专利名称：与猪生产性状相关的分子标记及制备与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于猪标记辅助选择(MAS)技术领域，主要涉及到四种可用于猪标记辅助 选择的分子标记的制备与应用。其中两个分子标记位于猪Pitx2c基因的外显子上，而另外 两个分子标记位于Pitx2c基因的3’非翻译区。利用本发明中的四个分子标记对猪生产性 状进行了关联分析，结果显示，这四种分子标记均可应用到猪的标记辅助选择中。
背景技术：
肉类是人类营养的主要来源，而猪肉在所有肉类消费中所占的比例是最大的。随 着社会的发展与人们生活水平的提高，人们对肉类的消费观念已由原来的对量的追求向质 的追求转变。过去的几十年里，传统的育种方法在提高猪的生长速度，瘦肉率以及饲料转化 率等方面发挥了积极重要的作用，并取得了显著的成绩，育种计划相当成功。但同时随着对 高生长率与高瘦肉率的强度选择导致了猪肉品质的严重下降，特别是导致了肌肉脂肪的大 幅度下降，劣质猪肉的大量涌现。因此，对猪肉品质的改良，培育出安全环保优质新品种猪 成为目前猪遗传育种中的重要研究课题。近年来，随着现代分子和基因组学突飞猛进的发展，分子育种越来越受到人们的 关注。分子育种主要包括标记辅助育种，转基因育种和体细胞克隆育种，与其它两种分子育 种相比，标记辅助育种简单易行，因此，对标记辅助育种的研究也相对较多。标记辅助育种 就是利用DNA水平上的分子标记来进行猪种的遗传改良。而标记辅助选择就是通过寻找 对动物特定性状有较大影响的数量性状位点附近的分子标记，然后通过这些分子标记来对 特定性状进行选择的方法。相对传统的育种方法，标记辅助选择具有许多明显的优势，它 不受年龄，性别等的限制，可以进行早期选种，缩短世代间隔，提高选择的准确性，提高选择 的强度，降低选育的成本，加快遗传改良的进度；特别是对遗传力低的性状、晚期表现性状、 以及活体难于度量的性状(肉质性状)更具有显著的优势。到目前为止，已成功鉴定了多 个可用于猪育种的分子标记。其中氟烷(halothane gene，HAL)基因，也称兰尼定I型受 体基因(ryanodine receptor 1, RYR1)或 Ca2+释放通道基因(calcium release channel gene，CRC)，是被人们研究最多，研究最深的一个影响猪肉质性状的主效基因(Fujii et al. ,Identification of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia. Science. 1991，253，448-451)。带有氟烷隐性 η 等位基因的纯 合个体(Halnn)在应激情况下易产生应激综合症(PSS)，并且容易出现死亡，带有隐性η等 位基因的猪在屠宰后也很容易出现劣质的PSE肉。第二个影响肉质的主要基因是酸肉基 因(Rendement Napole，RN)，带有RN-等位基因的猪白肌中糖源的含量增量可达到70%，导 致猪宰后24小时肌肉的最终pH值较低，并对腌制火腿产量有明显的影响(Le yo et al., Evidence for a new major gene influencing meat quality in pigs. Genet Res, 1990, 55，33-40)。另外，胰岛素生长因子 2 (Insulin-like growth factor 2，IGF2)、黑皮质素受 体 4(Melanocortin receptor 4，MCR4)以及肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)也被证明 与肌肉的发育以及猪肉的品质具有显著的关系。上述几个分子标记对猪肉品质的形成具有较大的影响，它们都比较成功的应用到了猪肉品质改善的育种当中。此外，雌激素受体 (Estrogen receptor, ESR)基因的DNA标记检测已在改善猪的繁殖性能中得以应用；牛的 双肌(Double muscling, DM)基因与鸡的矮小(Dwarf，dw)基因也在育种和生产中应用。
肌肉的发育以及猪的肉质性状与胴体性状具有复杂的特性，而且许多性状只具有 中等的遗传力，并且这些性状都是受多基因控制，其中很可能只有一个基因在起主要作用。 另外，随着育种工作者对瘦肉的强度选择导致了猪肉品质的极度下降。迄今为止，虽然找到 了少数几个影响猪生产性能的主效基因，但仅仅这几个主效基因还远远不能满足育种工作 的需求。因此，找到更多的主效基因或与主效基因紧密连锁的遗传标记，并合理的运用到猪 肉品质改良中，势必成为育种工作者们迫在眉睫的要事。遗传标记(Genetic markers)是指能够反映不同群体或不同个体差异，又能 够代表群体或个体的遗传特征。19世纪中期，奥地利学者孟德尔首先将形态学性状 作为遗传标记在选育中应用，自此，遗传标记得到了迅速的发展。遗传标记包括形态 学标记(morphological marker)、细胞学标记(cytological marker)、生物化学标记 (biochemical marker)、免疫学标记(immune genetic markers)禾口分子标记(molecular marker)五种类型。