专利名称：痰样本细菌快速鉴定的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属临床微生物鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定痰样本病原菌的试剂 盒及检测方法。
背景技术：
传统的细菌培养和生化分析，已不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学 研究，研究者不仅希望在分子水平上对各种细菌和病毒进行研究，同时希望检验方法更快 速、准确，通量更高，人为影响因素要尽可能减少，便于构建标准化的操作流程。PCR以及定 量PCR的方法无法获得分子诊断的黄金标准-基因序列，而且受检测菌种的限制，每种菌种 需要特异的PCR引物和或探针，大大限制了其在细菌鉴定中的应用；而利用常规的DNA测序 技术对大片段的DNA进行序列测定，在速度和消耗上不能满足对大规模样本快速检测的要 求。在实际工作中，很短的一段保守/特异序列的测定就可满足对分子诊断的需要。由于 IBsrRNA序列在所有的细菌种都存在，能够满足进行比较的要求，因此以1 6SrRNA序列分析 为基础，采取毒力和毒素基因鉴定方法，在最短的时间内鉴定未知细菌，对细菌性新发传染 病做出准确判定。焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，通量高、操作方 便，便于构建标准化操作流程，因此广受研究者青睐，并在很多方面已应用于临床微生物的 分型鉴定及耐药检测。Pyrosequencing (焦磷酸测序)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行 电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同 一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP 与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。 PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应 中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。Monstein等(2001)用焦磷酸测序技术检测幽门螺杆菌16S rRNA基因16S rDNA的 Vl和V3区序列，将胃镜活检标本中得到的23个幽门螺杆菌标本依据其Vl区的核苷酸序列 差异，鉴定出8种不同的等位基因类型，除11个样本与幽门螺杆菌26695株序列一致、1个 样本与199株的序列一致外，根据Vl区的改变表现为有1个或2个核苷酸的突变或单个核 苷酸的插入而分为4个等位基因类型。另有2个标本的V3区出现C至T转换，证明此技术 可满足对临床病原菌标本的快速鉴定和分型。Urmer stad等(2001)利用焦磷酸测序技术 对106株不同血清型的单核细胞增生李斯特氏菌进行了分型，根据inIB基因第1575位和 1578位核苷酸的变化，将血清型l/2a和l/2c分为一组，l/2b和3b分为一组，而血清型4b 又可分为2个组。该技术还被应用于百日咳杆菌(Bordetella pert ussis)与副百日咳杆 菌(Parapert ussis)等细菌的快速鉴定及分型(Ronaghi等，1999)。Martin等(2006)运 用此技术对百日咳杆菌毒力相关PtxSl基因进行了分型鉴定，并与定量PCR作了方法学的 比较，结果显示两种方法具有很好的一致性，焦磷酸测序技术适合百日咳杆菌的大规模筛 选。此外，Alistair等(2003)用焦磷酸测序技术检测肠球菌的23s rRNA上的抗利奈唑胺位点，并与PCR-RFLP方法比较，结果显示了 100%的一致性。Mar jo等(2005)用焦磷酸测 序技术检测鸟分支杆菌，肺炎链球菌，酿脓链球菌，空肠弯曲杆菌，流感(嗜血)杆菌等多种 病原体的23S rRNA基因2058位多态性，以获得病原体的大环内脂抗药性信息。赵锦荣等 (2005)建立了基于焦磷酸测序技术的高通量检测耐利福平结核分支杆菌的方法，并用传统 的测序方法进行验证，结果显示了 100% —致性，他们认为这种方法具有自动化程度高和结 果准确等特点，相比传统的测序，具有更快速，简便等特点，适用于耐利福平结核分支杆菌 的快速高通量的检测。