专利名称：一种快速鉴定棉花中转基因成分的检测方法及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种快速鉴定棉花中转基因成分的检测方法 及其应用。
背景技术：
棉花不仅可作为纤维原料应用在纺织品上，也是动物饲料和各种加工食品组分原 材料的重要来源。目前有许多国家包括印度、美国、中国、阿根廷、南非等均种植有转基因棉 花。转基因棉花种植发展迅速，截止到2009年美国、印度和中国的转基因棉花种植面积分 别为320万公顷、840万公顷、大于370万公顷，约占本国棉花种植面积的88%、89%、大于 60%。随着转基因棉花越来越广泛的种植，出于对转基因作物安全性的考虑，日本、欧盟等 许多国家相继建立了转基因食品标识制度。我国于2002年3月20日起施行《农业转基因 生物标识管理办法》，要求对5类转基因生物所涉及的17种转基因产品进行标识，其中也包 括了转基因棉花种子。因此建立一套方便、快捷的转基因产品检测技术是贯彻标识制度的 重要前提。近年来国内外关于转基因植物检测的报道多涉及转基因大豆、玉米及其加工产 品，检测方法中以多重PCR技术较为常见。而对于转基因棉花的检测研究则报道较少，目前 有关转基因棉花检测技术包括SSR(simple sequences r印eat，简单重复序列)PCR技术和 ELISA方法等。但是，现有的检测技术操作复杂，检测耗时长，且无法同时检测转基因棉花中 多个外源基因。
发明内容
本发明的首要目的是克服现有技术的缺点与不足之处，提供一种快速鉴定棉花中 转基因成分的检测方法。本发明的另一目的在于提供所述检测方法的应用。本发明是采用以下方案实现的一种快速鉴定棉花中转基因成分的检测方法，包 含以下步骤(1)设计多重PCR的6对引物，分别为sadl-F 5' -CCACGAGACAGCCTATACCAAAAT-3，；sadl-R 5' -CCCTAACCAAAGCCACGCA—3’ ；GUS-F :5’ -CTGCGACGCTCACACCGATACC-3’ ；GUS-R :5’ -TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3‘；CrylAb/Ac-F 5' -GAAGGATTGAGCAATCTCTACCAA-3，；CrylAb/Ac-R 5' -TTCCAATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3，；NPTII-F :5’ -CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA-3’ ；NPTII-R :5，-CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG-3，；NOS-F :5，-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3，；NOS-R :5’ -AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3’ ；
CaMV35S-F 5' -ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3，；CaMV35S-R 5' -CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3，；(2)检测以棉花基因组DNA为模板，在PCR反应中加入步骤⑴设计的所有引物， 进行PCR、电泳，从而得知所检测的棉花是否为转基因棉花。所述棉花基因组DNA优选通过以下步骤提取得到将棉花籽进行脱绒，用水浸泡 脱绒后的棉花籽5 9h，接着研碎，再提取棉花籽基因组DNA ；所述棉花基因组DNA更优选通过以下步骤提取得到将一粒棉花籽进行脱绒，用 水浸泡脱绒后的棉花籽5 9h，接着研碎，于40 70°C放置30 50min，再提取棉花籽基 因组DNA ；所述的脱绒优选通过浓硫酸进行脱绒；所述的浓硫酸指的是浓度至少为体积百分比98%的硫酸；所述的提取优选通过基因组DNA提取试剂盒进行提取；更优选为按照基因组DNA 提取试剂盒的说明书进行提取，其中的改进之处在于(1)裂解水浴时间延长；(2)离心时 间延长；所述PCR的反应体系优选为其中所用的引物终浓度分别是引物sadl-F和引物 sad 1-R分别为0. 1 μ mo 1 /L、引物⑶S-F和引物⑶S-R分别为0. 4 μ mo 1 /L、引物Cry lAb/Ac-F 和引物 CrylAb/Ac-R 分别为 0. 1 μ mol/L、引物 NPTII-F 和引物 NPTII-R 分别为 0. Iymol/ L、引物NOS-F和引物NOS-R分别为0. 4 μ mol/L、引物CaMV35S_F和引物CaMV35S_R分别为 0.4 μ mol/L ；所述PCR的反应体系更优选为使用PCR反应试剂盒，每50 μ L反应体系中含有 Mix 1 溶液(含 Buffer、dNTP、MgCl2)25yL、Mix 2 (含 Taq DNA 聚合酶)0. 25 μ L，引物终 浓度分别为0. 1,0.4,0. 1,0. 1、0.4、0.41111101/1(依照上述引物顺序)，模板0嫩为150叫， 用双蒸水将体积调整为50 μ L0所述的PCR反应试剂盒优选为Takara宝生物公司的Multiplex PCR AssayKit(DRR060A)；所述PCR的反应条件为94°C Imin -MV 30s, 60. 4°C 90s，72°C 90s，35 个循环； 72°C, IOmin ；所述电泳的条件优选为质量体积比2. 