专利名称：刺参肠道内容物及环境底泥中生物总dna的高效提取方法
技术领域：
本发明属于微生物和分子生态学领域，具体涉及一种针对刺参肠道内容物和环境 底泥中生物总DNA的高效提取方法。
背景技术：
刺参(Apostichopus japonicus)属海洋底栖生物，主要以栖息环境中微生物、原 生动物、微藻、大型藻类碎片、有机碎片、海泥等为食，摄入的食物组成复杂，其中也包括一 些病原微生物。肠道是刺参十分重要的消化器官，了解刺参肠道食物组成和微生物菌群状 况，对弄清刺参的消化机理、肠道微生态变动机制和预防疾病发生具有重要意义。近年来，DNA指纹分析技术广泛应用于肠道、环境生物多样性的研究，已成为研究 其群落多样性的重要工具。而有效提取样品中生物总DNA是进行DNA指纹分析的前提，取 得质量好、获得率高的DNA，可真实准确的分析样品中微生物组成的实际情况，是保证分子 生态学分析关键技术所在。刺参肠道内容物和环境底泥中物质复杂，含有大量的腐植酸、粘土矿物质以及其 它离子物质，这些成分严重影响了生物总DNA的提取效率和后续的DNA指纹分析。已报道的 针对土壤、淡水底泥及其它养殖动物肠道微生物的DNA提取方法有赵大勇等“一种适用于 底泥中微生物群落结构分析的DNA提取方法”(河海大学，专利申请号200910180630. 0)、 刘淮德等“一种对虾肠道微生物DNA的提取方法”(中国科学院海洋研究所，专利申请号 200910263665. 0)。刺参属海洋底栖生物，上述方法不适用于刺参肠道内容物和环境底泥生 物总DNA的高效提取。迄今为止，针对刺参肠道内容物和环境底泥中生物DNA的高效提取方法至今尚未 报道。
发明内容
本发明目的是建立一种针对刺参肠道内容物和环境底泥中生物总DNA高效提取 的技术，解决刺参肠道内容物和环境底泥中生物总DNA提取效率低的难题。该方法获得的 DNA片段完整、获得率和纯度较高，可以显著提高分子生态学分析的准确性。本发明是按以下技术方案实现的，刺参肠道内容物及环境底泥中生物总DNA的高 效提取方法，其步骤为1)取 2g 样品置于 IOmL 灭菌离心管中，加 5mL TENP (6. 2g/L Tris-Cl，7. 4g/L EDTA, 5. 8g/L NaCl，10. Og/L PVP)，同时加0. 5g灭菌玻璃珠，涡旋振荡2min，充分混勻，4°C， IlOOOg离心5min，弃上清，重复洗涤一次；2)沉淀用 5mL 的 PBS(8. Og/L NaCl,0. 2g/L KCl, 1. 42g/L Na2HPO4,0. 27g/L KH2PO4)洗涤两次，离心同上；3)把样品分成三份，分别加到2mL灭菌离心管中，每管加入600 μ L裂解液 (12. lg/L Tris-Cl,37. 2g/L EDTA,11. 7g/L NaCl, 10. Og/L PVP, 20. Og/L CTAB，pH为 8. 0旋涡振荡，再加入0. 5mL 100mg/mL的溶菌酶，37°C水浴Ih ；4)加入600 μ L的2% SDS缓冲液，轻轻上下颠倒5min。然后将样品放入_80°C冰 箱中5min，取出后在55°C水浴2min，反复冻融三次；5)加入等体积的氯仿异戊醇(24 1)，轻轻上下颠倒混勻，12000g离心5min ；6)将上清液转移到2ml灭菌离心管中，再加入等体积的酚氯仿异戊醇 (25 24 1)轻轻上下颠倒混勻5min, 12000g离心5min ；7)将上清液转移到新2ml灭菌离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混勻，_20°C lh, 12000g离心15min，慢慢吸弃上清液，底部白色沉淀物为DNA ；8)加入ImL 70%的乙醇清洗沉淀，IOOOOg离心lOmin，重复该步骤一次，在无菌操 作台中风干，加35 μ L的灭菌超纯水，-20°c保存。