然而，上述报道均是建立在纯化的菌株或无菌体液单一菌种的检测，临床上痰液 样本有很多正常菌群的存在，这种多种细菌存在的情况通过细菌16S rRNA通用 引物扩增后 用通用引物测序所产生的序列为正常菌群和致病菌的混合序列，而这种混合序列难以直接 通过序列比对的方式解决；本发明通过设计针对痰液标本中的优势正常菌_奈瑟菌属和小 韦荣球菌的特异引物，将两条特异引物与细菌通用引物按一定的比例混合进行PCR扩增， PCR产物经单链纯化步骤去除奈瑟菌和小韦荣球菌的扩增片段而只留下致病菌的扩增序列 来达到对痰液样本中正常菌群进行屏蔽的目的。屏蔽后的PCR产物经焦磷酸测序后所产生 的序列为致病菌的单一序列，该单一序列与数据库比对即可判断致病菌种属。该方法能一 次测序区分痰液样本中致病菌。迄今为止国内外未见一次测序区分痰液样本中致病菌的产 品和报道，因此临床上如果要快速获得痰液样本细菌感染的信息，需要等3-7天或更长时 间。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可靠准确的痰样本细菌快速鉴定的试剂
品.ο本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种痰样本细菌快速鉴定的试剂盒，它包括(1)扩增细菌16S rRNA的Vl可变区的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO=I 和SEQID NO 2所示引物对；(2)屏蔽奈瑟菌属细菌16S rRNA的Vl可变区的特异引物其核苷酸序列如SEQID NO 3和SEQ ID NO 2所示引物对；(3)屏蔽小韦荣球菌16S rRNA的Vl可变区的特异引物其核苷酸序列如SEQ IDNO 4和SEQ ID NO 2所示引物对；(4)测序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；(5)亲和素标记的磁珠；其中，SEQ ID NO :1在其5，端标记生物素；在一次检测中共同使用。上述痰样本细菌快速鉴定的试剂盒，具体包括如下试剂(1)液化试剂0. 2M NaOH ；(2)洗涤试剂0· 9% NaCl 溶液；(3) DNA 提取试剂5% (w/v) g/mLChelex 100 缓冲液，20mg/mL 蛋白酶 K ；
其中，Chelex 100 缓冲液具体为含 0. 03% (w/v) g/mL SDS, 1% (v/v) Tween-20, 1% (v/v)NP-40。(4)反应液PCR Buffer，特异引物SEQ ID NO :1 2，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaq DNA聚合酶；其中，PCRBuffer 具体为:0· 1% (ν/ν)ΝΡ-40,0. 02% (ν/ν)明胶，0· 06% (w/v) g/ mL BSA，0. 1% (ν/ν) Tween-20,0. 06Μ ρΗ8· 9Tricine。(5)单链纯化试剂75% (ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate， 结合缓冲液，退火缓冲液；其中，结合缓冲液具体为10mMTris_HCl，2M NaCl, ImM EDTA,0. 1 % (ν/ν) Tween-20 ；退火缓冲液具体为20mM ρΗ 7. 6Tris_Acetate，2mM 醋酸镁。(6)测序试剂DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物 APS，荧光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。—种痰样本细菌快速鉴定的试剂盒，它包括上述的所有核苷酸序列的碱基互补序 列，也就是包括(1)扩增细菌16S rRNA的Vl可变区的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 5 和SEQ ID NO 6所示引物对；(2)屏蔽奈瑟菌属细菌16S rRNA的Vl可变区的特异引物其核苷酸序列如SEQID NO 7和SEQ ID NO 6所示引物对；(3)屏蔽小韦荣球菌16S rRNA的Vl可变区的特异引物其核苷酸序列如SEQ IDNO 8和SEQ ID NO 6所示引物对；(4)测序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示；(5)亲和素标记的磁珠；其中，SEQ ID NO 5在其5’端标记生物素；在一次检测中共同使用。