合成或者经微生物产生和/或包含于例如来自例如，植物、 动物或者微生物，例如，病原体的的样品中，例如，细胞提取物中。此外，所述化合物可以是 本领域已知的但是迄今为止还不知道能够抑制或者激活Rpi_blb2。反应混合物可以是无 细胞提取物或者可以包含细胞或者组织培养物。本发明方法的适宜的构成是本领域技术人 员已知的并且例如，通常描述于Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，第三版 (1994)，尤其第17章。化合物可以例如，加到反应混合物、培养基、注射到细胞或者喷雾到 植物上。如果以本发明的方法鉴定了含有化合物的样品，那么可能从鉴定为含有能够激活 或者增加对所述病原体抗性的化合物的原始样品分离所述化合物，或者可以进一步细分原 始样品(例如，如果它由许多不同化合物组成)以便减小每个样品不同物质数并用原始样 品的细分样品重复所述方法。取决于所述样品的复杂性，上述步骤可以进行数次，优选直到 根据本发明鉴定的样品仅包含有限数目的或者仅一种物质。优选地，所述样品包含具有相 似化学和/或物理性质的物质，最优选地，所述物质是相同的。优选地，根据上述方法鉴定 化合物或者其衍生物进一步以适于应用于植物育种或者植物细胞或组织培养的形式配制。可以根据本发明的方法测试和鉴定的化合物可以是表达文库，例如，cDNA表达 文库、肽、蛋白质、核酸、抗体、小有机化合物、激素、肽模拟物、PNA等等(Milner，Nature Medicine 1 (1995),879-880 ；Hupp, Cell 83(1995), 237-245 ；Gibbs, Cell 79(1994)， 193-198和如上引用的参考文献)。所述化合物还可以是已知抑制剂或者激活剂的功能衍 生物或者类似物。制备化学衍生物和类似物的方法是本领域技术人员公知的并且描述于 例如，Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New Yorklnc., 175Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010U. S. A.禾口 OrganicSynthesis，Wiley, New York, USA。此外，可以根据本领域已知的方法测试所述衍生物和类似物的效果。此外，例如，根据 上述方法，可以使用肽模拟物和/或计算机辅助设计适宜的衍生物和类似物。可以用于本 发明方法中的细胞或者组织优选为上文实施方案中描述的本发明的宿主细胞、植物细胞或 者植物组织。可以如实施例中描述的，尤其通过孢子形成指数测定可以确定化合物是否能够抑 制或者激活所述物质。通过上述方法鉴定的激活剂可以证明用作杀真菌剂或者植物保护 剂。从而，在另一实施方案中，本发明涉及根据本发明方法得到或鉴定的化合物，所述化合 物为Rpi_blb2的激动剂。因此，在一个实施方案中，本发明还涉及通过本发明方法鉴定的化合物。所述化合物为例如，Rpi_blb2的同源物。通过诱变，例如Rpi_blb2的离散点突变 或者截短可以产生本发明多肽的同源物。如本文所用的，术语“同源物”指作为Rpi_blb2的 活性激动剂的蛋白质的变体形式。所述蛋白质的激动剂可以基本上保持Rpi_blb2的相同 生物活性或者其一部分。在一个实施方案中，本发明涉及特异识别本发明化合物的抗体。本发明还涉及诊断组合物，其包含至少一种前述多核苷酸、核酸分子、载体、蛋白 质、本发明的抗体或者化合物和任选适宜的检测方法。本发明的诊断组合物适于从细胞分离mRNA并在杂交条件下将所得到的mRNA与包含如上述的核酸探针的探针接触，检测与所述探针杂交的mRNA的存在，从而检测细胞中所 述蛋白质的表达。检测根据本发明的蛋白质的存在的其他方法包括本领域公知的免疫技 术，例如，酶联免疫吸附测定。此外，可能使用根据本发明的核酸分子，尤其实施例，例如表 3a或3b中描述的标记作为植物育种中的分子标记或者引物。适宜检测方法是本领域技术人员公知的，例如，用于杂交测定的缓冲液和溶液，例 如，前述融合和缓冲液，和例如Sambrook等人中描述的DNA印迹、蛋白质印迹、RNA印迹等 是已知的。在另一实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含本发明的多核苷酸、载体、宿主细 胞、多肽、反义核酸、抗体、植物细胞、植物或植物组织、可收获部分、繁殖材料或者化合物。本发明的试剂盒的化合物可以包装在诸如瓶子的容器中，任选使用缓冲液和/或 溶液。如果适宜，可以将一种或多种所述组分包装在一个和相同容器中。