专利名称：基于核酸内切酶消化的甲基化dna检测方法
技术领域：
本发明涉及一种甲基化DNA的检测方法，尤其涉及一种不易受干扰的甲基化DNA 的检测方法。
背景技术：
DNA甲基化是指DNA链上CpG位点的胞嘧啶(C)残基的5，碳上被修饰了一个甲基。DNA甲基化是最早发现的DNA修饰之一，是表观遗传学的重要组成部分。DNA甲基化特征性地发生在DNA链上的CpG 二核苷酸的胞嘧啶残基上，这常见于基因5’端表达调控序列。 DNA甲基化在基因表达的调控中具有重要作用，参与了动物胚胎发育、基因印记和X染色体失活等过程。研究表明，DNA甲基化的改变能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及蛋白质互相作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素。CpG岛局部甲基化水平的异常升高，可以导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率就会提高。所以DNA甲基化引人注目的地方就是在肿瘤的早期检测中的应用，因为研究表明表观遗传的变化伴随肿瘤的发生与发展，检测DNA甲基化的改变可以有助于肿瘤的早期发现。目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期预测。CpG岛甲基化的检测方法众多，其原理分别基于甲基化敏感的限制性内切酶消化法和基于亚硫酸钠修饰DNA的PCR检测法。甲基化敏感性限制性内切酶/Southern法 (methyIation-sensitive restriction Endonuclease/Southern, MSRE- Southern)是比较传统的方法，灵敏度低，样品需要量大。甲基化DNA特异性PCR法(Methylation Specific PCR, MSP)及其衍生的甲基化DNA检测方法，是目前检测DNA甲基化的常用方法，具有高灵敏度的同时，假阳性率也很高。
发明内容
本发明提供了一种甲基化DNA的检测方法，能够有效的分离出甲基化DNA和非甲基化DNA，并且解决了现有技术局限性大、方法复杂、需要样本量大、容易被干扰、不适用混合样本等缺点，可以在分析DNA甲基化时可以使用全自动DNA序列分析仪，在维持其可靠性的同时，提高了检测的灵敏度。并且由于这一技术可以同时检测多个基因序列，使得检测的速度得到提高。本发明甲基化DNA的检测方法，步骤如下
步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA，和标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA ； 步骤2，在要检测的目标区域内，选择含多个CpG位点的一段序列，以所选序列5’端的一部分的作为正向引物，以所选序列3’端的一段序列的互补序列作为反向引物；在正向引物的5’末端加上一段20个碱基长度的T7启动子序列作为T7尾引物，在反向引物的5’末端加上一段20个碱基长度的T3启动子序列作为T3尾引物；合成T3尾引物和T7尾引物， 并对T7尾引物进行荧光标记；
步骤3，亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，加入DNA聚合酶、荧光染料，用所述正向和反向PCR引物在实时定量PCR扩增仪中分别进行扩增，并测定标准甲基化和非甲基化DNA扩增产物的解链温度；
步骤4，用所述PCR引物，在与步骤3相同的条件下对亚硫酸盐处理过的待测DNA进行 PCR扩增，得到PCR产物；
步骤5，将步骤4所得PCR扩增产物进行加热，使其温度高于非标准甲基化DNA相应的 PCR扩增产物解链温度，而低于标准甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度；
步骤6，立即将步骤5中加热的PCR产物进行冷却，加入单链DNA特异性核酸内切酶进行消化，得到消化产物；
步骤7，以步骤6所得的经消化后的PCR产物为模板，加入T3尾引物和荧光标记的T7 尾引物、DNA聚合酶进行第二次PCR扩增；用核酸分析仪测定PCR扩增产物DNA片段在毛细管电泳的迁移率；
步骤8，将步骤7所测结果与标准样品对照，如果待测样品中出现与甲基化DNA标准样品一致的迁移率信号，则存在甲基化DNA;反之，则不存在。所述步骤1中，亚硫酸盐优选为亚硫酸钠；所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为，以0. 3M的NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0. 5mM氢醌组成的pH值为5. 0的混合液，60°C避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。所述步骤2中，使所设计的PCR引物为1纩32碱基长度，所述引物序列中CpG位点数量为(Γ3个，且所设计的引物的3’端的最后一个碱基不处于CpG的C的位置；并使PCR 扩增后的DNA片段大小为8(Γ180碱基长度，使PCR扩增的序列中含有8 20个CpG位点。进一步地，在引物序列所涉及的CpG位点的C位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A混合代替G。其中，CpG指胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和连接二者的磷酸酯键(P)组成位点；T指胸腺嘧啶，A指腺嘌呤。 所述步骤6中，优选为使用冰水浴降温冷却，所述单链DNA特异性核酸内切酶可以是为Τ7核酸内切酶I、Sl核酸酶或绿豆核酸酶中的一种或几种的混合。所述步骤7中，核酸分析仪为CEQ8000 DNA测序仪。上述检测方法，其中，所用DNA聚合酶优选为Taq DNA聚合酶；所述Τ7尾引物荧光标记标记优选为D4。其中，所述待测DNA为从各种样品中制备的人类基因组DNA，所述标准非甲基化 DNA与标准甲基化DNA为已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组DNA。其中，所述待测DNA样品为人类正常DNA，癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、 血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。如
