专利名称：用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及了一种培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，特别是用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法。
背景技术：
人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)最初由 Thomson 等于 1998 年从处于囊胚阶段的早期胚胎中分离。通过分离人囊胚内细胞团，以35Gy γ射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)作为培养层体外培养，约9_15天后将细胞团吹散，然后继续在MEF上培养，挑选具有均一未分化形态的单克隆细胞团进行培养，如此重复培养至成系。hESC具有自我更新和分化的全能性的特点，注射到重症联合免疫缺陷的小鼠(severe combined immunodeficiency mice，SCID)中,可获得包含3个胚层分化细胞的畸胎瘤；体外悬浮培养hESC可发育成胚样体(embryoid body)，亦可检测到3个胚层的细胞存在。为使体外培养的hESC长久地保持未分化状态，除特殊的培养条件外，需要与滋养层细胞(feeder layer)共培养。培养层细胞(例如MEF)能分泌多种细胞因子，抑制hESC 的自发分化(Martin，1981)。但由于MEF属鼠源的特性，出于临床应用的安全性考虑，为防止动物源性病原体的传播，MEF作为培养层细胞培养hESC的临床应用受到了极大的限制。研究人员尝试开发人体组织作为培养层细胞，如胚胎皮肤、肌肉组织，成人输卵管上皮细胞，尿道内皮细胞，包皮成纤维细胞，成体骨髓基质细胞等(Cheng et al.，2003 ；Hovatta et al. ,2003 ；Inzunza et al. ,2005 ；Lee et al. ,2005 ；Richards et al. ,2003)。然而这些细胞的实际取材非常困难，加上伦理学的限制，使其作为大规模临床应用培养hESC的培养层细胞几乎不可能。因为hESC分离培养自人胚胎组织，伦理学问题极大的限制了它在临床上的实际应用。2006年和2007年，日本科学家山中伸弥带领的研究团队分别发现了小鼠体细胞和人的成熟体细胞能通过人工方法诱导成具有hESC特点的多潜能干细胞，命名为人源性人工诱导多潜能干细胞(iPS Jnduced pluripotent stem cell) (Takahashi K et al.，2006 ； Takahashi K et al.，2007)，这一发现一举克服了 hESC应用范畴的伦理学问题，为若干非感染性疾病的治疗开启了希望之门。iPS细胞技术在全世界实验室中逐渐被成熟和完善， 其安全性也逐渐得到了加强，比如现在已不需要使用病毒介导即可达到诱导iPS细胞的目的，成瘤性问题也逐渐得到了解决(Kaji et al.，2009)。然而，iPS细胞的培养和hESC — 样，需要动物源性的MEF作为饲养层细胞才能使之保持未分化的状态，这一问题成为了 iPS 临床应用中的一大亟需克服的障碍和难题。
发明内容
本申请的发明目的在于克服现有技术的缺陷，而提供一种安全可靠地培养未分化的人源性人工诱导多潜能干细胞的方法。为了完成本申请的发明目的，本发明采用以下技术方案本发明的一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，它包括以下步骤(1)用人羊膜间充质细胞的培养基，将体外的人羊膜间充质细胞培养在15cm的细胞培养瓶中达到80-90%融合；其中( 去掉步骤(1)中的人羊膜间充质细胞的培养基，加入IOml新鲜人羊膜间充质细胞的培养基，在该培养基中加入100 μ 1浓度为lmg/ml的丝裂霉素C混勻，然后将其放置于36. 5-37. 5°C的(X)2细胞培养箱中40分钟，去掉含有丝裂霉素C的培养基，再用 IOml D-Hank' s平衡盐溶液洗涤3次，再加入15ml的人源性人工诱导多潜能干细胞培养