额外或备选地，可 以将一种或多种所述组分吸附到固相支持体，如硝酸纤维素滤膜、玻璃板、芯片或者尼龙膜 或者微量滴定板的孔。所述试剂盒可以用于任一种本文描述的方法和实施方案中，例如，用 以产生宿主细胞、转基因植物、药物组合物、检测同源序列、鉴定拮抗剂或激动剂等等。此外，试剂盒可以还包含关于试剂盒用于任意所述实施方案，尤其用于增加植物 细胞、植物组织或植物对一种或多种所述病原体的抗性的使用说明。在优选实施方案中，所述试剂盒还包含多核苷酸，其编码一种或多种前述抗性蛋 白质，优选Rpi-blb，和/或与所述抗性蛋白质，优选与Rpi-blb相关的抗体、载体、宿主细 胞、反义核酸、植物细胞或植物组织和/或植物。在另一实施方案中，本发明涉及产生植物保护剂的方法，所述植物保护剂提供本 发明的多核苷酸、载体或者多肽，所述方法包括本发明方法的步骤；和以可以用作植物农业 组合物的形式配制本发明的多核苷酸、载体或者多肽或者所述方法的步骤(C)中鉴定的化 合物。在另一实施方案中，本发明涉及产生植物保护剂组合物的方法，其包括本发明方 法的步骤；和(a)以可以作为农业组合物接受的形式配制步骤(C)中鉴定的化合物。“可以作为农业组合物接受”理解为此类组合物符合规定杀真菌剂、植物营养、除 草剂等的含量的法律。优选地，此类组合物对所保护的植物和用该植物饲养的动物(包括 人)没有任何害处。本发明还涉及与此类用途和方法有关的一些实施方案。可以以一种或多种下面的 方法使用本文描述的多核苷酸、多肽、蛋白质同源物、融合蛋白质、引物、载体、宿主细胞鉴 定抗所提及的植物病原体和相关生物的的植物；基因组作图；鉴定和定位目的序列；进化 研究；确定功能所需区域；活性的调节。因此，本发明的多核苷酸具有许多用途。首先，它们可以用于鉴定生物为 S. bulbocastanum或者其亲戚。而且它们可以用于鉴定混合植物群体中S. bulbocastanum 或者其亲戚的存在。通过在严格条件下用跨该S. bulbocastanum独特的本发明基因的区域 的探针探测从植物的单一或者混合群体培养物所提取的基因组DNA，可以确定本发明是否 使用了 S. bulbocastanum或者其亲戚，例如近亲，或者是否存在S. bulbocastanum或者其亲 戚，例如，近亲。
此外，本发明的多核苷酸可以与相关物种的序列足够同源从而这些核酸分子可以 作为构建相关生物中基因组图谱的标记。本发明的多核苷酸还可以用于进化和蛋白质结构研究。通过比较本发明的 Rpi-blb2的序列与编码来自其他生物的相似酶的序列，可以评估生物的进化相关性。类似 地，此类比较允许评估所述序列的哪些区是保守的，哪些不是保守的，这可以有助于确定蛋 白质的对于所述酶功能必要的那些区。这种确定对于蛋白质工程化研究是有价值的并且可 以指示在诱变而不丧失功能方面，所述蛋白质可以耐受什么。本发明的描述和实施例公开并包括这些和其他实施方案。关于按照本发明使用 的方法、用途和化合物任一种的其他文献可以使用例如电子装置从公共图书馆检索。例 如，可以利用公共数据库"Medline”，其可以在因特网上以http //www. ncbi. nlm. nih. gov/PubMed/medline. html 提供。其他数据库禾口网址，如 http://www.ncbi.nim.nih. gov/, http://www. infobiogen. fr/, http://www. fmi. ch/biology/research-tools. html, http://www. tigr. org/是本领域技术人员已知的并且可以使用例如，http//www. lycos, com得到。在Berks，TIBTECH 12 (1994)，352-364中给出了生物技术专利信息综述和可用 于回溯检索和最新文献通报的专利信息的相关来源的调查。表表1 序列表2. 2000年在荷兰的Marknesse进行的田间试验中BC4作图群ARG95-3和ARP 96-11的2851个子代克隆中抗性的分离。用括号中的百分数表示分类为具有抗性、敏感或 者未知表型的克隆数。
权利要求
1.产生或者增加植物对卵菌门植物病原体的抗性的方法，其包括增加植物或植物组 织、器官或细胞或植物部分中Rpi_blb2蛋白质的活性。