分子标记有广义与狭义之分，广义的分子标记是指遗传的并可检测 的DNA序列或蛋白；狭义的分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的 特异性DNA片段。与其它几种遗传标记相比，分子标记表现出更多的优势大多数分子 标记为共显性，基因座位间很少存在上位效应，特别是对隐性性状的选择十分便利；基因 组DNA的变异十分丰富，理论上分子标记的数量是无限的；标记分析不受发育阶段，不 同组织等的影响；大多数分子标记表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无 连锁；另外，分子标记的检测手段简单、迅速。迄今为止，发展出来的分子标记有限制 性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，这是 1974 年Grodzicker等创立的第一代遗传标记；数目可变串联重复多态性(Variable Number of Tandem Repeats, VNTR)；随机扩增多态性(random amplified polymorphism DNA, RAPD)；任意弓丨物 PCR(arbitrarily primer polymerase chain reaction, AP-PCR)； DNA 扩增指纹印迹(DNA amplification fingerprinting, DAF)；序列标签位点 (Sequence Tagged Sites, STS)；简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR)；序列 特异性扩增区(Sequence-characterized Amplified Region, SCAR)；单引物扩增反应 (Single PrimerAmplificatipn Reawtion, SPAR) ；DNA 单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP)；双脱氧化指纹法(Dideoxy Fingerprints, ddF)；扩 增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)；酶切扩增多态性 序列(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences, CAPS)；最后一种是单核苷酸多态性 (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) SNP 标记是美国学者 Lander E 于 1996 年提出 的第三代DNA遗传标记，是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有 小的插入、缺失等。SNP标记有望成为最重要最有效的分子标记。Pitx2c基因是一个与果蝇bicoid基因相关的同源基因，原来的研究证明Pitx2c 基因能与基因的生长因子相互作用对细胞类型的特化以及细胞的增殖起调控(kioussi et al. ， Identification of a Wnt/DVI/beta-catenin- > Pitx2pathway mediating cell-type-specific proliferation during development. Cell. 2002，111,673-685)。PITX2最初是被鉴定为一个与人的Riger综合症有很大的关系(Semina et al. , Cloning and characterization of a novel bicoid-related homeobox transcription factor gene，RIEG，involved in Rieger syndrome. Nat Genet. 1996，14，392-399)，另外许多研究 发现Pitx2c在许多组织器官的形成中起着十分重要的作用。近期的研究表明Pitx2c能够 促进肌细胞增殖抑制肌细胞的分化(Martinez-Fernrndez et al.，Pitx2c overexpression promotes cell proliferation and arrests differentiation in myblasts. Dev Dyn, 2006，235，2930-2939)，而接下来的许多研究也证实了 Pitx2c与肌肉的发育存在密切的关 系(L^Honore et al. ,Sequential expression and redundancy of Pitx2and Pitx3genes during muscle development. Developmental Biology，2007，307，421—433 ;Shih et al., Expression pattern of the homeodomain transcription factor Pitx2during muscle development. Gene Expression Patterns. 2007，7，441—451. ；Velasco et al.，Role of Pitx2in Myogenesis and Skeletal Muscle Regeneration. Human Gene Therapy.2009， 20，1064-1065)。因此，我们推测猪Pitx2c基因可能是一个影响猪肌肉生长发育的重要基 因。另外，到目前为止仍没有见到研究猪Pitx2c基因功能的报道。所以申请人将猪Pitx2c 基因作为影响猪肌肉生长发育以及肌肉品质的重要侯选基因，研究该基因突变位点在群体 中的多态性，并对这些多态位点与猪生产性状的关系进行了进一步的分析，期望能够发现 影响猪生产性状的重要多态位点。