5%的琼脂糖凝胶，80V电泳；上述的检测方法还可应用于大米、菜籽粕或大豆中的转基因成分的鉴定。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)本发明为转基因棉花的检测提供了较为可靠和简便的检测方法，所建立的体 系可重复性高，经多次试验稳定性好。其检测结果与其他检测技术相比，具有更大的可靠性 和适应性，简化了检测步骤，提高了检测效率，从而为转基因棉花的检测提供更有为效的检 测手段。本发明中的内标准基因sad 1相当于阳性对照，这样可以保证抽提得到的棉花基 因组DNA是可以进行PCR的，PCR的反应条件和反应体系是成功的。(2)本发明能成功的从一颗棉花籽中提取到DNA、并将其用于PCR检测，本发明能 从棉花籽中一次测出6种基因，步骤少，效率高，结果准确可靠。因此本发明可应用于较少 数量的样品抽样检测的场合。
图1是实施例1的PCR产物电泳图，其中泳道M为DL2000的核酸分子量标准；泳道1为转基因棉花籽；泳道2为未含转基 因成分的棉花籽。图2是实施例2的PCR产物电泳图，其中泳道M为DL2000的核酸分子量标准；泳道1为质粒PTF102 ；泳道2为转基因大米； 泳道3为转基因菜籽柏；泳道4为转基因大豆。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。实施例1取棉花籽1粒(已知为转基因棉花籽SGK321品系转Bt棉花标准样品，由石家庄 市农业科学研究院提供)，用体积百分比为98%的浓硫酸脱绒处理(参考文献张存信《棉 花种子硫酸脱绒技术》，北京农业)，将脱绒后的棉花籽用水浸泡6h，然后取出放入塑料袋研 碎，接着放入65°C烘箱稍微烘干(30min)，使用基因组DNA提取试剂盒(Promega的wizard genomic DNA purification kit)，按照说明书进行提取，其中的改进之处在于(1)裂解水 浴时间延长，从说明书的20min延长至40min ； (2)离心时间延长，从说明书的5min延长至 8min。提取后棉花籽基因组经紫外分光光度计测定浓度为276ng/ μ L，纯度为0D260/280为 1. 76，将提取后棉花籽DNA稀释成浓度为50ng/ μ L。再取棉花籽一粒(为未含有转基因成分的棉花籽，孟山都农业公司)，重复以上步 骤，最后将提取后棉花籽DNA稀释成浓度为50ng/ μ L。取2支200yLPCR管，加入PCR反应试剂盒(Multiplex PCR Assay Kit，DRR060A， Takara)中 Mix 1 (含 Buffer, dNTP、MgCl2) 25 μ L，Mix 2 (含 Taq DNA 聚合酶)0· 25 μ L,体 系中多重PCR引物的终浓度依次分别为0. 1,0.4,0. 1,0. 1、0. 4、0. 4ymol/L(依照sadl GUS :CrylAb/Ac =NPTII =NOS :CaMV35S顺序)，2支管中分别加入2种样品的模板DNA各 3 μ L (50ng/ μ L)，ddH20将体积调整为50 μ L。将PCR反应管放入PCR仪中，以94°C，Imin ； 940C，30s, 60. 4°C，90s, 72°C，90s, 35 个循环；72°C，IOmin 条件扩增，分别取反应液 8 μ L 进 行DNA琼脂糖凝胶电泳(胶浓度为2.5%)，在凝胶成像仪中成像(如图1所示)。泳道1有 5条清晰条带，从大到小依次为sadl基因、CrylAb/Ac基因、NPTII基因、NOS基因和CaMV35S 基因，证明此棉籽中含有CrylAb/Ac、NPTII、N0S、CaMV35S共4种外源基因。泳道2所示只 有1条清晰条带，是内源sad 1基因，证明此棉花籽中不含⑶S基因、Cry lAb/Ac基因、NPTII 基因、NOS基因和CaMV35S基因。实施例2用基因组DNA试剂盒分别提取大米、菜籽粕和大豆的基因组DNA。提取后三种样品 基因组DNA稀释成浓度为50ng/ μ L。取质粒PTF102(购自Promega公司)(50ng/μ L)作为对照。取4支200 μ LPCR管， 加入 PCR 反应试剂盒(Multiplex PCR Assay Kit, DRR060A, Takara)中 Mix 1 (含 Buffer、 dNTP、MgCl2) 25 μ L，Mix 2 (含Taq DNA聚合酶)0. 25 μ L，体系中引物终浓度分别为0. 1、
50. 4,0. 1,0. 1、0· 4、0. 4ymol/L (依照 sadl :GUS :CrylAb/Ac =NPTII :N0S :CaMV35S 顺序)。4 支管中分别加入4种样品的模板DNA各3 μ L (50ng/ μ L)，ddH20将体积调整为50 μ L。将PCR 反应管放入 PCR 仪中，以 94°C, Imin ；94°C，30s，60. 4°C，90s，72°C，90s，35 个循环；72°C, IOmin条件扩增，分别取反应液8 μ L进行DNA琼脂糖凝胶电泳(胶浓度为2.5%)，在凝胶成 像仪中成像(如图2所示)。泳道1有三条清晰条带，证明此质粒PTF102中含有⑶S、N0S、 CaMV35S共3种外源基因；泳道2有4条清晰条带，证明此大米中含有CrylAb/Ac、NPTII, NOS、CaMV35S共4种外源基因；泳道3有3条清晰条带，证明此菜籽粕中含有NPTII、N0S、 CaMV35S共3种外源基因；泳道4有2条清晰条带，证明此大豆样品中含有N0S、CaMV35S共 2种外源基因。