2.权利要求1的方法，其中所述Rpi_blb2蛋白质由包含核酸分子的多核苷酸编码，所 述核酸分子选自(a)编码SEQID NO 2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；(b)核酸分子，其包含编码所述多肽的至少成熟形式的如SEQIDNO :1或3或5或6中 描绘的编码序列；(c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遗传密码简并产生；(d)核酸分子，其编码的多肽通过从(a)到(c)的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列的 一个或几个氨基酸的替代、缺失和/或加入从(a)到(c)的多核苷酸编码的多肽衍生；(e)核酸分子，其编码的多肽的序列与(a)或(b)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列 具有70%或以上的同一性；(f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一项的核酸分子编码的多肽的片段或者具有表位的 部分；(g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物从核酸文库扩增的核酸分子 的序列；(h)核酸分子，其编码(a)到(g)任一项编码的多肽的以氨基酸1、30、50、100、200、 300,500或1000开始并以氨基酸1267、1000、500、300、200、50、30、或1结束的片段；(i)包含(a)或(d)任一项的多核苷酸的至少20个核苷酸的核酸分子；(j)核酸分子，其编码的多肽被针对(a)到(h)任一项的核酸分子编码的多肽产生的单 克隆抗体识别；(k)核酸分子，其可以通过用具有(a)到(j)任一项的核酸分子序列或者其至少20个 核苷酸的片段的探针在严格条件下筛选适宜文库得到；和(1)核酸分子，其互补链在严格条件下与(a)或(k)任一项的核酸分子杂交；或者(a)到⑴任一项的互补链；或者表达Solanum bulbocastanum或者马铃薯的染色体或连锁群6的区段编码的多 肽，所述区段与选自表3a或3b的标记共分离，并且所述多肽介导对卵菌门病原体的抗性；其中所述多核苷酸不由Seq. ID NO. :7或9中描述的序列组成。
3.权利要求1或2的方法，其中至少一种其他抗性蛋白质的活性增加。
4.权利要求1到3任一项的方法，其中活性由于从头表达而增加。
5.权利要求1到4任一项的方法，其中Rpi-blb2和/或至少一种其他抗性蛋白质的内 源活性增加。
6.权利要求1到5任一项的方法，其包括一个或多个下面的步骤a)稳定抗性蛋白质；b)稳定编码抗性蛋白质的mRNA；c)增加抗性蛋白质的比活；d)表达用于抗性蛋白质表达的同源或者人工转录因子或者增加用于抗性蛋白质表达 的同源或者人工转录因子的表达；e)通过外源诱导因子刺激抗性蛋白质活性；f)表达转基因抗性蛋白质编码基因；和/或g)增加抗性蛋白质编码基因的拷贝数。
7.权利要求1到6任一项的方法，其导致与野生型相比用致病疫霉感染后孢子形成指 数减小至少30%。
8.编码Rpi_blb2蛋白质的多核苷酸，其包含核酸分子，所述核酸分子选自(a)编码SEQID NO 2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；(b)核酸分子，其包含编码所述多肽的至少成熟形式的如SEQIDNO :1或3或5或6中 描绘的编码序列；(c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遗传密码简并产生；(d)核酸分子，其编码的多肽通过从(a)到(c)的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列的 一个或几个氨基酸的替代、缺失和/或加入从(a)到(c)的多核苷酸编码的多肽衍生；(e)核酸分子，其编码的多肽的序列与(a)或(b)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列 具有70%或以上的同一性；(f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一项的核酸分子编码的多肽的片段或者具有表位的 部分；(g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物从核酸文库扩增的核酸分子 的序列；(h)核酸分子，其编码(a)到(g)任一项编码的多肽的以氨基酸1、30、50、100、200、 300,500或1000开始并以氨基酸1267、1000、500、300、200、50、30、或1结束的片段；(i)包含(a)或(d)任一项的多核苷酸的至少20个核苷酸的核酸分子；(j)核酸分子，其编码的多肽被针对(a)到(h)任一项的核酸分子编码的多肽产生的单 