基备用；(3)将在15cm细胞培养瓶中生长到直径为4mm-6mm的人源性人工诱导多潜能干细胞去掉多余的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，只在细胞培养瓶保留5ml的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，加入浓度为10mg/ml的胶原酶IV，使胶原酶IV的最终浓度为 lmg/ml，混勻后置于36. 5-37. 5°C的(X)2细胞培养箱中15分钟，去掉含胶原酶IV的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，用IOml Knockout DMEM洗涤3次后，再加入IOml人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，用5ml移液管对准克隆的人源性人工诱导多潜能干细胞快速吹打，使其脱落在培养基中，对于贴附紧密的人源性人工诱导多潜能干细胞，可用移液管轻刮人源性人工诱导多潜能干细胞，用机械力使其脱落，待人源性人工诱导多潜能干细胞全部脱落在培养基后，再次吹打使其破碎成较小的人源性人工诱导多潜能干细胞的细胞团， 然后将其转移到4个预处理过的上述步骤O)的培养瓶中，每瓶放入2. 5ml ；(4)在室温下，对步骤C3)培养瓶中的细胞进行培养，每隔1天更换一次人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，待3-4天后长出肉眼可见的人源性人工诱导多潜能干细胞后，每天更换一次人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，每隔7天传代一次，待人源性人工诱导多潜能干细胞生长到4mm-6mm，重复步骤( 或经过步骤(；3)破碎成较小的人源性人工诱导多潜能干细胞的细胞团后进行使用；本发明的一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，其中步骤(1)包括以下步骤将体外人羊膜间充质细胞放置在装有人羊膜间充质细胞培养基的15cm细胞培养瓶中，待细胞密度达到90%融合以上，去掉培养基，用5ml D-Hanks'平衡盐溶液洗涤3次，再加入^il 0. 25%的胰蛋白酶放于36. 5-37. 5°C的CO2细胞培养箱内2-3分钟，在显微镜下观察，待大部分细胞边缘发亮时，拍打培养瓶，使细胞处于悬浮状态，加入5ml的含有DMEM/F12和10%胎牛血清的终止液，将其转移到50ml离心管中，加入30ml D-Hanks'平衡盐溶液，在室温下将其放入离心机中以lOOOr/min的转速离心5分钟，然后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入30ml人羊膜间充质细胞培养基使细胞重新悬浮，用移液管吹打均勻上述细胞，再将上述细胞平均种植到3个15cm细胞培养瓶中后，放置在36. 5-37. 5°C的(X)2细胞培养箱内，每隔3天换一次羊膜间充质细胞培养基，培养到在15cm的细胞培养瓶中达到80-90%融合；本发明的一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，其中所述的人羊膜间充质细胞的培养基包括DMEM/F12、5%胎牛血清、2%B27、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml的表皮生长因子和0. 2g/l的L-谷氨酰胺；本发明的一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，其中所述的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基包括=Knockout DMEM.20% Knockout血清替代物、2mmol/l的L-谷氨酰胺、1 X 10_4mol/l的非必需氨基酸、4ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、0. 5%的青霉素、0. 5%的链霉素和lX10_4mOl/l的2-巯基乙醇。本发明成功地建立起了使用hAMCS作为培养层培养人源性人工诱导多潜能干细胞细胞系Hl的实验方法，目前已培养超过6个月。其细胞形态表现为边缘清楚，单层未分化的形态，与培养在MEF上的人源性人工诱导多潜能干细胞形态一致；增殖速度与培养在 MEF上的人源性人工诱导多潜能干细胞比较略快；未分化的标准即干细胞全能性标记蛋白如 0CT3/4，S0X2, NANOG，SSEA-4，TRA-1-81，TRA-1-60 均有表达。