综合以上结果，本研究所建立的六重PCR体系能有效的检测出棉花籽、PTF102质 粒、大米、菜籽柏、大豆中的转基因成分，由此证明以上建立的六重PCR体系用来检测棉花 中转基因成分是可行的，检测方法效率高、简便、准确。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种快速鉴定棉花中转基因成分的检测方法，其特征在于包含以下步骤(1)设计多重PCR的6对引物，分别为sad1 F5’ CCACGAGACAGCCTATACCAAAAT 3’；sad1 R5’ CCCTAACCAAAGCCACGCA 3’；GUS F5’ CTGCGACGCTCACACCGATACC 3’；GUS R5’ TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG 3’；Cry1Ab/Ac F5’ GAAGGATTGAGCAATCTCTACCAA 3’；Cry1Ab/Ac R5’ TTCCAATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3’；NPTII F5’ CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA 3’；NPTII R5’ CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG 3’；NOS F5’ TGAATCCTGTTGCCGGTCTT 3’；NOS R5’ AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC 3’；CaMV35S F5’ ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT 3’；CaMV35S R5’ CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT 3’；(2)检测以棉花基因组DNA为模板，在PCR反应中加入步骤(1)设计的所有引物，进行PCR、电泳，从而得知所检测的棉花是否为转基因棉花。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的棉花基因组DNA通过以下步 骤提取得到将棉花籽进行脱绒，用水浸泡脱绒后的棉花籽5 9h，接着研碎，再提取棉花 籽基因组DNA。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述棉花基因组DNA通过以下步骤 提取得到将一粒棉花籽进行脱绒，用水浸泡脱绒后的棉花籽5 9h，接着研碎，于40 70°C放置30 50min，再提取棉花籽基因组DNA。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述的脱绒通过浓硫酸进行脱绒；所 述的浓硫酸指的是浓度至少为体积百分比98%的硫酸。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述的提取通过基因组DNA提取试 剂盒进行提取。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述提取为按照所述基因组DNA提取 试剂盒的说明书进行提取，其中的改进之处在于(1)裂解水浴时间延长；(2)离心时间延长。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述PCR的反应体系为其中所用 的引物终浓度分别是引物sadl-F和引物sadl-R分别为0. 1 μ mol/L、引物⑶S-F和引物 GUS-R 分别为 0. 4μ mol/L、引物 CrylAb/Ac-F和引物 CrylAb/Ac-R 分别为 0. 1 μ mol/L、引物 NPTII-F 和引物 NPTII-R 分别为 0. 1 μ mo 1 /L、引物 NOS-F 和引物 NOS-R 分别为 0. 4 μ mo 1 /L、 引物 CaMV35S-F 和引物 CaMV35S_R 分别为 0. 4 μ mol/L。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于所述PCR的反应条件为94°CImin ； 940C 30s, 60. 4°C 90s, 72°C 90s，35 个循环；72°C，lOmin。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述电泳的条件为质量体积比2.5% 的琼脂糖凝胶，80V电泳。
10.权利要求1 9任 项所述的检测方法应用于大米、菜籽粕或大豆中的转基因成分 的鉴定。
全文摘要
本发明公开了一种快速鉴定棉花中转基因成分的检测方法及其应用。本发明提供了sad1基因、GUS基因、Cry1Ab/Ac基因、NPTII基因、NOS基因和CaMV35S基因的引物，总共6对，将其应用于同一个PCR反应体系中，能从棉花籽中一次测出6种基因，步骤少，效率高，结果准确可靠。本发明为转基因棉花的检测提供了较为可靠和简便的检测方法，所建立的体系可重复性高，经多次试验稳定性好。其检测结果与其他检测技术相比，具有更大的可靠性和适应性，简化了检测步骤，提高了检测效率，从而为转基因棉花的检测提供更有为效的检测手段。
文档编号C12Q1/68GK101956011SQ20101029004
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月20日 优先权日2010年9月20日
发明者吴希阳, 芦春斌, 陈贞 申请人:暨南大学