所述的步骤2，洗涤过程中要上下颠倒，样品充分悬浮于PBS溶液中。所述的步骤3，37°C水浴Ih过程中，每隔IOmin上下颠倒混勻。所述的步骤3，加入裂解液后涡旋振荡3-5min，在涡旋过程中上下颠倒。所述的步骤8，DNA沉淀用酒精清洗后，在无菌操作台内风干5min。本发明具有以下特点1、本发明方法可消除腐殖酸等物质对DNA的干扰，提高DNA提取效率和纯度。在 提取过程中生物基因组DNA损失少，DNA获取率高，能更好的反映样品中生物的多样性。2、本发明从刺参肠道内容物和环境底泥中提取的生物基因组DNA片段完整，电泳 条带清晰、单一，无拖尾现象。3、从刺参肠道内容物和环境底泥中提取生物基因组DNA时，无需特殊的仪器，整 个过程在较短的时间内完成，易操作。
图1 为刺参肠道内容物与养殖环境中生物总基因组DNA M为DNA Maker ；lanel、2刺参肠道内容物；lane3、4刺参附着基；lane5、6养殖刺 参池塘底泥。图2 为刺参肠道内容物与养殖环境中细菌16S rDNA的PCR电泳M为DNA Maker ； laneU2刺参肠道内容物；lane3、4刺参附着基；lane5、6养殖刺参池塘底泥。图3 为刺参肠道内容物与养殖环境中真核生物18S rDNA的PCR电泳M为DNA Maker ；Ianel空白对照；lane2、3刺参肠道内容物；lane4、5刺参附着基； lane6,7养殖刺参池塘底泥。图4 为不同提取方法提取生物总DNA的电泳检测M 为 DNA Maker ；lanel、2 为 Zhou 等(1996)改进方法；lane3、4 为该发明方法； lane5,6为试剂盒提取方法。图5 为不同方法提取的生物总DNA进行PCR扩增结果M 为 DNA Maker ；lanel、2 为 Zhou 等(1996)改进方法；lane3、4 为该发明方法； lane5,6为试剂盒提取方法。下面以实施例结合附图详细叙述本发明的提取方法1 实施例
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本发明其步骤为1)取刺参室外养殖池塘底泥、附着基、刺参肠道内容物样品分别2g置于IOmL灭 菌离心管中，加 5mL TENP(6. 2g/L Tris_Cl，7. 4g/L EDTA，5. 8g/LNaCl，10. Og/L PVP)，同时 加0. 5g灭菌玻璃珠，涡旋振荡2min，充分混勻，4°C，IlOOOg离心5min，弃上清，重复洗涤一 次；2)沉淀用 5mL 的 PBS(8. Og/L NaCl,0. 2g/L KCl, 1. 42g/L Na2HPO4,0. 27g/L KH2PO4)洗涤两次，离心同上；3)把样品分成三份，分别加到2mL灭菌离心管中，每管加入600 μ L裂解液 (12. lg/L Tris-Cl,37. 2g/L EDTA,11. 7g/L NaCl,10. Og/L PVP,20. Og/L CTAB，pH为8. 0)， 旋涡振荡，再加入0. 5mL 100mg/mL的溶菌酶，37°C水浴Ih ；4)加入600 μ L的2% SDS缓冲液，轻轻上下颠倒5min。然后将样品放入_80°C冰 箱中5min，取出后在55°C水浴2min，反复冻融三次；5)加入等体积的氯仿异戊醇(24 1)，轻轻上下颠倒混勻，12000g离心5min ；6)将上清液转移到2ml灭菌离心管中，再加入等体积的酚氯仿异戊醇 (25 24 1)轻轻上下颠倒混勻5min, 12000g离心5min ；7)将上清液转移到新2ml灭菌离心管中，加入0. 