专利名称：：一站式pcr方法
技术领域：
：本发明涉及一种核酸扩增和检测的新方法，属于分子生物学
技术领域：
。
背景技术：
：聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)自1990年由美国科学家、诺贝尔化学奖得主KarryBankMullis博士发明以来(Mullis，K.B.1990.Theunusualoriginofthepolymerasechainreaction.SciAm262,56-61.),Η^ηΤ^^Βfe]^!,目的基因片段的指数级复制，现在已经成为体外核酸扩增的最主要手段，广泛应用于生物学研究的各个领域。在Mullis博士提出的“PCR”概念的基础上，科学家们探索、发展出了几十种PCR的衍生技术，比如重组PCR，不对称PCR，原位PCR等，极大地方便了生物学科研工作者开展各胃舌云力(Wei,K.,Wei,S.,Moralejo,D.H.,Yamada,Τ.,0gino,T.,andMatsumoto,K.AnefficientmultiplexPCRsuitableforlargescaletypinginlinkagemapping.JVetMedSci1999，61，849-851.)。作为一项重要的常规分子生物学技术，PCR在实际应用中往往会碰到如下问题(I)PCR反应的扩增效率还不够高；(2)PCR扩增的灵敏度有限；(3)在进行大规模文库筛选等实验时，加入点样缓冲液并混勻样品这一步骤会消耗大量时间和精力；(4)用于核酸染色的染料如EB，SYBRGreen等具有毒性，不仅直接危害实验人员的身体健康，同时也造成不同程度的环境污染(Huang，Q.，andFu,W.L.ComparativeanalysisoftheDNAstainingefficienciesofdifferentfluorescentdyesinpreparativeagarosegelelectrophoresis.ClinChemLabMed2005，43，841-842.)。因此，发展一种高效、无毒、操作便捷的PCR方法，是实践中面临的主要挑战之一。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种无毒和高效的PCR反应的新方法。本发明为解决上述技术问题，所提供的技术方案是一种新型PCR反应方法，依次包括如下步骤(1)兼容染料混合物(compatibledyemix)的配制，所述兼容染料混合物由聚蔗糖400(Ficoll400)、甲酚红、柠檬黄和Gelred组成；(2)PCR主体混合物(mastermix)的配制，所述主体混合物由兼容染料混合物、dNTP、TaqDNA聚合酶和反应缓冲液组成；(3)PCR反应体系的配置；(4)PCR反应条件的设定与运行；(5)PCR产物的检测。所述聚蔗糖400(FicO11400)以蔗糖和环氧氯丙烷为原料，利用蔗糖和3_氯-1，2_环氧丙烷共聚作用制成的一种水溶性高聚物，分子量约为4X105。在本发明中，聚蔗糖3400的工作浓度为2%(质量/体积)，既有沉降剂的作用，又可以保护TaqDNA聚合酶在不断热激的条件下保持较高的活性，从而提高扩增效率。所述甲酚红(Cresolred)是一种三芳基甲烷染料，分子式是C21H18O5S,分子量382.43。其红棕色或红绿色粉末，能溶于碱溶液，微溶于甲醇和乙醇，几乎不溶于丙酮和苯。在本发明中，甲酚红的工作浓度是0.004%(质量/体积)，用作电泳指示剂。所述柠檬黄(Tartrazine)为橙黄色的无臭颗粒或粉末，易溶于水、甘油、丙二醇，微溶于乙醇，不溶于油脂。溶于水呈黄色。在本发明中，柠檬黄的工作浓度为0.016%(质量/体积)，用作电泳指示剂。所述的Gelred为近年来发明的EB的替代品，具有高灵敏度和无毒易处理的双重优点，在实际的核酸检测中已得到越来越广阔的应用。