所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、 淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；
所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；
所述体液为血液、脑脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液或阴道分泌液。以亚硫酸盐处理过的待测DNA中由于非甲基化的胞嘧啶(C)被转变为尿嘧啶(U) 而甲基化时GC位点的胞嘧啶(C)因甲基化而维持不变。由于Taq DNA聚合酶将U识别为 T，使得非甲基化DNA的PCR扩增产物的GC含量降低，相应的解链温度降低。利用这一特征， 在将PCR加热到一个特定的温度，使非甲基化DNA的PCR产物先变性解链而被消化，使甲基化DNA相应的PCR产物得以富集，从而使这一技术可以检测到样品中存在的甲基化DNA，甚至是低丰度的甲基化DNA。综上所述，本发明提供的一种甲基化DNA检测方法具有适用范围大、方法简单、需要样本量小、不易被干扰、适用混合样本等优点。在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。
图1为本发明甲基化DNA检测方法流程图。
具体实施例方式参照图1，对本发明甲基化DNA检测方法具体介绍如下 实施方式(一)
步骤1，用亚硫酸盐处理和标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA。其中，所述亚硫酸盐具体为亚硫酸钠；亚硫酸盐处理的待测DNA可以具体为人类基因组基因。所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为，以0. 3M NaOH变性待测DNA，加入含有5M亚硫酸钠、0. 5mM氢醌组成的pH值为5. 0的混合液，60°C避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。待测DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)通过上述处理过程转变为尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶(C)维持不变。其中所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA指的是已知的纯非甲基化DNA与甲基化DNA。步骤2，设计并合成PCR引物。在要检测的目标区域内，选择一段富含CpG位点的序列，以该序列5’端的部分作为正向引物，以该序列3’端的一段序列的互补序列作为反向引物；在正向引物的5’末端加上一段T7启动子序列作为T7尾引物序列，在反向引物的5’末端加上一段T3启动子序列作为T3尾引物序列。优选地，在所要检测的基因序列中，选择富含CpG位点的一段序列作为目标检测序列，并以该段序列的5’端的一段序列作为正向PCR引物，以该段序列3’端的一段序列的互补序列作为反向PCR引物；并使所设计的PCR引物为18 32碱基长度，引物序列中CpG位点数量为(Γ3个，且所设计的引物的3’端的最后一个碱基不处于CpG的C的位置；使PCR 扩增后的DNA片段大小为8(Γ180碱基长度，并使PCR扩增的序列中含有8 20个CpG位点。并且，在引物序列所涉及的CpG位点的C位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A混合代替G。在正向引物的5’末端加上一段20个碱基长度的Τ7启动子序列作为Τ7尾引物，在反向引物的5’末端加上一段20个碱基长度的T3启动子序列作为T3尾引物；合成T7和 T3尾引物，并使T7尾引物中带有荧光标记；其中，T7引物荧光标记可以是D4。步骤3，亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，加入DNA 聚合酶和荧光染料，用步骤2所述正向和反向PCR引物，分别进行PCR扩增，并测定标准甲基化和非甲基化DNA扩增产物的解链温度。其中，所述DNA模板包括甲基化和非甲基化DNA，用量为2. 5 10纳克均可，在实时定量PCR扩增仪中进行PCR扩增反应。其中所述的PCR操作过程，由正向和反向PCR引物、PCR扩增缓冲液(Buffer)、 Taq DNA聚合酶、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNIPs)、所述亚硫酸钠处理过的DNA模板 (Template)与纯水组成的PCR体系，以荧光染料STOR Green I为指示剂，采用实时定量 PCR仪进行扩增，并进行解链温度测定，分别测定标准甲基化DNA和标准非甲基化DNA样品的PCR产物的解链温度。步骤4，将一定量的亚硫酸钠处理过的标准非甲基化DNA，与梯度稀释的亚硫酸钠处理过的标准甲基化DNA混合，作为待测样品；在与步骤3相同条件的下对所述待测DNA进行PCR扩增。