发明内容
本发明的目的在于克隆与猪生产性状相关的基因Pitx2c，寻找该基因突变位点， 并建立相应的多态性检测方法进行性状关联分析，为猪的标记辅助选择提供有用的分子标 记。另外本发明还涉及到所述分子标记的制备方法以及应用。本发明通过以下技术实现申请人:通过克隆技术，获得四种可作为猪肉质性状基因Pitx2c分子标记，它们的 DNA 序列如序列表 SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2，SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示，PCR 扩 增的 SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO 4 目的片段长分别为 296bp， 407bp, 105bp, 105bp。在序列表SEQ ID NO 1所示序列的第49bp处有1个C49-T49碱基 突变，导致Bpull02I-RFLP多态性；在序列表SEQ ID NO 2所示序列的第137bp处有1个 C137-T137突变，导致HindII-RFLP多态性；在序列表SEQ ID NO 3所示序列的第43bp处 有1个G43-A43突变，没有引起酶切多态性；在序列表SEQ ID NO 4所示序列的第53bp夕卜 有1个G53-A53突变，也没有引起酶切多态性。按照以下步骤制备用人Pitx2c基因的mRNA序列为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank 猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为80%以上的猪ESTs序列，然后利用 DNAstar软件将所获得的ESTs序列拼接，获得猪Pitx2c基因的cDNA序列，根据所拼接的序 列设计4对引物，最后获得如序列表SEQ ID NO :1，SEQ IDNO :2，SEQ IDNO :3，SEQ IDNO 4 所示的核苷酸序列。PCR产物经回收纯化，克隆，测序。所获得的序列进行品种间的多序列 比对，寻找重要的分子标记。应用PCR-RFLP方法检测SEQ ID NO 1序列的第49位与SEQ ID NO 2序列的第137位的多态性；应用焦磷酸测序(Pyrosequencing)方法检测SEQ IDNO :3序列的第43位与SEQ ID NO :4序列的第53位的多态性。并进行了基因型与猪生产 性状之间的关联分析，本发明为猪的分子育种提供了四个新的分子标记。
制备检测序列表SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ IDNO 4 序列中 碱基突变的正、反向引物的DNA序列如下所示SEQ ID NO 5 正向引物(Fl):5，-CAAGAATCGCCGGGCCAAAT-3，SEQIDN0 6 反向引物(Rl):5，-TCACCGCTGAGGGCACCAT-3，SEQIDN0 7正向引物(F2):5，-CGCAGTTCAACGGGCTTAT-3，SEQIDN0 8反向引物(R2):5，-GCTGGAGTGCTGCTTTGCT-3，SEQIDN0 9正向引物(F3):5，-GTGTGAGCTGCGCCCACT-3，SEQ ID NO: 10反向引物(R3):5，-TCTTGAGTGCCCACGACCT-3，SEQIDN0 11正向引物(F3):5，-GTGTGAGCTGCGCCCACT-3，SEQIDN0 12反向引物(R3):5，-TCTTGAGTGCCCACGACCT-3，检测SEQ ID NO 3与SEQ ID NO 4中碱基突变所用的焦磷酸测序引物的DNA序列 如下所示SEQ ID NO: 13测序引物(Si):5，-GGGATCCTAGGACCGTGC-3，依照本发明，本发明所发明的四种分子标记可以用于猪标记辅助选择中。本发明的效果是1、猪Pitx2c基因部分DNA序列的克隆PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR 产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示4个PCR产物的长度分别为296bp，407bp，105bp， 105bp。