6倍体积的异丙醇，混 勻，-200C lh, 12000g离心15min，慢慢吸弃上清液，底部白色沉淀物为DNA ；8)加入1000 μ L 70%的乙醇清洗沉淀，IOOOOg离心lOmin，重复该步骤一次，在无 菌操作台中风干，加35 μ L的灭菌超纯水，-20°c保存。所述的步骤2，洗涤过程中要上下颠倒，样品充分悬浮于PBS溶液中。所述的步骤3，37°C水浴Ih过程中，每隔IOmin上下颠倒混勻。所述的步骤3，加入裂解液后涡旋振荡3-5min，在涡旋过程中上下颠倒。所述的步骤8，DNA沉淀用酒精清洗后，在无菌操作台内风干5min。利用该发明方法对刺参室外养殖池塘底泥、附着基、刺参肠道内容物进行生物基 因组DNA的提取，结果如下所示提取总DNA通过的琼脂糖凝胶电泳可以看出，条带在20Kb左右(参见图1)， DNA的亮度和纯度较高，没有拖尾现象，片段完整性好。以生物基因组DNA为模板，用细菌 16S rDNA基因通用引物GC-F341/R907和真核生物18S rDNA基因通用引物GC-F1427/R1616 进行PCR扩增(参见图2、图3)，扩增后条带亮度和特异性均较好，未出现非特异性扩增条 带,通过与Marker对比，可知GC-F341/R907PCR扩增片段大小约为600bp左右，GC-F1427/ R1616PCR扩增片段大小约为200bp左右，在底泥中虽然含有少量的杂质，但能获得质量较 高的PCR产物。2 本发明与其他DNA提取方法的比较方法一利用本发明的方法方法二 参照文献Zhou等(1996)进行修改的液氮反复冻融法，步骤如下(1)、取出冰冻的样品，稍微解冻后，在超净工作台上，切去表层，以避免取样过程 中的污染，取沉积物0. 3g置于灭菌的2mL离心管中；(2)、力卩入 500yL DNA 抽提缓冲液(100mmol/L Tris. HCl pH 8. 0 ； 100mmol/L EDTA ； IOOmmo 1/L 磷酸钠缓冲液，pH 8. 0 ；1. 5mol/L NaCl ；1% CTAB)；
(3)、充分混勻，置液氮罐中完全冻结(液氮中冷冻约3 5min)，取出在65°C水浴 中至融化，重复该步骤三次；(4)、加入 1 μ L 蛋白酶 K(20mg/ml)和 100μ L SDS(10% )；(5)、混勻后60°C保温2h，每隔15 20min颠倒混勻几次；(6)、IOOOOg 室温离心 IOmin ；(7)、收集上清液；(8)、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25 24 1)，lOOOOg，4°C离心IOmin ；(9)、上清液转移至一新的离心管中，重复两次步骤(8)；(10)、上清液中加0. 6倍体积冷异丙醇，轻轻混勻，置于_20°C下过夜。(11)、12000g，4°C离心 15min ；(12)、沉淀用70%乙醇和冷无水乙醇各洗一次，自然干燥；(13)、沉淀用50 μ L TE (ρΗ 8. 0)溶解，并置于_20°C下保存备用。方法三柱式土壤生物基因组提取DNA试剂盒法按照说明书用柱式土壤生物基 因组DNA抽提试剂盒进行生物总DNA提取。不同DNA提取方法的电泳检测结果参见图4。通过三种方法的比较，本发明方法提 取的刺参肠道内容物及环境底泥中DNA的获得率较高，说明此方法可以使生物细胞充分裂 解，释放出DNA。不同DNA提取方法的PCR扩增电泳检测结果参见图5。三种方法均得到了单一的 PCR条带，而本发明方法比其它两种方法获得的PCR条带亮度高，说明该方法可有效去除腐 殖酸等抑制PCR扩增的杂质，提高了 PCR效率。通过大量的试验证明本发明方法通用性好，能分别对刺参肠道与环境底泥中微 生物DNA进行提取，DNA获得率、纯度较高，片段完整性好，提取的DNA用于PCR扩增，能得 到亮度较高、特异性较好的产物，而且此方法不需要额外的仪器设备，操作简单，成本低。
