专利名称：一种鉴别羊肉和鸭肉的pcr-rflp方法
技术领域：
本发明属于分子生物学检测领域，涉及到羊肉和鸭肉的鉴别。
背景技术：
羊肉中含有丰富的优质蛋白和大量的矿物质元素等，具有很高的营养价值。寒冬 吃羊肉可益气补虚，促进血液循环，增强御寒能力。中医认为，羊肉还有补肾壮阳的作用，故 而羊肉深受人们的青睐。然而近年来，一些不法商贩以鸭肉串当做羊肉串进行销售来欺骗 消费者的事件屡有发生，这种以鸭肉替代羊肉进行销售的行为不仅给消费者带来损失，也 给羊肉产业的健康发展造成不良影响。为了确保广大消费者的权益，为执法人员提供技术 支撑，需要对羊肉和鸭肉进行准确的鉴别。对生鲜肉进行感官鉴别时，根据一些物种肉在颜色、气味、滋味、纤维粗细等方面 的特点差异，借助“看、闻、摸”手段，综合三个要点得出的判断，对肉类进行感官鉴别。这在 实际应用中存在如下问题对于经过加工的肉制品，由于加入色素、食品添加剂、香料等物 质，通过感官手段难以进行准确鉴别。例如制假者将鸭肉串刷上羊油，加上佐料等物质，靠 传统的感官方法难以检验。免疫学检测是基于可溶性抗原与抗体的免疫反应，应用种间特异性抗原进行设计 研究的方法。GiovannacciI等2005年对动物物种检测的ELISA方法进行了全面综述，认为 样品经过不同温度的加热处理会影响ELISA方法的检测准确性。特别是当样品经过高温处 理后，蛋白发生了变性，改变了特异抗原决定簇，因此很难鉴别和区分动物物种。目前用于 动物源性检测的试剂盒灵敏度较低，不适于推广使用。PCR-RFLP技术快速、简便，在肉产品的种属鉴别方面已有相关报道，但未见有羊肉 和鸭肉鉴别方面的报道。
发明内容
本发明的目的是解决目前羊肉和鸭肉鉴别方法准确性低的缺陷，提供一种羊肉和 鸭肉鉴别的PCR-RFLP方法，为打击鸭肉代替羊肉销售的不法行为提供技术支撑。可将羊肉和鸭肉按以下方法进行鉴别一、将取50mg待检样品放入1. 5mL的EP 管(EP管应高压灭菌)中，用小剪刀将其剪碎。二、加入STE抽提液600 μ L、ProK(20mg/ mL) 20 μ L及20%的SDS溶液15 μ L，在震荡器上充分混勻。三、将EP管置入水浴锅，55°C消 化电泳图。三个图中的“阴，，为阴性对照样品，M为分子量内标。
具体实施例方式本实施方式一一、将取50mg待检样品放入1. 5mL的EP管(EP管应高压灭菌)中， 用小剪刀将其剪碎。二、加入STE抽提液600 μ L、ProK(20mg/mL) 20 μ L及20%的SDS溶液 15 μ L，在震荡器上充分混勻。三、将EP管置入水浴锅，55°C消化过夜(12-16h)，在此期间可 取出颠倒混勻几次，以便消化彻底。四、将EP管取出，每管加入600 μ L的Tris饱和酚，轻轻摇动混勻15min，然后在12000rpm离心lOmin。五、转移上清液至新的EP管，加入等体积 的酚氯仿异戊醇混合液(酚氯仿异戊醇体积比为25 24 1)，颠倒混勻lOmin，然后 12000rpm离心lOmin。六、转移上清液至新的EP管，加入等体积的氯仿异戊醇混合液(氯 仿异戊醇体积比为24 1)，轻轻混勻lOmin，然后在12000rpm离心lOmin。七、转移上清 液至新的EP管，先加入lmL冰乙醇，再加入60 ii L的NaAc (3M)，轻轻水平摇动，可见絮状、 白色DNA出现。将EP管放入-20°C冰箱冷冻30min，然后在12000rpm离心lOmin，可见DNA 沉于管底。弃无水乙醇，再用75%的乙醇洗涤DNA两次，然后在12000rpm离心lOmin ；自然 干燥后，加入50PL TE溶液溶解。八、PCR扩增及检测引物用可扩增所有脊椎动物Cytb 序列的通用上游引物F :5，-TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G_3，和通用下游引物R : 5，-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3，。PCR 反应总体积为 25 ii L，其中 10 XPCR Buffer 2. 5u L, Taq DNA 聚合酶 0. 2 u L (2. 