其中296bp，407bp片段为Pitx2c基因外显子区，序列分别如SEQ ID NO 1, SEQ ID N0:2所示；而105bp，105bp片段为Pitx2c基因的3，UTR区，序列分别如SEQIDN0 :3， SEQIDN0 4 所示。测序结果表明SEQ ID NO=I所示序列的第49bp处有1个C49-T49突变，导致 Bpull02I-RFLP多态性；SEQ ID NO 2所示序列的第137bp处有1个C137-T137突变，导致 HindII-RFLP多态性；SEQ ID NO :3所示序列的第43bp处有1个G43-A43突变；SEQ ID NO: 4所示序列的第53bp处有1个G53-A53突变。2、PCR-RFLP与焦磷酸测序诊断方法的建立用Fl和Rl扩增猪基因组DNA得到296bp特异扩增片段(见图2)。测序的结果 发现在该片段中存在Bpull02I限制性内切酶的酶切位点(5' GC丨C/TGAGC 3')，其中第48-49bp间为Bpull02I酶的多态性切点。扩增的PCR产物经Bpull02I酶切产生三种基 因型，CC基因型有296bp —条带，杂合子CT型有296bp，247bp与49bp三条带，TT型只有 247bp与49bp两条带，用2. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测能明显的判别带型(见图3)。用F2 和R2扩增猪基因组DNA得到407bp特异扩增片段(见图4)。测序的结果发现在该片段中存 在HindII限制性内切酶的酶切位点(5' GTC丨AAC/T3')，其中第134_135bp间为HindII 酶的多态性切点。扩增的PCR产物经HindII酶切产生三种基因型，TT基因型有407bp — 条带，杂合子CT型有407bp，272bp与135bp三条带，TT型只有272bp与135bpg两条带，用 2. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测能明显的判别带型(见图5)。用F3和R3扩增猪基因组DNA 得到105bp特异扩增片段(见图6)。测序的结果发现在该片段中存在2个突变位点，但都 没有引起酶切位点的改变，因此，本发明采用焦磷酸测序(Pyrosequencing)的方法，在设 计PCR扩增引物的同时，设计了一条可以同时检测这2个突变位点的测序引物S1。焦磷酸 测序仪(PSQ 96MA)根据峰值自动判别基因型，测序结果如图7所示。更详细的技术方案见《具体实施方式
》所述。
序列表SEQ ID NO 1是本发明克隆的猪生产性状相关基因Pitx2c的部分外显子 序列。序列表SEQ ID NO 2是本发明克隆的猪生产性状相关基因Pitx2c的部分外显子 序列。序列表SEQ ID NO 3是本发明克隆的猪生产性状相关基因Pitx2c的部分3，UTR 序列。序列表SEQ ID NO 4是本发明克隆的猪生产性状相关基因Pitx2c的部分3，UTR 序列。序列表SEQ ID NO :5_6是扩增序列表中的SEQ ID NO 1所用的引物对的DNA序 列。序列表SEQ ID NO :7_8是扩增序列表中的SEQ ID NO :2所用的引物对的DNA序 列。序列表SEQ ID NO :9_10是扩增序列表中的SEQ ID NO 3所用的引物对的DNA序 列。序列表SEQ ID NO 11-12是扩增序列表中的SEQ ID NO :4所用的引物对的DNA序 列。序列表SEQ ID NO 13是检测SEQ ID NO 3与SEQ ID NO 4中的突变位点所用的 测序引物的DNA序列。图1 本发明的技术流程图。图2 是本发明中猪Pitx2c基因SEQ ID NO 1序列PCR扩增检测图。图中M =DNA 分子量标准(DL2000ladder)图3 是本发明中猪Pitx2c基因SEQ ID NO 1序列的第49位C49-T49突变 Bpull02I-RFLP三种基因型电泳图谱。图中M :DNA分子量标准(DL20001adder)图4 是本发明中猪Pitx2c基因SEQ ID NO :2序列PCR扩增检测图。图中M :DNA分子量标准(DL20001adder)图5 是本发明中猪Pitx2c基因SEQ ID NO :2序列的第137位C137-T137突变 HindII-RFLP三种基因型电泳图谱。图中M :DNA分子量标准(DL20001adder)图6 是本发明中猪Pitx2c基因SEQ ID NO 3与SEQ ID NO :4序列PCR扩增检测图。图中M:DNA分子量标准(DL20001adder)图7 是本发明中猪Pitx2c基因SEQ ID NO :3序列的43位G43-A43突变与SEQ ID NO 4序列的第53位G43-A43突变的焦磷酸测序仪测序峰图。图8 是本发明所扩增得到的猪Pitx2c基因的部分核苷酸序列，也就是序列表中 的SEQ ID NO :1，片段大小为296bp，图中下划线分别为正、反向引物序列。括号内所显示的
是碱基突变。图9 是本发明所扩增得到的猪Pitx2c基因的部分核苷酸序列，也就是序列表中 的SEQ ID NO :2，片段大小为407bp，图中下划线分别为正、反向引物序列。括号内所显示的