而且，Gelred的激发波长和发射波长相同，因此凡是适用于EB的凝胶成像系统也适用于Gelred染色的核酸检测。本发明中所用Gelred购自美国Biocompare公司，原液的浓度为10000X，本发明中Gelred的工作浓度是0.25X(质量/体积)。所述dNTP为dATP，dCTP，dGTP，dTTP四种脱氧核糖三磷酸的混合物，贮存浓度为40mmol/l(10mmol/l/每种)，每种脱氧核糖三磷酸的工作浓度为lmmol/1。所述的TaqDNA聚合酶是嗜热性细菌Thermusaquaticus来源的热稳定重组型TaqDNA聚合酶，分子量为94KD。扩增片段的长度可达5kb(简单模板)。延伸速度为0.9-1.2kb/分钟(70-75°C)。该酶具有5’一3’聚合酶活性，无3’一5’外切酶活性。所述的反应缓冲液的配方和工作浓度如下MgSO42mmol/lKCl10mmol/l(NH4)2SO48mmol/lTris-HCl(pH9.0)10mmol/lNP-400.05vol%所述PCR反应的运行包括常规PCR，多重PCR，半定量PCR，长片段PCR，高GC含量PCR等。所述的PCR产物检测主要是指琼脂糖凝胶电泳。在制备琼脂糖凝胶时不需要额外添加核酸染料，也不需要单独制备或贮存核酸染料。所述的PCR产物检测所用的凝胶成像系统，只要适合EB的成像检测，即可适用于使用本发明所获得PCR产物的检测。所述的PCR产物的纯化过程是指乙醇沉淀、硅胶膜过滤。使用本发明获得的PCR产物，均带有A尾，可以进行T/A克隆。经测序证明，本发明不会引起碱基突变，可以满足基因克隆等实验的要求。本发明方法是通过在常规PCR反应体系中添加沉降剂、指示剂、染色剂实现的，不仅可有效提高PCR反应的效率和灵敏度，还实现了PCR反应后产物的直接点样电泳和无毒即时染色。所添加的沉降剂、指示剂、染色剂对PCR反应本身没有任何负面影响，且均为常见的化学试剂，价格便宜，易于保存，使用方便；该方法还实现了与多种下游分子生物学操作的兼容性，具有广阔的应用前景。本发明的有益效果在于1)使用本发明实施PCR反应时，不仅反应体系的配制简便易行，易于掌握，而且扩增效率和灵敏度高，副作用少，大大提高了PCR反应的成功率。2)本发明预先混合了电泳所需的指示剂和沉降剂，因而实现了在PCR反应之后可以直接吸取产物进行电泳检测，省去了传统PCR反应之后需要另外加入点样缓冲液并混勻样品再进行电泳的步骤，大大减少了操作时间，提高了工作效率。特别是在进行高通量实验如菌落PCR时，快捷、省时、高效的效果更为明显。3)本发明预先混合了无毒的核酸染料Gelred，研究人员在进行PCR产物的检测时只需要制备琼脂糖凝胶即可，不需要额外制备或配制专门的核酸染色液，有效降低实验人员接触有毒物质的风险。而且其激发和发射光谱与EB—致，所以适用于EB的凝胶成像系统也适用于本发明的PCR产物成像检测，无需更换现有的成像设备。4)使用本发明获得的PCR产物，兼容多种下游操作，可直接进行乙醇沉淀，浓缩、回收目的片段；可直接使用商业化的PCR产物纯化试剂盒，纯化、回收目的片段。回收片段的得率、纯度与常规PCR反应具有相似的结果。图1一站式PCR和常规PCR产物的电泳迁移率对比。图2—站式PCR和PCR试剂盒扩增能力对比。图3—站式PCR和常规PCR高效扩增复杂模板对比。图4一站式PCR和常规PCR下游实验对比。具体实施例方式一种新型PCR反应方法，依次包括如下步骤(1)兼容染料混合物(compatibledyemix)的配制，所述兼容染料混合物由聚蔗糖400(Ficoll400)、甲酚红、柠檬黄和Gelred组成；(2)PCR主体混合物(mastermix)的配制，所述主体混合物由兼容染料混合物、dNTP、TaqDNA聚合酶和反应缓冲液组成；(3)PCR反应体系的配置；(4)PCR反应条件的设定与运行；(5)PCR产物的检测。下面以具体的实施例说明一站式PCR的操作流程和实际用途。