其中，相同条件是指与步骤3相同浓度的PCR引物，PCR扩增缓冲液(Buffer)、Taq DNA聚合酶和四种三磷酸脱氧核糖核苷酸，相同的PCR条件和PCR扩增仪和相同的荧光染料，但不进行解链温度测定。步骤5，将步骤4中所得PCR产物进行加热至一个特定温度，使这一温度高于非甲基化DNA相应的PCR产物解链温度，而低于甲基化DNA相应的PCR产物的解链温度。其中，特定温度是指根据步骤2测定的甲基化DNA和非甲基化DNA的PCR产物的解链温度，这一温度高于非甲基化DNA相应的PCR产物解链温度，而低于甲基化DNA相应的 PCR产物的解链温度。加热温度在甲基化DNA和非甲基化DNA PCR扩增产物解链温度之间， 在此温度下，可以使非甲基化DNA相应的PCR产物解链成为单链而甲基化DNA相应的PCR 产物则维持双链状态。步骤6 立即冷却降温，冷却方式优选为冰水浴降温。加入对单链DNA特异的核酸内切酶并在适当条件下进行消化处理。所述对单链DNA特异的核酸内切酶可以是T7核酸内切酶I、Sl核酸酶或绿豆核酸酶，或者是上述几种的混合。步骤7，以步骤6所得的消化产物作为PCR反应模板，在与步骤4相同的条件下进行实时定量PCR扩增，并进行解链曲线测定和判断检测结果。其中，相同条件是指与步骤4相同浓度的PCR引物，PCR扩增缓冲液(Buffer )、Taq DNA聚合酶和四种三磷酸脱氧核糖核苷酸，相同的PCR条件和PCR扩增仪和相同的荧光染料。步骤8 判断是否存在甲基化DNA。判断方法为如果在待测DNA样品中检测到与标准甲基化DNA相应的PCR产物一致的电泳迁移率的信号，则表明待测样品中存在甲基化DNA;反之，则不存在。本发明一种甲基化DNA检测方法，通过上述步骤检验本发明的准确度和灵敏度。实施方式(二)在实施方式(一)的基础上，以实际临床样品提取的DNA为待测样品，在与上述实施方式 (一)相同的条件下，检验本发明的实用性。其中，与上述在实施方式(一)相同的条件，指的是除以实际临床样品提取的DNA为待测样品外，所有操作与上述在实施方式(一)相同。所述临床提取的待测DNA样品，为人类正常和癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、各种体液DNA或各种排泄物DNA的样品。所述癌细胞可以是肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；所述肿瘤组织可以是肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；所述各种体液可以是血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液等。实施方式(三)
在实施方式(一)和(二)的基础上，以P16基因转录启动区的序列为例，具体PCR引物设计如下
P16基因转录启动区的甲基化是肺癌等多种癌症细胞具有的特征。P16基因转录启动区的序列如下
Homo sapiens pl6 protein(CDKN2A)gene,CpG island and partial cds,DQ325544.1 CGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCG GGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGCTCGGGTAGAGGAGGTGC GGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCG 甲基化DNA序列，下划线部分为要检测的区域； CGGATCGCGTGCGTTCGGCGGTTGCGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGCG GGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGTTTTCGGTTGATTGGTTGGTTACGGTCGCGGTTCGGGTTCGGGTAGAGGAGGTGC GGGCGTTGTTGGAGGCGGGGGCGTTGTTTAACGTATCGAATAGTTACGGTCGGAGGTCG 非甲基化DNA序列，下划线部分为要检测的区域； TGGATTGTGTGTGTTTGGTGGTTGTGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGTGGGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTG GGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTTTTTGGTTGATTGGTTGGTTATGGTTGTGGTTTGGGTTTGGGTAGAGGAGGTGT GGGTGTTGTTGGAGGTGGGGGTGTTGTTTAATGTATTGAATAGTTATGGTTGGAGGTTG 所设计的PCR引物
正向引物 5’ - GTTGYGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAG-3’ 反向引物 5，- TTAAACAACRCCCCCRCCTCCAACAA-3， 在正向和反向引物的5’端分别加上T7和T3引物作为尾引物。T7 尾引物5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3， T3 尾引物5’ -ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’
然后，按照实施方式(一)和(二)所述的方法，进行检测。上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
权利要求