5U/ u L)，dNTPs (2. 5mmol/L) 2 u L, lOpmol/ u L 的上、下游引物各2 yL，模板DNA 250ng，灭菌蒸馏水补足总体积。扩增条件为95°C变性 10min，95°C变性45s，53°C退火60s，72°C延伸60s，35个循环后在72°C继续延伸7min。取 4ii L的PCR产物与1 ii L的6Xl0adding buffer混合，采用TAE缓冲系统，2%琼脂糖凝胶 (加入染色剂Gold view I)在5v/cm恒压电泳条件下约25min，在凝胶成像系统中观察并 记录。九、Bsu36I酶切分析对步骤八中的PCR产物用限制性内切酶Bsu36I进行PCR-RFLP 分析；Bsu36I只能将鸭的PCR产物切割为95bp和377bp的片段，而不能切割山羊和绵羊 的PCR产物，根据琼脂糖凝胶检测结果是否可检测到95bp和377bp的条带来判断是否为鸭 肉。酶切体系为201^，其中0嫩(卩0 产物)11^，10\陬8 buffer 2 u L, 100XBSA0. 2 u L, Bsu36I限制性内切酶(10000U/mL)0. 5uL,灭菌蒸馏水补足体积。混勻并离心后在37°C 消化16h，然后在65°C处理20min灭活内切酶活性，取7iiLPCR产物与1 y L 6Xloadding buffer混合，采用TAE缓冲系统，2%琼脂糖凝胶(加入Gold view I染色剂)在5v/cm恒 压电泳条件下约25min，在凝胶成像系统中观察并记录。十、Spel酶切分析对步骤八中的 PCR产物用限制性内切酶Spel进行PCR-RFLP分析；Spel可将绵羊和山羊的PCR产物切割 为326过夜(12-16h)，在此期间可取出颠倒混勻几次，以便消化彻底。四、将EP管取出，每 管加入600 ii L的Tris饱和酚，轻轻摇动混勻15min，然后在12000rpm离心lOmin。五、转 移上清液至新的EP管，加入等体积的酚氯仿异戊醇混合液(酚氯仿异戊醇体积比为 25 24 1)，颠倒混勻lOmin，然后12000rpm离心lOmin。六、转移上清液至新的EP管， 加入等体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇体积比为24 1)，轻轻混勻lOmin，然后 在12000rpm离心lOmin。七、转移上清液至新的EP管，先加入lmL冰乙醇，再加入60 y L的 NaAc (3M)，轻轻水平摇动，可见絮状、白色DNA出现。将EP管放入_20°C冰箱冷冻30min，然 后在12000rpm离心lOmin，可见DNA沉于管底。弃无水乙醇，再用75%的乙醇洗涤DNA两 次，然后在12000rpm离心lOmin ；自然干燥后，加入50iiL TE溶液溶解。八、PCR扩增及检 测引物用可扩增所有脊椎动物Cyt b序列的通用上游引物F:5’ -TAC CAT GAG GAC AAA TAT CATTCT G_3，和通用下游引物 R :5，-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3，。PCR 反应总体积为 25 ii L，其中 10 XPCR Buffer 2. 5 u L, Taq DNA 聚合酶 0. 2 ii L (2. 5U/ii L)， dNTPs (2. 5mmol/L) 2 u L, lOpmol/ u L 的上、下游引物各 2 u L,模板 DNA 250ng,灭菌蒸馏水 补足总体积。扩增条件为95°C变性10min，95°C变性45s，53°C退火60s，72°C延伸60s，35 个循环后在72°C继续延伸7min。取4 y L的PCR产物与1 y L的6X loadding buffer混合，采用TAE缓冲系统，2%琼脂糖凝胶(加入染色剂Gold view I)在5v/cm恒压电泳条件下约 25min，在凝胶成像系统中观察并记录。九、Bsu36I酶切分析对步骤八中的PCR产物用限 制性内切酶Bsu36I进行PCR-RFLP分析；Bsu36I只能将鸭的PCR产物切割为95bp和377bp 的片段，而不能切割山羊和绵羊的PCR产物，根据琼脂糖凝胶检测结果是否可检测到95bp 和377bp的条带来判断是否为鸭肉。十、Spel酶切分析对步骤八中的PCR产物用限制性 内切酶Spel进行PCR-RFLP分析；Spel可将绵羊和山羊的PCR产物切割为326bp和146bp， 但不能切割鸭的PCR产物，根据琼脂糖凝胶检测结果是否可检测到326bp和146bp的条带 来判断是否为羊肉。本发明在鉴别过程中采用PCR-RFLP方法，具有简便、快捷、廉价和准确性高的特