克隆抗体识别；(k)核酸分子，其可以通过用具有(a)到(j)任一项的核酸分子序列或者其至少20个 核苷酸的片段的探针在严格条件下筛选适宜文库得到；和(1)核酸分子，其互补链在严格条件下与(a)或(k)任一项的核酸分子杂交；或者(a)到⑴任一个的互补链；或者所述核酸分子编码Solanum bulbocastanum或者马铃薯的染色体或者连锁群6的 区段编码的多肽，所述区段与选自表3a或3b的标记共分离或者包含所述标记的复制位点 或者杂交位点，并且介导对卵菌门病原体的抗性；其中所述多核苷酸不由Seq. ID NO. 7或9中描述的序列组成。
9 权利要求8的多核苷酸或者权利要求2到7任一项的方法，其中所述标记为E40M58、 CT119 或 CT216。
10.权利要求8到9的多核苷酸，其是DNA或RNA。
11.产生重组载体的方法，其包括将权利要求8到10任一项的多核苷酸插入到载体中 或者插入所述多核苷酸和另一抗性蛋白质。
12.载体，其含有权利要求8到10任一项的多核苷酸或者包含所述多核苷酸和另一抗 性基因或者所述载体通过权利要求11的方法产生。
13.权利要求12的载体或者权利要求1到7任一项的方法，其中编码Rpi_blb2蛋白质 或者编码另一抗性蛋白质的多核苷酸有效连接表达控制序列和/或有效连接编码转基因表达调节信号的核酸序列，所述调节信号允许在原核或者真核宿主细胞中表达。
14.权利要求12或13的载体或者权利要求1到7任一项的方法，其中编码Rpi_blb2 蛋白质或者编码另一抗性蛋白质的多核苷酸有效连接与所述编码Rpi_blb2蛋白质或者编 码另一抗性蛋白质的多核苷酸相同物种来源的表达控制序列。
15.产生重组宿主细胞的方法，其包括向宿主细胞导入权利要求12到14任一项的载体 或者导入所述载体和表达另一抗性蛋白质的载体。
16.宿主细胞，其通过权利要求15的方法产生或者用权利要求8到10任一项的多核苷 酸或者权利要求12到14任一项的载体基因工程化或者用所述载体或多核苷酸和表达另一 抗性蛋白质的载体或多核苷酸基因工程化。
17.权利要求16的宿主细胞，其是大肠杆菌、杆状病毒、农杆菌或者植物细胞。
18.产生Rpi-blb2多肽的方法，其包括培养权利要求16或17的宿主细胞并从培养基 或者宿主细胞回收所述多核苷酸编码并通过所述宿主细胞表达的多肽。
19.多肽，具有权利要求8到10任一项的多核苷酸编码的氨基酸序列或者可以通过权 利要求18的方法得到，其中所述多肽不由Seq. ID. No. 8和10中所示氨基酸序列组成。
20.多肽，其具有Rpi_blb2活性。
21.抗体，其特异结合权利要求19或20的多肽。
22.反义核酸分子，其包含权利要求8到10任一项的多核苷酸的互补序列。
23.产生转基因植物、其植物细胞或者植物组织或部分的方法，该方法包括向所述植 物、其植物组织或者植物细胞或部分的基因组导入权利要求8到10任一项的多核苷酸或者 所述多核苷酸和编码另一抗性蛋白质的多核苷酸，或者权利要求12到14任一项的载体。
24.植物细胞，其包含权利要求8到10任一项的多核苷酸、权利要求12到14任一项的 载体或者可以通过权利要求23的方法得到。
25.转基因植物或其植物组织或部分，其包含权利要求24的植物细胞。
26.产生抗卵菌门植物病原体的植物或其部分的方法，其包括步骤在所述植物或其 部分中表达权利要求19或20的多肽和另一抗性蛋白质。
27.产生具有对疫霉具有持久抗性的植物或其部分的方法，该方法包括在植物或者其 部分中共表达Rpi_blb2和Rpi-blb2蛋白质或者权利要求19或20的多肽。
28.权利要求25的或者根据权利要求26或27产生的转基因植物或者植物组织，当存 在所述多核苷酸或者载体时所述转基因植物或植物组织抗卵菌门的植物病原体。
29.权利要求25的转基因植物或植物组织的可收获部分，其包含权利要求24的植物细胞。
30.权利要求25的转基因植物或植物组织的繁殖材料，其包含权利要求24的植物细 胞，所述细胞具有增加的Rpi_blb2活性。
31.权利要求8到10任一项的多核苷酸、权利要求12到14任一项的载体，或者权利要 求19或20的多肽的用途，用于产生抗卵菌门植物病原体的植物或植物组织、植物器官或植 物细胞或植物部分。
32.鉴定刺激针对卵菌门植物病原体的抗性的化合物的方法，其包括a)在细胞培养条件下将表达权利要求19或20的多肽或者其mRNA的细胞与候选化合 物接触；b)测定所述多肽或者所述mRNA的表达的增加；c)比较不存在所述候选化合物时，做出的对标准应答的表达水平；从而相对于标准增 加的表达表明所述化合物刺激抗性。
