专利名称：应用单链dna适体检测单核增生李斯特氏菌的方法
应用单链DNA适体检测单核增生李斯特氏菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种病原菌的检测方法，尤其涉及一种应用单链DNA适体检测单核增 生李斯特氏菌的方法。
背景技术：
单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是一种人畜共患病的病原菌， 人感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它在自然界中广泛存在，不易被冻 融，能耐受较高的渗透压，在4°C的环境中仍可生长繁殖，食品中存在的单核增生李斯特氏 菌对人类的健康安全具有危险，我国将其列为21世纪对中国人卫生健康具有重大影响的 12种病原微生物之一。传统的检测方法需要反复增菌、菌落分离及生化和血清学鉴别实 验，成本高、步骤复杂，耗时长。随着指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligandsby exponential enrichment, SELEX)技术的兴起，一种新的能特异性检测靶分子 的技术手段已成为可能。适体(aptamer) —词源于拉丁语aptus即to fit,意为“适合”，又称为适配子，它 是从一个体外合成的随机寡核苷酸文库中通过SELEX过程筛选到的与靶分子特异性结合 的小分子DNA或RNA片段。它具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高、特异性强等优点。目 前，该技术已成功应用于许多靶分子的筛选，如蛋白质、核苷酸、氨基酸、有机物，甚至金属 离子。但将病原微生物作为靶分子筛选的相关报道甚少。基于上述原因，本申请人在《食品科学》上刊登了名为“单核增生李斯特氏菌适体 的筛选与结构分析”的文章，其揭露了采用SELE利记体育对体外合成的78个碱基的随机DNA 文库进行筛选而获得与单核增生李斯特氏菌具有高亲和力特异性结合的单链DNA适体群 的方法，并公开了组成该适体群其中32个单链DNA适体的碱基序列，为适体的后续研究奠 定一定的基础。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种应用单链DNA适体检测单核增生李斯 特氏菌的方法，不仅步骤简单、判定标准明确，而且耗时短、效率高、成本相对较低。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的一种应用单链DNA适体检测单 核增生李斯特氏菌的方法，一种应用单链DNA适体检测单核增生李斯特氏菌的方法，其特 征在于同时设定实验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组，具体操作如下步骤100 实验组A.在含有单链DNA适体的第一试管中加入500 μ L选择缓冲液后置于95°C温度 下加热变性，加热变性5min后于冰块中进行冰浴lOmin，且其中单链DNA适体的量限定为 20-35 μ L ；B.取待检增菌液于第一离心管中，并将其置于离心设备上进行离心分层，且该待检增菌液的量限定为500-1000 μ L ；
C.将经过B步骤处理的第二离心管中的沉淀层与经过A步骤处理的第一试管中的 溶液进行均勻混合，并将该混合液置于室温下放置30min ；空白对照组重复实验组A步骤后将第一试管于室温下放置30min ；阴性对照组重复实验组的A、B、C步骤，且在B步骤中，将待检增菌液换成非目的 菌的菌液；阳性对照组重复实验组的A、B、C步骤，且在B步骤中，将待检增菌液换成目的菌 的菌液，即单核增生李斯特氏菌菌液；步骤200 将所述的实验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组分别进行如下 操作把步骤100中所得的混合液移入第二离心管中，并将第二离心管置于离心设备上 进行高速离心使混合液分层；再加入100 μ L用抗地高辛抗体标记的碱性磷酸酶进行反应， 且该用抗地高辛抗体标记的碱性磷酸酶是经过选择缓冲液稀释的，稀释倍数为15000倍；步骤300 将所述的实验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组分别进行如下 操作待步骤200的反应进行IOmin后，将第二离心管再次进行高速离心分层；离心结束 弃上清液后再加入500 