是碱基突变。图10 是本发明所扩增得到的猪Pitx2c基因的部分核苷酸序列，也就是序列表中 的SEQ IDNO :3，片段大小为105bp，图中下划线分别为正、反向引物序列，图中方框所标记 的为焦磷酸测序引物。括号内所显示的是碱基突变。图11 是本发明所扩增得到的猪Pitx2c基因的部分核苷酸序列，也就是序列表中 的SEQ IDNO :4，片段大小为105bp，图中下划线分别为正、反向引物序列，图中方框所标记 的为焦磷酸测序引物序列。括号内所显示的是碱基突变。
具体实施例方式实施例1 (制备实施例)1.猪Pitx2c基因部分cDNA序列克隆(1)引物设计用人Pitx2c基因的mRNA(GenBank登录号NM 000325)序列为信息探针，利用 NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为 80%以上的猪ESTs序列，然后利用DNAstar软件将所获得的ESTs序列拼接，获得猪Pitx2c 基因的cDNA序列，根据所拼接的序列用Primer Premier 5. 0软件设计4对引物分别扩增 SEQ ID NO :1,SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3，SEQ ID NO :4所述的序列，它们的序列大小分别 为 296bp，407bp，105bp,105bp。所述4对引物的DNA序列如下SEQ ID NO 5 正向引物(Fl):5，-CAAGAATCGCCGGGCCAAAT-3，SEQ ID NO 6 反向引物(Rl):5，-TCACCGCTGAGGGCACCAT-3，SEQ ID NO 7正向引物(F2):5，-CGCAGTTCAACGGGCTTAT-3，SEQIDN0 8反向引物(R2):5’ -GCTGGAGTGCTGCTTTGCT-3’
SEQ ID NO 9正向引物(F3):5，-GTGTGAGCTGCGCCCACT-3，SEQ ID NO: 10反向引物(R3):5，-TCTTGAGTGCCCACGACCT-3， SEQ ID NO: 11正向引物(F3):5，-GTGTGAGCTGCGCCCACT-3，SEQ ID NO: 12反向引物(R3):5，-TCTTGAGTGCCCACGACCT-3，(2) PCR扩增、PCR产物的回收纯化、克隆和测序PCR扩增条件SEQ ID NO :1与SEQ ID NO :2PCR扩增条件反向体系为25uL，包括 IXPCR buffer, 2mM MgC12，0. 2 μ M 每种 dNTP，0. 2mM 正反向引物，IU Taq 酶，1 μ L DNA 模 板；SEQ ID NO :3 与 SEQ ID NO :4PCR 扩增条件反向体系为 35uL，包括 1 XPCR buffer, 2mM MgC12，0. 2 μ M 每种 dNTP，0. 2mM 正反向引物，IU Taq 酶，1 μ L DNA 模板；PCR反应条件为94°C预变性4min ；94°C变性40s，退火温度见表1，退火时间40s， 72°C延伸时间见表1，共35个循环；最后72°C延伸lOmin，25°C保存。PCR产物经1. 5%琼 脂糖凝胶电泳检测。表1扩增用途及退火温度和延伸时间
引物名称及DNA序列在序列表中的命名退火温度ΓΟ延伸时间片段大小(bp)
Fl rCAAGAATCGCCGGGCCAAAT~SEQ ID NO 5 57l30s296
SEQ ID NO 6 Rl: TCACCGCTGAGGGCACCAT v
F2: CGCAGTTCAACGGGCTTAT SEQ ID NO 7 57.440s407
SEQ ID NO 8
R2: GCTGGAGTGCTGCTTTGCT
F3: GTGTGAGCTGCGCCCACT SEQ ID NO 9 5515s105
SEQ ID NO 10
R3: TCTTGAGTGCCCACGACCT
F3: GTGTGAGCTGCGCCCACT SEQ ID NO 11 55V15s105
SEQ ID NO 12
R3: TCTTGAGTGCCCACGACCT
Sl :GGGATCCTAGGACCGTGC SEQ ID NO 13 28°C—一PCR产物的回收纯化PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下从低 熔点琼脂糖凝胶上将含有目的片段的凝胶切下，放入1. 5mL Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(DP1701，购自北京百泰克生物技术有限公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说 明书操作，具体步骤是每IOOmg凝胶中加入100-200 μ 1的DB结合液，56°C水浴3_5分钟 (直到胶完全溶解)，期间手动摇动几次加速溶解；然后将溶液加入吸附柱AC中，12000rpm 离心30-60s，倒掉收集管中的废液；接着用700 μ 1的漂洗液WB，12000rpm离心lmin，弃掉 废液，将吸附柱AC放回空的收集管，12000rpm离心2min。最后将吸附柱AC放入一干净的 离心管中，在吸附腊的中间部位加入30-50μ 1灭菌水或者EB洗脱缓冲液，室温静止2min， 12000rpm 离心 lmin。