上述痰样本细菌快速鉴定的试剂盒，具体包括如下试剂(1)液化试剂0· 2MNa0H ；(2)洗涤试剂0· NaCl 溶液；(3) DNA 提取试剂5% (w/v) g/mL Chelex 100 缓冲液，20mg/mL 蛋白酶 K ；其中，5%(w/v) g/mL Chelex 100 缓冲液具体为含 0. 03% (w/v) g/mL SDS, 1% (v/v)Tween-20，1 % (ν/ν)ΝΡ-40。(4)反应液PCR Buffer，特异引物 SEQ ID NO :3 4，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaq DNA聚合酶；其中，PCRBuffer 具体为:0· 1% (ν/ν)ΝΡ-40,0. 02% (ν/ν)明胶，0· 06% (w/v) g/ mL BSA，0. 1% (ν/ν) Tween-20,0. 06Μ ρΗ8· 9Tricine。(5)单链纯化试剂75% (v/v)乙醇溶液，0. 2M NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate， 结合缓冲液，退火缓冲液；其中，结合缓冲液具体为10mMTris_HCl，2M NaCl，ImM EDTA，0. 1 % (v/v) Tween-20 ；退火缓冲液具体为20mM ρΗ 7. 6Tris-Acetate，2mM 醋酸镁。(6)测序试剂DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。本发明所述的细菌为狭义的细菌，包括假单胞菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属、克雷伯菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、不动杆菌属。上述痰样本细菌快速鉴定的试剂盒的检测方法包括如下步骤(1)痰样本前处理；(2)提取细菌DNA(3)以步骤⑵所得DNA为模板，利用通用引物及屏蔽引物进行细菌16S rRNA的 Vl可变区的PCR扩增；(4)步骤(3)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；(5)将步骤(4)得到的纯化的PCR产物进行焦磷酸测序；(6)测序结果与数据库比对判断种属。步骤(2)中，所述的PCR扩增体系为10 X PCR Buffer 5 μ L, SEQ ID NO :10· 3μ L， SEQ ID NO 21 μ L, SEQ ID NO :36μ L, SEQ ID NO 46 μ L, Template 0. 2ng, dNTPS200mM, taqE 2U，加无菌水至 50 μ L ；PCR 扩增条件为-MV 3min ；94°C 25s, 42°C 30s, 72°C 20s, 28 个循环；72°C 3min。或者将SEQ ID NO :5替换上述SEQ ID NO :1 JfSEQ ID NO :6替换上述 SEQ ID NO :2 JfSEQ ID NO 7 替换上述 SEQ ID NO :3，同时将 SEQ ID NO :8 替换上述 SEQ ID NO :4，其它PCR扩增体系和条件相同。有益效果本发明的试剂盒利用焦磷酸测序技术测定的Vl反向区段的序列和数 据库比对判断种属。应用此试剂盒能一次测序区分痰样本细菌可用于呼吸道细菌感染的临 床诊断。不仅为临床诊疗赢得了宝贵的抢救时间，而且具有成本低廉，操作方便，特异性强 的优点。本发明方法可以使痰样本细菌种属鉴定缩短到5小时，成本为传统鉴定法的三分 之一，另外，通过序列比对鉴定细菌是菌种鉴定的终极方法，特别是对一些难鉴定菌序列比 对鉴定更具优势。