μ L选择缓冲液，通过震荡搅拌使第二离心管内混合液悬浮；步骤400 将所述的实验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组分别进行如下 操作将步骤300所得的悬浮夜进行高速离心分层；离心结束后弃上清液，并将沉淀移 入第二试管，重复洗涤第二离心管三次，且每次的洗涤液移入第二试管；接着往第二试管中 加入100 μ L对硝基苯磷酸盐溶液进行显色反应，显色反应30min后加入100 μ L 2mol/L NaOH使该反应终止；步骤500 将各组显色反应终止后的溶液分别采用酶标仪于405nm波长下进行吸 光度测定若实验组测定所得的吸光度值介于空白对照组和阴性对照组测定所得的吸光度 值之间，则实验组的待检增菌液中不含单核增生李斯特氏菌；若实验组测定所得的吸光度 值介于阴性对照组和阳性对照组测定所得的吸光度值之间、或大于阳性对照组测定所得的 吸光度值，则实验组的待检增菌液中含单核增生李斯特氏菌。进一步地，所述选择缓冲液的配方为在ImL Tween-20的溶液中加入IOOOmL已灭 菌的PBS，且该PBS的pH值是7. 4。进一步地，所述非目的菌为沙门氏菌。本发明应用单链DNA适体检测单核增生李斯特氏菌的方法的有益效果在于不仅 步骤简单、判定标准明确，而且耗时短、效率高，是一种快速方便的检测方法
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。图1是本发明应用单链DNA适体检测单核增生李斯特氏菌的方法中实验组的流程 图。
具体实施方式请参阅图1，本发明应用单链DNA适体检测单核增生李斯特氏菌的方法同时设定 实验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组，其具体操作如下步骤100 实验组 A.在含有单链DNA适体的第一试管中加入500 μ L选择缓冲液后置于95°C温度 下加热变性，加热变性5min后于冰块中进行冰浴lOmin，且其中单链DNA适体的量限定为 20-35 μ L ；B.取待检增菌液于第一离心管中，并将其置于离心设备上进行离心分层， 其离心速度可设为12000r/min，离心时间设为lOmin，且所述待检增菌液的量限定为 500-1000 μ L；C.将经过B步骤处理的第二离心管中的沉淀层与经过A步骤处理的第一试管中的 溶液进行均勻混合，并将该混合液置于室温下放置30min ；空白对照组重复实验组A步骤后将第一试管于室温下放置30min ；阴性对照组重复实验组的A、B、C步骤，且在B步骤中，将待检增菌液换成非目的 菌的菌液，在本实施例中采用沙门氏菌作为非目的菌；阳性对照组重复实验组的A、B、C步骤，且在B步骤中，将待检增菌液换成目的菌 的菌液，即单核增生李斯特氏菌菌液；步骤200 将所述的实验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组分别进行如下 操作把步骤100中所得的混合液移入第二离心管中，并将第二离心管置于离心设备上 进行高速离心使混合液分层；再加入100 μ L用抗地高辛抗体标记的碱性磷酸酶进行反应， 且该用抗地高辛抗体标记的碱性磷酸酶是经过选择缓冲液稀释的，稀释倍数为15000倍；步骤300 将所述的实验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组分别进行如下 操作待步骤200的反应进行IOmin后，将第二离心管再次进行高速离心分层；离心结束 弃上清液后再加入500 μ L选择缓冲液，通过震荡搅拌使第二离心管内混合液悬浮；步骤400 将所述的实验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组分别进行如下 操作将步骤300所得的悬浮夜进行高速离心分层；离心结束后弃上清液，并将沉淀移 入第二试管，重复洗涤第二离心管三次，且每次的洗涤液移入第二试管；接着往第二试管中 加入100 μ L对硝基苯磷酸盐溶液进行显色反应，显色反应30min后加入100 μ L 2mol/L NaOH使该反应终止；步骤500 将各组显色反应终止后的溶液分别采用酶标仪于405nm波长下进行吸 光度测定若实验组测定所得的吸光度值介于空白对照组和阴性对照组测定所得的吸光度 值之间，则实验组的待检增菌液中不含单核增生李斯特氏菌；若实验组测定所得的吸光度 值介于阴性对照组和阳性对照组测定所得的吸光度值之间、或大于阳性对照组测定所得的 吸光度值，则实验组的待检增菌液中含单核增生李斯特氏菌。其中，步骤200、步骤300、步骤400中所涉及的高速离心，其离心速度均可设为13000r/min，离心时间均可设为IOmin ；本方法中的选择缓冲液的配方为在ImL Tween-20的溶液中加入IOOOmL已灭菌的PBS，且该PBS的pH值是7. 4。 本发明应用单链DNA适体检测单核增生李斯特氏菌的方法与传统的检测方法相 比，不仅步骤简单、判定标准明确，而且耗时短、效率高、成本相对低，是一种快速方便的检 测方法。