点o
图1是具体实施方式
一中步骤八得到的绵羊(S)、山羊(G)和鸭(D)PCR产物检测 的凝胶电泳图；图2是具体实施方式
一中步骤九用Bsu361限制内切酶酶切对具体实施方式
一中步骤八得到的绵羊(S)、山羊(G)和鸭⑶的PCR产物进行PCR-RFLP分析后检测的凝胶 电泳图；图3是具体实施方式
一中步骤十用Spel限制性内切酶酶切对具体实施方式
一中步 骤八得到的绵羊(S)、山羊(G)和鸭(D)的PCR产物进行PCR-RFLP分析后检测的凝胶bp和 146bp，但不能切割鸭的PCR产物，根据琼脂糖凝胶检测结果是否可检测到326bp和146bp 的条带来判断是否为羊肉。酶切体系为20 iiL，其中0嫩( 0 产物)11^，10\服813吐作『 2uL, 100XBSA 0. 2ii L，SpeI限制性内切酶(10000U/mL) 0. 5 y L，灭菌蒸馏水补足体积。混 勻并离心后在37°C消化16h，然后在65°C处理20min灭活内切酶活性，取7 y L PCR产物与 luL 6Xloadding buffer混合，采用TAE缓冲系统，2%琼脂糖凝胶(加入Gold view I染 色剂)在5v/cm恒压电泳条件下约25min，在凝胶成像系统中观察并记录。附鉴别绵羊、山羊和鸭肉所用限制性内切酶的酶切位点限制性内切酶Bsu36I(CC丨TNAGG)限制性内切酶Spel (A丨CTAGT)附溶液配制表STE 抽提液10mL Tris-HCl (1M ;pH 8. 0), 2mL EDTA(0. 5M ；pH 8. 0)，lOOmL NaAc (1M)，888mL 水，高压灭菌。20% SDS :200g SDS溶于900mL水中，用盐酸调pH值至7. 2，加水定容至1000mL。1M Tris-HCl :121.4g Tris溶于800mL双蒸水中，用盐酸调pH值至8. 0，定容至 lOOOmL，高压灭菌。TE 缓冲液(pH 8. 0) :lmL Tris-HCl (1M ；pH 8. 0) ,0. lmL EDTA (0. 5M ；pH 8. 0)，加 双蒸水定容至50mL，高压灭菌。20mg/mL ProK :100mg蛋白酶K溶于5mL灭菌双蒸水，_20°C分装保存。TE 缓冲液(pH 8. 0) :lmL Tris-HCl (1M ；pH 8. 0) ,0. lmL EDTA (0. 5M ；pH 8. 0)，加 双蒸水定容至50mL，高压灭菌。
权利要求
一种鉴别羊肉和鸭肉的PCR-RFLP方法，其特征在于可将羊肉和鸭肉按以下方法加以鉴别一、将取50mg待检样品放入1.5mL的EP管(EP管应高压灭菌)中，用小剪刀将其剪碎。二、加入STE抽提液600μL、ProK(20mg/mL)20μL及20％的SDS溶液15μL，在震荡器上充分混匀。三、将EP管置入水浴锅，55℃消化过夜(12-16h)，在此期间可取出颠倒混匀几次，以便消化彻底。四、将EP管取出，每管加入600μL的Tris饱和酚，轻轻摇动混匀15min，然后在12000rpm离心10min。五、转移上清液至新的EP管，加入等体积的酚氯仿异戊醇混合液(酚∶氯仿∶异戊醇体积比为25∶24∶1)，颠倒混匀10min，然后12000rpm离心10min。六、转移上清液至新的EP管，加入等体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿∶异戊醇体积比为24∶1)，轻轻混匀10min，然后在12000rpm离心10min。七、转移上清液至新的EP管，先加入1mL冰乙醇，再加入60μL的NaAc(3M)，轻轻水平摇动，可见絮状、白色DNA出现。