图1为由本发明得到的人源性人工诱导多潜能干细胞通过免疫荧光检测0CT3/4、 S0X2、NANOG, SSEA-4、TRA-1-81、TRA-1-60 的表达；图2为用western blot方法对人源性人工诱导多潜能干细胞维持自我更新和多潜能性的关键蛋白的表达进行鉴定，其中图中的a表示人羊膜间充质细胞；b表示以人羊膜间充质细胞作为培养层培养的人源性人工诱导多潜能干细胞；c表示以MEF作为培养层培养的人源性人工诱导多潜能干细胞；d表示以人羊膜上皮细胞作为培养层培养的人源性人工诱导多潜能干细胞；图3为分别用本发明人羊膜间充质细胞作培养层(HAMC)、用小鼠胚胎成纤维细胞作为培养层(MEF)和用人羊膜上皮细胞(HAEC)来培养人源性人工诱导多潜能干细胞，人源性人工诱导多潜能干细胞在生长2天和5天时克隆直径大小比较图；图4为用小鼠胚胎成纤维细胞作为培养层(MEF)培养出来的人源性人工诱导多潜能干细胞的形态图；图5为用人羊膜间充质细胞作培养层(HAMC)培养出来的人源性人工诱导多潜能干细胞的形态图。
具体实施例方式本发明的一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，它包括以下步骤(1)将体外人羊膜间充质细胞放置在装有人羊膜间充质细胞培养基的15cm细胞培养瓶中，待细胞密度达到90%融合以上，去掉培养基，用5ml D-Hanks'平衡盐溶液 (Hanks' balanced salt solution without calcium and magnesium, lnvitrogen 公司生产)洗涤3次，再加入aiil 0.25%的胰蛋白酶(Trypsin，hvitrogen公司生产)放于 36. 5-37. 5°C的(X)2细胞培养箱内2_3分钟，在显微镜下观察，待大部分细胞边缘发亮时， 拍打培养瓶，使细胞处于悬浮状态，加入5ml的含有DMEM/F12 (lnvitrogen公司生产)和 10%胎牛血清(lnvitrogen公司生产)的终止液，将其转移到50ml离心管中，加入30ml D-Hanks ‘平衡盐溶液，在室温下将其放入离心机中以lOOOr/min的转速离心5分钟，然
6后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入30ml人羊膜间充质细胞培养基使细胞重新悬浮， 用移液管吹打均勻上述细胞，再将上述细胞平均种植到3个15cm细胞培养瓶中后，放置在 36. 5-37. 5°C的(X)2细胞培养箱内，每隔3天换一次羊膜间充质细胞培养基，培养到在15cm 的细胞培养瓶中达到80-90%融合；(2)去掉步骤(1)中的人羊膜间充质细胞的培养基，加入IOml新鲜人羊膜间充质细胞的培养基，在该培养基中加入100 μ 1浓度为lmg/ml的丝裂霉素C(Sigma-Aldrich公司生产)混勻，然后将其放置于36. 5-37. 5°C的(X)2细胞培养箱中40分钟，去掉含有丝裂霉素C的培养基，再用IOml D-Hank' s平衡盐溶液洗涤3次，再加入15ml的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基备用；(3)将在15cm细胞培养瓶中生长到直径为4mm-6mm的人源性人工诱导多潜能干细胞去掉多余的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，只在细胞培养瓶保留5ml的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，加入浓度为10mg/ml的胶原酶IV，使胶原酶IV的最终浓度为 lmg/ml，混勻后置于36. 5-37. 5°C的(X)2细胞培养箱中15分钟，去掉含胶原酶IV的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，用IOml Knockout DMEM洗涤3次后，再加入IOml人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，用5ml移液管对准克隆的人源性人工诱导多潜能干细胞快速吹打，使其脱落在培养基中，对于贴附紧密的人源性人工诱导多潜能干细胞，可用移液管轻刮人源性人工诱导多潜能干细胞，用机械力使其脱落，待人源性人工诱导多潜能干细胞全部脱落在培养基后，再次吹打使其破碎成较小的人源性人工诱导多潜能干细胞的细胞团， 然后将其转移到4个预处理过的上述步骤O)的培养瓶中，每瓶放入2. 5ml ；(4)在室温下，对步骤C3)培养瓶中的细胞进行培养，每隔1天更换一次人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，待3-4天后长出肉眼可见的人源性人工诱导多潜能干细胞后，每天更换一次人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，每隔7天传代一次，待人源性人工诱导多潜能干细胞生长到4mm-6mm，重复步骤( 或经过步骤(；3)破碎成较小的人源性人工诱导多潜能干细胞的细胞团后进行使用。