实施例1，5X兼容染料混合物的配制(IOOml)(1)干净的烧杯中加入80mlPCR级别的纯水；(2)称取IOgFicoll400干粉，加入上述纯水中，注意一边加入一边用磁力搅拌器旋转混勻，不要使Ficoll400结块，否则影响后续点样的沉降效果；(3)称取0.02g甲酚红，加入到步骤(2)的溶液中，磁力搅拌助溶；(4)称取0.08g柠檬黄，加入到步骤(3)的溶液中，磁力搅拌助溶；(5)将步骤(4)的溶液放到70°C温箱中高温加热助溶，时间为1小时，期间每隔10分钟左右用力摇勻，此时可看到溶液呈现透明的黄红色，为正常颜色；(6)将步骤(5)的溶液取出冷却后，加入适量PCR级别的纯水定容至IOOml；(7)在步骤(6)的溶液中加入10000XGelred原液12.5ul，此时Gelred的浓度为1.25X。(8)将步骤(7)的溶液用0.45um滤膜过滤，此溶液即为5X兼容染料混合物溶液。其中，甲酚红和柠檬黄购自美国Amresco公司，聚蔗糖400购自美国Sigma公司，Gelred购自美国Biocompare公司，纯度为分子生物学级别。5X兼容染料混合物溶液配制完毕后，避光条件下在2-8°C可长期保存。在配制5X兼容染料混合物溶液的过程中，应注意各个组分充分溶解，最终的状态呈现为透明的黄红色，略黏稠。实施例2，2XPCR主体混合物配制2XPCR主体混合物配制，各成分和使用量如下表所示5X兼容染料混合物4ulIOX反应缓冲液2uldNTP(10mmol/l每种)0.5ulTaqDNA聚合酶(5units/ul)0.2ulPCR级别纯水3.3ul_总体积IOul按照上表顺序依次混勻各组分，可按比例放大配制。其中，TaqDNA聚合酶，dNTP，IOX反应缓冲液均购自上海申能博彩生物科技有限公司。2XPCR主体混合物可用1.5ml离心管分装，Iml/管，避光条件下在_20°C可长期保存。2XPCR主体混合物的正常颜色为深红色。实施例3—站式PCR不影响产物的电泳迁移率(图1)(1)以人Hela细胞cDNA为模板(以2μg总RNA制备)，扩增β-actincDNA0.lkb，0.2kb，0.3kb，0.4kb，0.5kb，0.75kb的片段。反应体系的配制如下2XPCR主体混合物IOul上游引物(IOuM)0.5ul下游引物(IOuM)0.5ul模板cDNA1μ1水8ul总体积20ul(2)反应条件为940C2min预变性940C15sec变性)580C15sec退火[30个循环720CImin延伸—72"C5min总延伸(3)PCR反应结束后，取5μ1产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。由图1的结果可知，一站式PCR对PCR产物的电泳迁移率没有影响。实施例4一站式PCR具有高效扩增能力(图2)(1)以人Hela细胞cDNA为模板(以2yg总RNA制备)，梯度稀释(1/1，1/10，1/100)后扩增-actin0.4kb的片段。反应体系为2XPCR主体混合物IOul上游引物(IOuM)0.5ul下游引物(IOuM)0.5ul模板cDNAIul水8ul总体积20ul(2)反应条件为940C2min预变性940C580C15sec变性、15sec退火30sec延伸30个循环720C72"C5min总延伸(3)同时，以商品化的PCR试剂盒作为对照，分别是上海申能博彩TaqDNA聚合酶，立陶宛Fermentas公司的DreamTaqDNA聚合酶，上海DBI公司的蓝色PCR主体混合物。反应体系的配制和条件同上。力。(4)PCR反应结束后，取5μ1产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。由图2的结果可知，与商品化的PCR试剂盒相比，一站式PCR具备高效的扩增能实施例5—站式PCR可高效扩增复杂模板(图3)(1)人Η19RNA的GC含量在80%左右。