图1为1例痰标本致病菌检测结果图，Vl区测序结果为阴性。图2为1例痰标本致病菌检测结果图，Vl区测序结果为 AACGGACGAGAAGCTTGCTTCTCTG，与数据库比对判定为金黄色葡萄球菌。图3为1例痰标本致病菌检测结果图，Vl区测序结果为GGGGAAGGTAGCTTGCTACTGG， 与数据库比对判定为鲍曼不动杆菌。图4为1例菌株检测结果图，Vl区测序结果为GTAGCACAGAGAGCTTG，与数据库比对 判定为肺炎克雷伯菌。图5为1例菌株检测结果图，Vl区测序结果为GTAGCAGGAGAAAGGTGTCGTTTC，与数 据库比对判定为流感嗜血杆菌。图6为1例菌株检测结果图，Vl区测序结果为GCAGCATGATCTAGCTTG，与数据库比 对判定为皮氏伯克霍尔德。图7为1例菌株检测结果图，Vl区测序结果为AACAGACGAGGAGCTTGCTCCTC，与数据 库比对判定为表皮葡萄球菌。图8为1例菌株检测结果图，Vl区测序结果为GTAACATGAAGAAGCTTGCTTC，与数据库比对判定为奇异变形杆菌。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 试剂盒的制备方法。(1)液化试剂0. 2M NaOH,购于上海试四赫维化工有限公司。(2)洗涤试剂0. 9% NaCl溶液，购于上海试四赫维化工有限公司。(3) DNA 提取试剂 5% (w/v) g/mL Chelex 100 缓冲液含 0· 03% (w/v) g/mL SDS (购于杭州荧光泰 生物技术有限公司)，1% (v/v)Tween-20(购于美国Sigma公司)，1% (ν/ν)NP-40 (购于美 国Sigma公司),20mg/mL 蛋白酶 K (购于 Amresco)。(4)反应液PCR Buffer 0. 1 % (ν/ν) NP-40,0. 02 % (ν/ν)明胶(购于美国 Sigma 公司)， 0. 06% (w/v) g/mL BSA (购于美国 Sigma 公司)，0· (v/v) Tween-20 (购于美国 Sigma 公 司)，0. 06MpH8. 9Tricine (购于 Merck 公司)，特异引物SEQ ID NO :1 4 或 SEQ ID NO 5 8，2mM，MgCl2 购于美国Sigma公司，0. 2mM dNTPs 购于上海鼎国生物技术有限公司，2U/y L Taq DNA 聚合酶购自美国 Fermentas 公司。(5)单链纯化试剂75% (ν/ν)乙醇溶液购于杭州长征化学试剂有限公司，0. 2Μ NaOH:购于上海试四赫维化工有限公司，IOmM Tris-Acetate (ρΗ 7.6) :Tris_base 购于美国 Sigma 公司，无水乙酸购于杭 州化学试剂有限公司，结合缓冲液由IOmM Tris-HCl (Tris-base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化 学试剂有限公司)，2M NaCl (购于上海试四赫维化工有限公司)，ImM EDTA(购于杭州化学 试剂有限公司)，0. (v/v) Tween 20 (购于美国Sigma公司)组成，退火缓冲液由20mM Tris-Acetate (ρΗ 7. 6) (Tris-base 购于美国 Sigma 公司， 无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组 成。亲和素标记的磁珠(购于 GE healthcare Bioscience AB)。(6)测序试剂DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶购于QIAGEN公司，底物APS和荧光素购于QIAGEN公司，四种 dNTP (dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)购于 QIAGEN 公司。实施例2 检测方法。仪器Bio-RadS1000PCR 仪，Beckman Microfuge 22R 台式微量冷冻离心机，北京六一琼脂糖凝胶电泳仪、上海培清凝胶成像系统，QIAGEN PyroMark Q96ID测序仪。(1)痰样本前处理(Ia)在痰样本中加入等量的液化试剂，摇晃混勻，室温静置10 20分钟；
(Ib)吸取ImL液化后的痰液至1. 5mL灭菌离心管中，13000rpm离心lOmin，去上 清；(Ic)在沉淀中加入ImL洗涤试剂，震荡混勻，13000rpm离心lOmin，去上清；(Id)重复步骤(Ic) 一次。(2)提取细菌DNA，具体包括如下步骤(2a)在(1)所获得的沉淀中加入5% (w/v) g/mL Chelex 100缓冲液200 μ L和蛋 白酶 Κ2 μ L (20mg/mL, )，56°C孵育 60min,煮沸 15min。(2b) 13000rpm离心10分钟，取上清2 μ L作为DNA模板备用。(3)以步骤⑵所得DNA为模板，利用通用引物和屏蔽引物进行细菌16S rRNA的 Vl可变区的PCR扩增；其中，所述的PCR 扩增体系为10Xbuffer 5 μ L, SEQ ID NO 10. 