权利要求
一种应用单链DNA适体检测单核增生李斯特氏菌的方法，其特征在于同时设定实验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组，具体操作如下步骤100实验组A.在含有单链DNA适体的第一试管中加入500μL选择缓冲液后置于95℃温度下加热变性，加热变性5min后于冰块中进行冰浴10min，且其中单链DNA适体的量限定为20 35μL；B.取待检增菌液于第一离心管中，并将其置于离心设备上进行离心分层，且该待检增菌液的量限定为500 1000μL；C.将经过B步骤处理的第二离心管中的沉淀层与经过A步骤处理的第一试管中的溶液进行均匀混合，并将该混合液置于室温下放置30min；空白对照组重复实验组A步骤后将第一试管于室温下放置30min；阴性对照组重复实验组的A、B、C步骤，且在B步骤中，将待检增菌液换成非目的菌的菌液；阳性对照组重复实验组的A、B、C步骤，且在B步骤中，将待检增菌液换成目的菌的菌液，即单核增生李斯特氏菌菌液；步骤200将所述的实验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组分别进行如下操作把步骤100中所得的混合液移入第二离心管中，并将第二离心管置于离心设备上进行高速离心使混合液分层；再加入100μL用抗地高辛抗体标记的碱性磷酸酶进行反应，且该用抗地高辛抗体标记的碱性磷酸酶是经过选择缓冲液稀释的，稀释倍数为15000倍；步骤300将所述的实验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组分别进行如下操作待步骤200的反应进行10min后，将第二离心管再次进行高速离心分层；离心结束弃上清液后再加入500μL选择缓冲液，通过震荡搅拌使第二离心管内混合液悬浮；步骤400将所述的实验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组分别进行如下操作将步骤300所得的悬浮夜进行高速离心分层；离心结束后弃上清液，并将沉淀移入第二试管，重复洗涤第二离心管三次，且每次的洗涤液移入第二试管；接着往第二试管中加入100μL对硝基苯磷酸盐溶液进行显色反应，显色反应30min后加入100μL 2mol/L NaOH使该反应终止；步骤500将各组显色反应终止后的溶液分别采用酶标仪于405nm波长下进行吸光度测定若实验组测定所得的吸光度值介于空白对照组和阴性对照组测定所得的吸光度值之间，则实验组的待检增菌液中不含单核增生李斯特氏菌；若实验组测定所得的吸光度值介于阴性对照组和阳性对照组测定所得的吸光度值之间、或大于阳性对照组测定所得的吸光度值，则实验组的待检增菌液中含单核增生李斯特氏菌。
2.如权利要求1所述的应用单链DNA适体检测单核增生李斯特氏菌的方法，其特征在 于所述选择缓冲液的配方为在ImL Tween-20的溶液中加入IOOOmL已灭菌的PBS，且该 PBS的pH值是7. 4。
3.如权利要求1所述的应用单链DNA适体检测单核增生李斯特氏菌的方法，其特征在 于所述非目的菌为沙门氏菌。
全文摘要
本发明涉及一种应用单链DNA适体检测单核增生李斯特氏菌的方法，同时设定实验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组，各组经过变性、离心分层、显色及吸光度测后，对实验组的结果进行判定获得最终检测结果。本发明的优点在于不仅步骤简单、判定标准明确，而且耗时短、效率高、成本相对较低。
文档编号C12Q1/68GK101949929SQ20101027481
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日 公开号201010274816.发明者江树勋, 缪亭玉, 邵碧英, 陈彬, 陈文炳 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 被以下专利引用 (1),