以含有Η19RNA的质粒为模板，采用--站式PCR和常规PCR分别扩增相应的片段，比较二者对复杂模板的扩增能力。反应体系如下2XPCR主体混合物IOul上游引物(IOuM)0.5ul下游引物(IOuM)0.5ul质粒DNAlul(10ng/ul)水8ul总体积20ul(2)反应条件为940C2min预变性7940C15sec变性)580CI5Sec退火[30个循环720C2min延伸—72"C5min总延伸(3)PCR反应结束后，取5μ1产物用的琼脂糖凝胶进行电泳检测。由图3的结果可知，二者在扩增复杂模板方面，均具有较高的扩增效率，说明一站式PCR适合复杂条件的PCR反应。实施例6—站式PCR兼容下游实验(图4)(1)以乙醇沉淀和硅胶膜纯化的方法检测一站式PCR是否可以兼容下游的操作。以人Hela细胞cDNA为模板(以2μg总RNA制备)，采用一站式PCR和常规PCR扩增β-actin0.4kb的片段。反应体系为2XPCR主体混合物IOul上游引物(IOuM)0.5ul下游引物(IOuM)0.5ul模板cDNAIul水8ul总体积20ul(2)反应条件为940C2min预变性940C15sec变性〕580C15sec退火[30个循环720C30sec延伸一72"C5min总延伸(3)反应结束后，PCR产物实施下列两组实验(i)在PCR产物中加入1/10体积的醋酸钠(pH值为5.2)和2倍体积乙醇，冰浴放置15分钟。用台式离心机以12000g的转速离心10分钟，沉淀用等体积的双蒸水回溶。(ii)硅胶膜纯化试剂盒购自上海杰瑞生物科技有限公司。简要步骤为在PCR产物中加入3倍体积的结合缓冲液，然后加到硅胶膜柱子中，离心去除上清液，用等体积双蒸水将吸附于硅胶膜上的PC产物回溶。由图4的结果可知，一站式PCR中添加的各种化学成分对乙醇沉淀和硅胶膜纯化的实验效果没有任何负面影响，说明一站式PCR与PCR反应的下游实验是兼容的。8权利要求一站式PCR方法，其特征在于依次包括如下步骤(1)兼容染料混合物的配制，所述兼容染料混合物由聚蔗糖400、甲酚红、柠檬黄和Gelred组成；(2)PCR主体混合物的配制，所述主体混合物由兼容染料混合物、dNTP、TaqDNA聚合酶和反应缓冲液组成；(3)PCR反应体系的配置；(4)PCR反应条件的设定与运行；(5)PCR产物的检测。2.根据权利要求1所述的一站式PCR方法，其特征在于所述PCR反应的运行方法包括常规PCR、多重PCR、半定量PCR、长片段PCR和高GC含量PCR。3.根据权利要求1所述的一站式PCR方法，其特征在于所述聚蔗糖400的工作浓度为2%(质量/体积)。4.根据权利要求1所述的一站式PCR方法，其特征在于所述甲酚红的工作浓度是0.004%(质量/体积)。5.根据权利要求1所述的一站式PCR方法，其特征在于所述柠檬黄的工作浓度为0.016%(质量/体积)。6.根据权利要求1所述的一站式PCR方法，其特征在于所述Gelred的工作浓度是0.25X(质量/体积)。全文摘要本发明属于生物化学与分子生物学领域，涉及一种新型PCR反应方法，依次包括如下步骤1)兼容染料混合物的配制，所述兼容染料混合物由聚蔗糖400、甲酚红、柠檬黄和Gelred组成；2)PCR主体混合物的配制，所述主体混合物由兼容染料混合物、dNTP、TaqDNA聚合酶和反应缓冲液组成;3)PCR反应体系的配置；4)PCR反应条件的设定与运行；5)PCR产物的检测。本发明方法实现了PCR反应后的直接点样电泳和即时染色。此外，本发明使用了无毒的核酸染料，是一种低成本、高效率、无毒性的PCR反应新方法。使用本发明得到的PCR产物，可以直接进行多种下游操作如乙醇沉淀、硅胶膜产物纯化等。本发明方法适用于与PCR有关的基因表达检测、基因克隆等方面的研究。文档编号C12Q1/68GK101921867SQ20101027615公开日2010年12月22日申请日期2010年9月9日优先权日2010年9月9日发明者张嘉农,毕延震,马钧申请人:武汉大学