连接反应将纯化的PCR产物与pMD18-T载体(购自TAKARA公司)连接，连接反 应总体积是 10 μ 1，其中包括 2. 5μ 1 2Χ ligation buffer, 0. 3 μ 1 载体，7. 2μ 1 纯化 PCR 产物，4°C冰箱过夜连接。感受态细胞的制备从-80°C取出来自于一个DH5ci单菌落的冻存菌液，冰上将 冻存菌液解冻，转接3ml菌液于含有300ml LB的锥形瓶中，继续在37°C振荡培养约2_4h， 待OD 600达到0. 3 0. 4时将锥形瓶从摇床取，将菌液分装至50ml预冷的离心管中，冰浴 30min,4°C 4，OOOg离心IOmin以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液；然后用IOml冰预 冷的0. lmol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4°C 4，OOOg离心IOmin —次，将悬液弃 干；最后用2ml冰预冷的0. lmol/L的CaCl2重悬沉淀，加入15% -20%，分装置-80°C长期 保存备用。转化无菌状态下取50 100μ 1感受态细胞于1. 5ml Ependorff管中，将 5 10 μ 1的连接产物加入轻轻混勻，在冰上放置30min后42°C热激90s，其间不要摇动 Ependorff管，取出后迅速冰浴3 4min，加入200 μ 1无抗生素的LB培养液，37°C，220rpm/ min温浴复苏45-60min。然后5000rpm/min离心5min，去除适量的上清，将剩余的菌体与培 养基轻轻混勻，含Amp的平板上，涂勻，37°C平放Ih后倒置培养，14-16小时后观察有无菌落 长出。阳性克隆子的鉴定及测序从平板上挑取单克隆接入1. 5mL含500 μ L Amp的LB 培养液中，并于37°C摇床220rpm/min培养约4_6h左右。以菌液为模板，选用原引物或测序 的通用引物M13(上海生物工程有限公司提供)进行PCR扩增(退火温度58-60°C)。电泳 检测，挑取阳性克隆子的菌液送去测序，序列测定由上海生物工程有限公司完成。将大白和 梅山猪各三个样品的阳性克隆子进行测序，序列经过DNASTAR软件进行比对，可以找到潜 在的SNP。2. PCR-RFLP与焦磷酸测序诊断方法的建立(1) PCR-RFLP诊断方法的建立将SEQ ID NO :1,SEQ ID NO :2PCR产物5 μ L，分别利用限制性内切酶Bpull02I与 HindII 0. 3-0. 5 μ L(3_5U)，加入1 μ LlOXBuffer,补充双蒸水至10 μ L，将样品混勻后离 心，37°C培养箱放置6-12h进行酶切，用2. 5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，用凝胶成像 系统拍照，并记录基因型。用Fl和Rl扩增猪基因组DNA得到296bp特异扩增片段SEQ ID NO 1 (见图2)，扩 增的PCR产物经Bpull02I酶切产生三种基因型，CC基因型有296bp —条带，杂合子CT型 有296bp，247bp与49bp三条带，TT型只有247bp与49bp两条带，用2. 5%的琼脂糖凝胶电 泳检测能明显的判别带型(见图3)
用F2和R2扩增猪基因组DNA得到407bp特异扩增片段SEQ ID N0:2(见图4)， 扩增的PCR产物经HindII酶切产生三种基因型，TT基因型有407bp —条带，杂合子CT型 有407bp，272bp与135bp三条带，TT型只有272bp与135bpg两条带，用2. 5%的琼脂糖凝 胶电泳检测能明显的判别带型(见图5)。(2)焦磷酸测序诊断方法的建立 用F3与R3扩增基因组DNA得到105bp特异扩增片段SEQ IDNO :3 (见图6)与SEQ IDNO :4(见图6)，所得到的序列经分析，SEQ ID NO :3与SEQ ID NO :4上的突变位点并没 有引起酶切位点的改变，因此，本发明采用一种更加精确的鉴定SNP的方法-焦磷酸测序 (Pyrosequencing)的方法对这两个位进行了检测。焦磷酸测序(Pyrosequencing)的方法 与传统方法相比，精确准确性更高，另外一个突出的优点就是它能同时对多个位点进行分 析，本发明中的2个突变位点由于只相差10个碱基的距离，因此，申请人设计了一对引物F3 与R3，用F3和R3这对引物所扩增的105bp特异扩增片段同时包含了这2个突变位点。与 此同时，申请人另外设计了 1条引物Sl可以用于对所扩增的序列进行测序。焦磷酸测序仪 (PSQ 96MA)根据峰值自动判别2个突变的基因型，测序结果如图7所示。实施例2 (应用实施例1)多态性在各猪品种中的分布情况用PCR-Bpul 102I-RFLP 检测 了序列 SEQ ID NO 1 的第 49 位 C49-T49 突变在 12 个 猪种中的多态性；用PCR-HindII-RFLP检测了序列SEQ ID NO 2的第137位C137-T137突 变在7个猪种中的多态性；利用焦磷酸测序(Pyrosequencing)的方法同时检测了序列SEQ ID NO 3的第43位G43-A43突变与序列SEQID NO 4的第53位G53-A53突变在6个猪种中 的多态性。