人羊膜间充质细胞的培养基包括DMEM/F12anvitr0gen公司生产)、5%胎牛血清(Invitrogen公司生产)、2% B27 (Invitrogen公司生产)、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子Tech公司生产)、20ng/ml的表皮生长因子(P印ro Tech公司生产)和 0. 2g/l的L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich公司生产)。人源性人工诱导多潜能干细胞培养基包括Knockout DMEM(Invitrogen公司生产)、20 % Knockout血清替代物anvitrogen公司生产)、2mmol/l的L-谷氨酰胺 (Sigma-Aldrich公司生产)、1 X 1θΛιο1/1的非必需氨基酸(Invitrogen公司生产)、4ng/ ml的碱性成纤维细胞生长因子(P^ro Tech公司生产)、0. 5%的青霉素Qnvitrogen 公司生产)、0. 5%的链霉素(Invitrogen公司生产)和lX10_4mol/l的2-巯基乙醇 (Invitrogen 公司生产)。从图1和图2中可以看出人源性人工诱导多潜能干细胞培养在人羊膜间充质细胞上经过20代克隆后，通过免疫荧光(图1)和western blot方法(图2~)对人源性人工诱导多潜能干细胞维持自我更新和多潜能性的关键蛋白的表达进行鉴定的结果。免疫荧光结果显示以人羊膜间充质细胞作为培养层细胞培养的人源性人工诱导多潜能干细胞表达 0ct3/4、S0X2、NANOG, SSEA-4、TRA-1-81、TRA-1-60等分子，表明其具有自我更新与分化的多潜能性。Western blot显示以人羊膜间充质细胞作为培养层培养人源性人工诱导多潜能干细胞，0ct3/4、S0X2和NANGO分子的表达与MEF作为培养层相比较基本相一致。这些结果说明以人羊膜间充质细胞作为培养层细胞来培养人源性人工诱导多潜能干细胞，能使人源性人工诱导多潜能干细胞保持自我更新和多潜能性。图3表明培养在不同培养层细胞上的人源性人工诱导多潜能干细胞(hES)增殖比较，人源性人工诱导多潜能干细胞传代时平均分成3份，均勻的培养在鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)、人羊膜间充质细胞(HAMC)和人羊膜上皮细胞(HAEC)上，隔天换液，在第2天和5天对细胞克隆拍照，测量细胞克隆的直径。结果显示培养在人羊膜间充质细胞上的人源性人工诱导多潜能干细胞克隆直径最大，培养在鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上的克隆直径仅次于培养在人羊膜间充质细胞上的克隆，而培养在人羊膜上皮细胞(HAEC)上的克隆直径明显较小，并且在人羊膜上皮细胞(HAEC)克隆出来的人源性人工诱导多潜能干细胞会一定程度的分化。以下的表1表示用上述三种不同的细胞来培养人源性人工诱导多潜能干细胞， 在2天和5天后，所得到的人源性人工诱导多潜能干细胞的直径。表1 (单位微米)
权利要求
1.一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，它包括以下步骤(1)用人羊膜间充质细胞的培养基，将体外的人羊膜间充质细胞培养在15cm的细胞培养瓶中达到80-90%融合；其特征在于(2)去掉步骤(1)中的人羊膜间充质细胞的培养基，加入IOml新鲜人羊膜间充质细胞的培养基，在该培养基中加入100 μ 1浓度为lmg/ml的丝裂霉素C混勻，然后将其放置于36. 5-37. 50C的(X)2细胞培养箱中40分钟，去掉含有丝裂霉素C的培养基，再用IOml D-Hank' s平衡盐溶液洗涤3次，再加入15ml的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基备用；(3)将在15cm细胞培养瓶中生长到直径为4mm-6mm的人源性人工诱导多潜能干细胞去掉多余的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，只在细胞培养瓶保留5ml的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，加入浓度为10mg/ml的胶原酶IV，使胶原酶IV的最终浓度为Img/ ml，混勻后置于36. 5-37. 