3 μ L，SEQ ID NO 21 μ L, SEQ ID NO 36 μ L, SEQ ID NO 46 μ L, Template 0. 2ng, dNTPS 200mM, taqE2U, 加无菌水至 50 μ L ；PCR 扩增条件为94°C 3min ；94°C 25s, 42°C 30s, 72°C 20s, 28 个循环； 72°C 3min。或者将 SEQ ID NO :5 替换上述 SEQ ID NO :1 JfSEQ ID NO :6 替换上述 SEQ ID NO :2，将 SEQ ID NO :7 替换上述 SEQ ID NO :3，同时将 SEQ IDNO :8 替换上述 SEQ ID NO :4， 其它PCR扩增体系和条件相同。(4)步骤(3)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化 在使用前，保证所有溶液都达到室温； 在 PSQ 96 板中加入 45 μ 1 annealing buffer，然后每孔加入 SEQ ID NO :2 测 序引物(IOuM) IuL ； 使用Vertex混勻S印harose beads，将需要使用的s印haroe beads总量(每样 本3yL)转移至Ij 一个Eppendorf■管中，在s印harose bead中力口入binding buffer，使得平 均每个样品约有50 μ L的体积，将混合物混勻； 将以上混合物加入PCR产物(50 μ L反应体积)中，每样本50 μ L，将PCR产物在 常温下混勻10分钟，使得beads与生物素结合； 在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180mL高纯水、70%乙 酉享、washing buffer 禾口 120ml Denaturation buffer ；^iTJFvacuum prep workstation 的栗，vacuum prep tool 在高纯水中i青洗 30
vacuum prep tool PCR , MM sepharose beads, vacuum prep tool 放入70%乙醇中5秒,然后移到denatureation buffer中5秒，再移到washing buffer中 清洗10秒，把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放s印harose beads ； 使用高纯水清洗vacuum pap tool。将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80°C 2分钟，再冷却到室温后 放入测序仪中。(5)将步骤(4)得到的纯化的PCR产物进行焦磷酸测序；
(6)测序结果与美国国家生物信息技术中心(NCBI)数据库比对判断种属。将本 发明方法用于8例临床痰标本的鉴定，测序图如图1-8所示。本发明方法与痰 标本经微生物培养、致病菌分纯后用法国生物梅里埃的微生物鉴定系统做比对，结果一致。
权利要求
一种痰样本细菌快速鉴定的试剂盒，其特征在于它包括(1)扩增细菌16S rRNA的V1可变区的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示引物对；(2)屏蔽奈瑟菌属细菌16S rRNA的V1可变区的特异引物其核苷酸序列如SEQID NO3和SEQ ID NO2所示引物对；(3)屏蔽小韦荣球菌16S rRNA的V1可变区的特异引物其核苷酸序列如SEQ IDNO4和SEQ ID NO2所示引物对；(4)测序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；(5)亲和素标记的磁珠；其中，SEQ ID NO1在其5’端标记生物素；在一次检测中共同使用。
2.根据权利要求1所述的痰样本细菌快速鉴定的试剂盒，其特征在于它包括如下试剂(1)液化试剂0.2MNa0H ；(2)洗涤试剂0.9%NaCl溶液；(3)DNA提取试剂5% (w/v) g/mL Che lex 100 缓冲液，20mg/mL 蛋白酶 K ；(4)反应液PCRBuffer，特异引物 SEQ ID N0:1 4，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ U LTaqDNA聚合酶；(5)单链纯化试剂75%(v/v)乙醇溶液，0. 2MNa0H，lOmM pH 7. 6Tris_Acetate，结合 缓冲液，退火缓冲液；(6)测序试剂DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧 光素和dNTP。