1.一种基于核酸内切酶消化的甲基化DNA检测方法，其特征在于，步骤如下 步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA，和标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA ；步骤2，在要检测的目标区域内，选择一段含多个CpG位点的序列，以所选序列5’端的一部分的作为正向引物，以所选连续序列3’端的一段序列的互补序列作为反向引物；在正向引物的5’末端加上一段20个碱基长度的T7启动子序列作为T7尾引物序列，在反向引物的5’末端加上一段20个碱基长度的T3启动子序列作为T3尾引物序列；合成T7尾引物和T3尾引物，并对T7尾引物进行荧光标记；步骤3，亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，加入DNA聚合酶、荧光染料，用所述正向和反向PCR引物，在实时定量PCR扩增仪中分别进行扩增，并测定标准甲基化和非甲基化DNA扩增产物的解链温度；步骤4，用所述PCR引物，在与步骤3相同的条件下对亚硫酸盐处理过的待测DNA进行 PCR扩增，得到PCR产物；步骤5，将步骤4所得PCR扩增产物进行加热，使其温度高于非标准甲基化DNA相应的 PCR扩增产物解链温度，而低于标准甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度；步骤6，立即将步骤5中加热的PCR产物进行冷却，加入单链DNA特异性核酸内切酶进行消化，得到消化产物；步骤7，以步骤6所得的经消化后的PCR产物为模板，加入T3尾引物和带有荧光标记的T7尾引物、DNA聚合酶进行第二次PCR扩增；用核酸分析仪测定PCR扩增产物DNA片段在毛细管电泳的迁移率；步骤8，将步骤7所测结果与标准样品对照，如果待测样品中出现与甲基化DNA标准样品一致的迁移率信号，则存在甲基化DNA;反之，则不存在。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，使所设计的PCR引物为1圹32碱基长度，引物序列中CpG位点数量为(Γ3个，且所设计的引物的3’端的最后一个碱基不处于CpG 的C的位置；并使PCR扩增后的DNA片段大小为8(Γ180碱基长度，使PCR扩增的序列中含有多个CpG位点。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，在所述引物序列中所涉及的CpG位点的C位置，正向引物用C/T混合代替C，反向引物用G/A混合代替G。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1中所述亚硫酸盐具体为亚硫酸钠；所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为以0. 3Μ的NaOH变性待测DNA，加入由5Μ亚硫酸钠、0. 5mM氢醌组成的pH值为5. 0的混合液，60°C避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述单链DNA特异性核酸内切酶为 T7核酸内切酶I、Sl核酸酶或绿豆核酸酶中的一种或几种的混合；所用DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶；所述核酸分析仪为CEQ8000 DNA测序仪，所述T7尾引物荧光标记标记为D4。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤6中，用冰水浴进行冷却。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA为人类基因组DNA，所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA为于待测DNA相匹配的、已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组DNA。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人类正常DNA， 癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。
9.根据全力要求8所述的检测方法，其特征在于，所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、 淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；所述体液为血液、脑脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液或阴道分泌液。
全文摘要
本发明涉及一种甲基化DNA检测方法，步骤包括步骤1，亚硫酸盐处理待测DNA和标准甲基化DNA和非甲基化DNA；步骤2，合成带有尾引物序列的PCR引物；步骤3，扩增标准甲基化DNA和非甲基化DNA样品，并测定扩增产物解链温度；步骤4，扩增待测DNA样品；步骤5，对待测DNA扩增产物进行加热至一特定温度；步骤6，进行消化；步骤7，以带有荧光标记的尾引物进行第二次PCR扩增；步骤8，测定电泳迁移率，判定样品中是否含有甲基化DNA。本发明甲基化DNA检测方法，具有适用范围大、方法简单、需要样本量小、不易被干扰、适用混合样本等优点，在多种肿瘤疾病的早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。
文档编号C12Q1/44GK102399861SQ201010283090
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者王建 申请人:上海迦美生物科技有限公司