将EP管放入-20℃冰箱冷冻30min，然后在12000rpm离心10min，可见DNA沉于管底。弃无水乙醇，再用75％的乙醇洗涤DNA两次，然后在12000rpm离心10min；自然干燥后，加入50μL TE溶液溶解。八、PCR扩增及检测引物用可扩增所有脊椎动物Cyt b序列的通用上游引物F5’-TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G-3’和通用下游引物R5’-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3’。PCR反应总体积为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL(2.5U/μL)，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，10pmol/μL的上、下游引物各2μL，模板DNA 250ng，灭菌蒸馏水补足总体积。扩增条件为95℃变性10min，95℃变性45s，53℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环后在72℃继续延伸7min。取4μL的PCR产物与1μL的6×loadding buffer混合，采用TAE缓冲系统，2％琼脂糖凝胶(加入染色剂Gold view I)在5v/cm恒压电泳条件下约25min，在凝胶成像系统中观察并记录。九、Bsu36I酶切分析对步骤八中的PCR产物用限制性内切酶Bsu36I进行PCR-RFLP分析；Bsu36I只能将鸭的PCR产物切割为95bp和377bp的片段，而不能切割山羊和绵羊的PCR产物，根据琼脂糖凝胶检测结果是否可检测到95bp和377bp的条带来判断是否为鸭肉。十、SpeI酶切分析对步骤八中的PCR产物用限制性内切酶SpeI进行PCR-RFLP分析；SpeI可将绵羊和山羊的PCR产物切割为326bp和146bp，但不能切割鸭的PCR产物，根据琼脂糖凝胶检测结果是否可检测到326bp和146bp的条带来判断是否为羊肉。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别羊肉和鸭肉的PCR-RFLP方法，其特征在于步骤二用 STE抽提液。
3.根据权利要求1所述的一种鉴别羊肉和鸭肉的PCR-RFLP方法，其特征在于步骤八中 扩增引物为用通用上游引物F :5’ -TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G_3，和通用下游 引物 R:5，-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3，。
4.根据权利要求1所述的一种鉴别羊肉和鸭肉的PCR-RFLP方法，其特征在于步骤九用 限制性内切酶Bsu36I进行PCR-RFLP分析。
5.根据权利要求1所述的一种鉴别羊肉和鸭肉的PCR-RFLP方法，其特征在于步骤十用 限制内切酶SpesI进行PCR-RFLP分析。
全文摘要
羊肉和鸭肉鉴别的PCR-RFLP方法属于分子生物学检测领域。它设计了一种羊肉制品肉种来源鉴别的方法，解决了目前羊肉和鸭肉鉴别方法准确性低的缺陷，提供了鉴别羊肉和鸭肉的PCR-RFLP检测技术。可将羊肉和鸭肉按以下方法加以鉴别提取样品DNA，采用通用引物扩增和凝胶电泳检测，然后分别用Bsu36I和SpeI限制性内切酶进行PCR-RFLP分析，即可区分羊肉和鸭肉。本发明采用PCR-RFLP方法，具有简单、快捷、廉价和准确性高的特点。
文档编号C12Q1/68GK101875975SQ20101022668
公开日2010年11月3日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日 公开号201010226683.发明者何建文, 冯海永, 安添午, 张 浩, 王继卿, 罗玉柱, 赵会静, 韩建林 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所;甘肃农业大学