3.一种痰样本细菌快速鉴定的试剂盒，其特征在于它包括权利要求1所述的所有核苷 酸序列的碱基互补序列，也就是包括(1)扩增细菌16SrRNA的VI可变区的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6所示引物对；(2)屏蔽奈瑟菌属细菌16SrRNA的VI可变区的特异引物其核苷酸序列如SEQIDN0 7和SEQ ID NO 6所示引物对；(3)屏蔽小韦荣球菌16SrRNA的VI可变区的特异引物其核苷酸序列如SEQ IDN0 8 和SEQ ID NO 6所示引物对；(4)测序引物其核苷酸序列如SEQID NO 6所示；(5)亲和素标记的磁珠；其中，SEQ ID NO 5在其5，端标记生物素； 在一次检测中共同使用。
4.根据权利要求3所述的痰样本细菌快速鉴定的试剂盒，其特征在于它包括如下试剂(1)液化试剂0.2M NaOH ；(2)洗涤试剂0.9%NaCl溶液；(3)DNA提取试剂5% (w/v) g/mLChelex 100 缓冲液，20mg/mL 蛋白酶 K ；(4)反应液PCRBuffer，特异引物 SEQ ID N0:5 8，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ U LTaq DNA聚合酶；(5)单链纯化试剂75%(v/v)乙醇溶液，0. 2M NaOH, 10mM pH 7. 6Tris_Acetate，结合 缓冲液，退火缓冲液；(6)测序试剂DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧 光素和dNTP。
5.一种痰样本细菌快速鉴定的试剂盒的检测方法，其特征在于它包括如下步骤(1)痰样本前处理；(2)提取细菌DNA;(3)以步骤⑵所得DNA为模板，利用通用及屏蔽引物进行细菌16SrRNA的VI可变区 的PCR扩增；(4)步骤(3)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；(5)将步骤(4)得到的纯化的PCR产物进行焦磷酸测序；(6)测序结果与数据库比对判断种属。
6.根据权利要求5所述的痰样本细菌快速鉴定的试剂盒的检测方法，其特征在于步骤 (3)中所述的 PCR 扩增体系为10 X buffer 5 u L, SEQ ID NO 10. 3u L, SEQ ID NO 21 u L, SEQ ID NO :36u L, SEQ ID NO :46u L, Template 0. 2ng, dNTPS 200mM，taqE2U，加无菌水至 50 ii L ;PCR 扩增条件为94°C 3min ；94°C 25s，42°C 30s，72°C 20s, 28 个循环；72°C 3min。
7.根据权利要求5所述的痰样本细菌快速鉴定的试剂盒的检测方法，其特征在于步 骤(3)中所述的 PCR 扩增体系为:10XPCR Buffer 5 u L, SEQ ID NO :50. 3u L, SEQID NO: 6 luL, SEQ ID NO :76u L, SEQ ID NO 86 u L, Template 0. 2ng, dNTPS 200mM, taqE 2U, 加无菌水至 50ii L ；PCR 扩增条件为94°C 3min ；94°C 25s，42°C 30s,72°C 20s, 28 个循环； 72 °C 3min。
全文摘要
本发明涉及临床微生物鉴定领域，提供了一种快速鉴定痰样本中细菌的试剂盒及方法。该试剂盒包括2条通用引物扩增细菌16S rRNA的V1可变区，2条特异引物屏蔽奈瑟菌属细菌16S rRNA的可变区，2条特异引物屏蔽小韦荣球菌16S rRNA的可变区，1条测序引物测定V1正向区段的序列，亲和素标记的磁珠，测序结果与数据库比对判断种属。应用此试剂盒能一次测序区分痰样本中的细菌，可用于痰样本中细菌感染的临床诊断。不仅为临床诊疗赢得了宝贵的抢救时间，而且具有成本低廉，操作方便，特异性强的优点。
文档编号C12Q1/04GK101864491SQ201010221270
公开日2010年10月20日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者任绪义, 吕江峰, 虞闰六 申请人:杭州迪安医学检验中心有限公司