4个SNP位点在各猪种的基因型与基因频率分布如表2所示。其中SEQ ID NO 1的第49位C49-T49突变与SEQ ID NO 2的第137位C137-T137突变都发生在Pitx2c基 因的外显子上，这2个位点的分析结果显示，C等位基因在中国地方品种是占绝对优势的， 而T等位基因在国外品种是点绝对优势的。SEQ ID NO :3的第43位G43-A43突变与序列 SEQ IDNO 4的第53位G53-A53突变发生在猪Pitx2c基因的3，UTR，这2个位点的分析结 果表明，中国地方品种G等位基因点绝对优势，而A等位基因在国外品种点绝对优势。表2猪Pitx2c基因在七个猪品种中的基因型频率与等位基因频率 大白猪 ΟΟ88 930.94500.0550"1431 300.97690.0231
长白猪3736 100.99320.00683232 0010
皮特兰猪2816 1020.80430.19572412 1020.76320.2368
杜洛克猪277 1730.60810.3919274 1580.39740.6026
清平猪250 02501220 02201
梅山猪500 05001461 0350.03000.9700
通城猪180 01801170 01701
二花脸猪190 1180.01350.9865_一一一一一
监利猪19001901—一一——_
合作猪 0 160.03850.9615———_
院南猪190 1180.01350.9865_— ————
阳信猪12001201___ ____3，UTR上的多态位点
c.H3 G>Ac.*53 G>A
基因型与基因型频率等位基因频率基因型与基因型频率等位基因频率
品种 个体数 AA AG GGAG个体数AAAG GGAG
大白猪 3 31 0 0 031274 00.93550.0645
长白猪 27 27 0 01027261 00.98150.0185
皮特兰猪 2814 14 00.75000.2500281412 20.71430.2857
杜洛克猪 27 7 18 20.59260.407427715 50.53700.4630
清平猪 25 0 4 210.08000.92002504 210.08000.9200
梅山猪 28 1 4 230.10710.89292814 230.10710.8929注大白猪、长白猪、皮特兰猪、杜洛克猪为国外猪种；清平猪、梅山猪、 通城猪、二
花脸猪、监利猪、合作猪、皖南猪、阳信猪为中国地方猪种；_代表没有检测的品种。实施例3:(应用实例2)猪标记_性状关联分析用于统计分析的试验材料包括2003和2004年大白X梅山F2代两个资源家系，
用于关联分的主要胴体性状包括皮率，骨率，肥肉率，瘦肉率，瘦肥肉比例，胴体重，屠宰率，
板油重，花油重，内脂率，至第一颈椎胴体长，至第一肋胸胴体长，6-7腰椎间背膘厚，肩部背
膘厚，胸腰椎间背膘厚，臀部背膘厚，平均背膘厚，腿臀比率，眼肌高，眼肌宽，眼肌面积。用
于关联分析的主要肉质性状包括背最长肌PH，股二头肌pH，头半棘肌pH，失水率，系水力，背最长肌色值，股二头肌色值，背最长肌大理石纹评分，股二头肌大理石纹评分，肌内脂肪， 肌内水分。申请人:采用SAS统计软件(SAS Institute Inc, Version 8. 0) glm程序进行单标 记方差分析，同时采用reg程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用 模型为Yijkl = μ +GJSJY1 (+biJklXiJkl) +eiJkl Yij为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应；S1^Y1为固定效应，分别为性别、 年度效应，biJkl为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰日龄为协变量，肉质性 状以胴体重为协变量，生长不考虑协变量；eukl为残差效应。标记1基因型检测结果表明在所检测的大白X梅山两个F2代家系中，CC基因 型68头，CT基因型146头，TT基因型69头。标记2基因型检测结果表明在所检测的大白X梅山两个F2代家系中，CC基因 型69头，CT基因型147头，TT基因型73头。标记3基因型检测结果表明在所检测的大白X梅山两个F2代家系中，AA基因 型74头，CT基因型137头，TT基因型71头。标记4基因型检测结果表明在所检测的大白X梅山两个F2代家系中，AA基因