5°C的(X)2细胞培养箱中15分钟，去掉含胶原酶IV的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，用IOml Knockout DMEM洗涤3次后，再加入IOml人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，用5ml移液管对准克隆的人源性人工诱导多潜能干细胞快速吹打，使其脱落在培养基中，对于贴附紧密的人源性人工诱导多潜能干细胞，可用移液管轻刮人源性人工诱导多潜能干细胞，用机械力使其脱落，待人源性人工诱导多潜能干细胞全部脱落在培养基后，再次吹打使其破碎成较小的人源性人工诱导多潜能干细胞的细胞团，然后将其转移到4个预处理过的上述步骤O)的培养瓶中，每瓶放入2.5ml ；(4)在室温下，对步骤C3)培养瓶中的细胞进行培养，每隔1天更换一次人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，待3-4天后长出肉眼可见的人源性人工诱导多潜能干细胞后，每天更换一次人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，每隔7天传代一次，待人源性人工诱导多潜能干细胞生长到4mm-6mm，重复步骤( 或经过步骤( 破碎成较小的人源性人工诱导多潜能干细胞的细胞团后进行使用。
2.如权利要求1所述的一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，其特征在于步骤(1)包括以下步骤将体外人羊膜间充质细胞放置在装有人羊膜间充质细胞培养基的15cm细胞培养瓶中，待细胞密度达到90%融合以上， 去掉培养基，用5ml D-Hanks'平衡盐溶液洗涤3次，再加入^il 0. 25%的胰蛋白酶放于 36. 5-37. 5°C的CO2细胞培养箱内2_3分钟，在显微镜下观察，待大部分细胞边缘发亮时，拍打培养瓶，使细胞处于悬浮状态，加入5ml的含有DMEM/F12和10 %胎牛血清的终止液，将其转移到50ml离心管中，加入30ml D-Hanks'平衡盐溶液，在室温下将其放入离心机中以 1000r/min的转速离心5分钟，然后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入30ml人羊膜间充质细胞培养基使细胞重新悬浮，用移液管吹打均勻上述细胞，再将上述细胞平均种植到3个 15cm细胞培养瓶中后，放置在36. 5-37. 5°C的CO2细胞培养箱内，每隔3天换一次羊膜间充质细胞培养基，培养到在15cm的细胞培养瓶中达到80-90%融合。
3.如权利要求1或2所述的一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，其特征在于所述的人羊膜间充质细胞的培养基包括DMEM/F12、 5%胎牛血清、2% B27、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml的表皮生长因子和.0. 2g/l的L-谷氨酰胺。
4.如权利要求3所述的一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，其特征在于所述的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基包括 KnockoutDMEM,20 % Knockout 血清替代物、2mmol/l 的 L-谷氨酰胺、1 X l(T4mol/l 的非必需氨基酸、4ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、0.5%的青霉素、0.5%的链霉素和 1 X 10_4mol/l的2-巯基乙醇。
全文摘要
本发明涉及用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，它包括用人羊膜间充质细胞的培养基，将体外的人羊膜间充质细胞培养在15cm的细胞培养瓶中达到80-90％融合；再加入人源性人工诱导多潜能干细胞培养基备用；将放在15cm细胞培养瓶中的人源性人工诱导多潜能干细胞吹打使其破碎成较小的干细胞的细胞团，放入人羊膜间充质细胞培养瓶中进行培养，待人胚胎干细胞生长到4mm-6mm，重复将上述干细胞吹打使其破碎成较小干细胞的细胞团放入新的人羊膜间充质细胞培养瓶中继续进行培养或用于其他目的使用，本发明得到与培养在MEF上的人源性人工诱导多潜能干细胞形态一致；而且用比MEF培养的更加安全。
文档编号C12N5/074GK102409022SQ20101029041
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月25日 优先权日2010年9月25日
发明者张可华, 李凌松, 蔡哲 申请人:李凌松, 蔡哲