33.权利要求8到10任一项的多核苷酸、权利要求12到14任一项的载体、权利要求 19或20的多肽或者权利要求21的抗体的用途，用于鉴定和/或产生激活或者刺激针对卵 菌门植物病原体的植物抗性的化合物。
34.诊断组合物，其包含权利要求8到10任一项的多核苷酸、权利要求12到14任一项 的载体、权利要求21的抗体或者权利要求22的反义核酸和任选适宜的检测方法。
35.试剂盒，其包含权利要求8到12任一项的多核苷酸、权利要求12到14任一项的 载体、权利要求16或17的宿主细胞、权利要求19或20的多肽、权利要求22的反义核酸、 权利要求21的抗体、权利要求24的植物细胞、权利要求25的植物或植物组织、权利要求29 的可收获部分、或权利要求30的繁殖材料和任选编码Rpi-blb的多核苷酸、Rpi-blb蛋白 质或者针对Rpi-blb的抗体。
36.产生提供权利要求8到10任一项的多核苷酸、权利要求12到14任一项的载体或 权利要求19或20的多肽的植物作物保护剂的方法，其包括权利要求32的方法的步骤；和 以农业组合物可以应用的形式配制权利要求8到10任一项的多核苷酸、权利要求12或14 的载体或权利要求19或20的多肽或权利要求32的步骤(c)中鉴定的化合物。
37.权利要求1到36任一项的载体、宿主细胞、植物细胞、植物组织、植物、用途、试剂盒 或方法，其中所述植物病原体是腐霉目(Pythiales)或者Peronosperales。
38.权利要求1到37任一项的载体、宿主细胞、植物细胞、植物组织、植物、用途、试剂盒 或方法，其中所述植物病原体是致病疫霉、红腐疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉、寄生疫霉烟草致 病变种、莴苣盘梗霉、Peronospora tabaci或者葡萄生单轴霉。
39.权利要求1到38任一项的载体、宿主细胞、植物细胞、植物组织、植物、用途、试剂盒 或方法，其中所述抗性蛋白质的特征是P-环和NBS结构域。
40.权利要求2到39任一项的载体、宿主细胞、植物细胞、植物组织、植物、用途、试 剂盒或方法，其中另一抗性基因是编码Rpi-blb、RU R-ber、RpiU Rpi_blb3、Rpi-ABPTU Rpi-mcd、R2、R3a 和 R3b、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、Rll、Ph_l、Ph_2 和 / 或 Ph_3 的基因。
41.权利要求2到40任一项的载体、宿主细胞、植物细胞、植物组织、植物、用途、试剂盒 或方法，其中另一抗性蛋白质是Rpi-blb蛋白质。
42.权利要求1到41任一项的载体、宿主细胞、植物细胞、植物组织、植物、用途、试剂 盒或方法，其中所述植物、植物细胞或植物组织选自根据Systema Naturae 2000，Brands, S. J，AmSterdam的荇菜科、茄科、厚壳树科、核果茄科、Goetzeaceae、旋花科、菟丝子科、花惹 科和田基麻科构成的组或者具有其来源。
43.权利要求1到42任一项的载体、宿主细胞、植物细胞、植物组织、植物、用途、 试剂盒或方法，其中所述多核苷酸、多肽、植物细胞、宿主细胞、植物组织或植物来自 前禾斗，优选来自 S. bulbocastanum、马铃薯(S. tuberosum)、番前(S. Iycopersicum 或 Lycopersiconlycopersicum (L.) Karsten ex Farwel 1))、矮牵牛、树番前(S. betaceum)、 pear melon (S. muricatum)或前子(S. melongena) 0
全文摘要
本发明涉及增加植物，尤其茄科(Solanaceae)植物，优选马铃薯和番茄对卵菌门(Oomycetes)的植物病原体的抗性的新方法，所述方法包括增加本发明多肽的活性。本发明还涉及多核苷酸和包含这些多核苷酸的载体。本发明还涉及相应的载体、细胞、转基因植物和来自它们的转基因繁殖材料，涉及产生它们的方法，还涉及它们用于产生粮食、饲料、种子、药物或者精细化学品的用途。
文档编号C12N15/82GK102002503SQ20101029365
公开日2011年4月6日 申请日期2004年8月3日 优先权日2003年8月11日
发明者E·A·G·范德福森, J·J·H·M·阿莱弗斯, M·W·M·穆斯肯斯 申请人:植物育种农业研究所有限公司