型71头，CT基因型140头，TT基因型71头。不同基因型与生产性状的统计结果总结于表 ⑶。表3猪Pitx2c基因四个多态位点与猪生产性状的关联分析表 注上标1代表最小二来均值士标准误，数值上标的字母相同表示差异不显著，字 母不同时，大写字母表示差异极显著，小写字母表示差异显著；加性效应负值表示B等位基 因降低性状表型值，其上标*表示ρ < 0. 05，**表示ρ < 0. 01.由表(3)可以看出，标记1与眼肌面积达到了显著水平(P <0.05)，而与背最长肌 肉色达到了极显著水平(P <0.01)；标记2与眼肌面积，背最长肌肉色以及肌内脂肪均达 到显著水平(P < 0. 05)，并且这两个标记在基因型效应方面背最长肌肉色显性效应达到显 著水平(P < 0. 05)。标记3与标记4与背最长肌滴水损失，背最长肌失水率以及背最长肌 肉色达到了显著水平(P < 0. 05)。在基因型效应方面，标记3的三个性状的显性效应均达 到了显著水平(P <0.05)；标记4背最长肌滴水损失与背最长失水率达到显性效应达到了显著水平(P < 0. 05)，而背最长肌肉色的显性效应达到极显著水平(P < 0.01)。
权利要求
一种作为猪标记辅助选择应用的与猪生产性状相关的分子标记，其DNA序列分别如序列表SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4所示；在序列表SEQ ID NO1所示序列的第49bp处有1个C49-T49突变，导致Bpul102I-RFLP多态性；在序列表SEQ ID NO2所示序列的第137bp处有1个C137-T137突变，导致HindII-RFLP多态性；在序列表SEQ ID NO3所示序列的第43bp处有1个G43-A43突变，没有引起酶切位点多态性；在序列表SEQ ID NO4所示序列的第53bp处有1个G53-A53突变，没有引起酶切位点多态性。
2.检测权利要求1所述碱基突变的正、反向引物的DNA序列，如下所示 SEQ ID NO 5 正向引物(Fl) :5，-CAAGAATCGCCGGGCCAAAT-3， SEQ ID NO 6 反向引物(Rl) :5，-TCACCGCTGAGGGCACCAT-3， SEQ ID NO 7正向引物(F2) :5，-CGCAGTTCAACGGGCTTAT-3， SEQ ID NO 8反向引物(R2) 5' -GCTGGAGTGCTGCTTTGCT-3’ SEQ ID NO 9正向引物(F3) :5，-GTGTGAGCTGCGCCCACT-3， SEQ ID NO 10反向引物(R3) :5，-TCTTGAGTGCCCACGACCT-3’ SEQ ID NO 11正向引物(F3) :5，-GTGTGAGCTGCGCCCACT-3， SEQ ID NO 12反向引物(R3) :5，-TCTTGAGTGCCCACGACCT-3，。
3.检测权利要求1中SEQID NO 3与SEQ ID NO 4所用的焦磷酸测序的引物，其DNA 序列如下所示SEQ ID NO 13Sl :5’ -GGGATCCTAGGACCGTGC-3’。
4.一种作为猪标记辅助选择应用的与猪生产性状相关的分子标记的制备方法 第一步，用人Pitx2c基因的mRNA序列为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得同源性为80%以上的猪ESTs序列，然后利 用DNAstar软件将所获得的ESTs序列拼接，获得猪Pitx2c基因的cDNA序列，根据所拼接 的序列设计4对引物，其DNA序列如序列表SEQ ID NO :5_12所示，最后获得如序列表SEQID NO :1，SEQ ID NO :2，SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示的核苷酸序列；第二步，应用PCR-RFLP方法检测SEQ IDNO 1序列的第49位与SEQ IDNO 2序列的第 137位的多态性；应用焦磷酸测序方法检测SEQ ID NO 3所示序列的第43位与SEQ IDNO 4所示序列的第53位的多态性。
5.权利要求1所述的分子标记在猪生产性状选择中的应用。
6 .权利要求2所述的引物在猪生产性状选择中的应用。
7.权利要求3所述的测序引物在猪生产性状选择中的应用。
全文摘要
本发明属于猪标记辅助选择技术领域，涉及到四种可用于猪标记辅助选择的分子标记的制备与应用。所述的分子标记由猪Pitx2c基因克隆获得。它们的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示，在序列表SEQ ID NO1所示序列的第49bp处有1个C49-T49碱基突变，导致Bpu1102I-RFLP多态性。在序列表SEQID NO2所示序列的第137bp处有1个C137-T137突变，导致HindII-RFLP多态性。在序列表SEQ ID NO3所示序列的第43bp处有1个G43-A43突变，在序列表SEQ ID NO4所示序列的第53bp外有1个G53-A53突变。应用焦磷酸测序方法检测了SEQ ID NO3序列的第43位与SEQ ID NO4序列的第53位的多态性。本发明还公开了获得上述分子标记的制备方法和多态性检测的应用，为猪的标记辅助选择提供了新的标记。
文档编号C12N15/10GK101880663SQ20101022317
公开日2010年11月10日 申请日期2010年7月5日 优先权日2010年7月5日
发明者任竹青, 吴望军, 左波, 徐德全, 李凤娥, 熊远著, 雷明刚 申请人:华中农业大学