权利要求
一种刺参肠道内容物及环境底泥中生物总DNA的高效提取方法，其特征在于它的步骤为1)、取2g样品置于10mL灭菌离心管中，加5mL TENP，同时加0.5g灭菌玻璃珠，涡旋振荡2min，充分混匀，4℃，11000g离心5min，弃上清，重复洗涤一次；其中TENP的成分为6.2g/L Tris Cl，7.4g/L EDTA，5.8g/LNaCl，10.0g/L PVP；2)、沉淀用5mL的PBS洗涤两次，离心同上；其中PBS的成分为8.0g/LNaCl，0.2g/L KCl，1.42g/L Na2HPO4，0.27g/L KH2PO4；3)、把样品分成三份，分别加到2mL灭菌离心管中，每管加入600μL裂解液，旋涡振荡，再加入0.5mL 100mg/mL的溶菌酶，37℃水浴1h；其中裂解液的成分为12.1g/L Tris Cl，37.2g/L EDTA，11.7g/L NaCl，10.0g/LPVP，20.0g/L CTAB，pH为8.0；4)、加入600μL的2％SDS缓冲液，轻轻上下颠倒5min，然后将样品放入 80℃冰箱中5min，取出后在55℃水浴2min，反复冻融三次；5)、加入等体积的氯仿∶异戊醇，轻轻上下颠倒混匀，12000g离心5min；6)、将上清液转移到2mL灭菌离心管中，再加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇轻轻上下颠倒混匀5min，12000g离心5min；7)、将上清液转移到新2ml灭菌离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀， 20℃ 1h，12000g离心15min，慢慢吸弃上清液，底部白色沉淀物为DNA；8)、加入1mL 70％的乙醇清洗沉淀，10000g离心10min，重复该步骤一次，在无菌操作台中风干，加35μL的灭菌超纯水， 20℃保存。
2.按权利要求书1所述刺参肠道内容物及环境底泥中生物总DNA的高效提取方法，其 特征在于所述步骤2的洗涤，洗涤过程中要上下颠倒，样品充分悬浮于PBS溶液中。
3.按权利要求书1所述刺参肠道内容物及环境底泥中生物总DNA的高效提取方法，其 特征在于所述步骤3的水浴，37°C水浴Ih过程中，每隔IOmin上下颠倒混勻。
4.按权利要求书1所述刺参肠道内容物及环境底泥中生物总DNA的高效提取方法，其 特征在于所述步骤3的涡旋，加入裂解液后涡旋振荡3-5min，在涡旋过程中上下颠倒。
5.按权利要求书1所述刺参肠道内容物及环境底泥中生物总DNA的高效提取方法，其 特征在于所述步骤8的风干，DNA沉淀用酒精清洗后，在无菌操作台内风干5min。
全文摘要
一种刺参肠道内容物及环境底泥中生物总DNA的高效提取方法，其方法步骤为TENP预处理、机械破碎、反复冻融、溶菌酶、SDS裂解液裂解细胞、酚∶氯仿∶异戊醇抽提。在提取过程中，样品预先用TENP处理，通过离心有效去除腐植酸，防止与DNA的结合，以提高DNA获得率。该方法对样品中生物细胞裂解完全，腐植酸的去除效率高，DNA获得率及纯度较高、片段完整，提高了分子生态学对刺参肠道内容物及环境底泥中生物多样性研究的准确性。
文档编号C12N15/10GK101935643SQ20101025722
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者廖梅杰, 张正, 张辉, 李彬, 王印庚, 荣小军, 薛太山, 陈霞 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所