专利名称：一种腐解玉米秸秆的复合菌系的构建方法
技术领域：
本发明属于微生物筛选方法技术领域，具体涉及一种腐解玉米秸秆的复合菌系的 构建方法。
背景技术：
秸秆占作物生产量的50%以上，是一种极为丰富的并能直接利用的可再生有机资 源，也是当今世界上仅次于煤炭、石油和天然气的第四大能源。我国年作物秸秆资源数量 近7亿吨，几乎占世界秸秆资源总量的1/3，我国每年各地区平均有35. 3%的秸秆被露天焚 烧，大量的秸秆被浪费或就地焚烧，不仅造成了严重的环境污染和火灾隐患，而且也造成了 资源的巨大浪费。秸秆本身是一种很好的生物质能源。秸秆中的有机成分以纤维素、半纤维素为主， 其次为木质素、蛋白质、氨基酸等营养丰富。据测算，每100g秸秆中，含碳44. 2g，氮0.62g， 磷0. 25g，钾1.44g及钙、镁、铁、硫、硅等微量元素，有机物含量约为15%左右。秸秆还田具 有显著的生态效应，能改善土壤理化性状，有效增加土壤有机质含量、改良土壤、降低土壤 容重、提高土壤的通透性和田间持水量，从而增强土壤保肥保水能力，有利于土壤的可持续 利用。秸秆还田还可明显增加土壤中氮、速效磷和速效钾及其他微量元素的含量，对缓解我 国氮、磷、钾肥比例失调的矛盾，弥补磷、钾肥力不足有着十分重要的意义。此外，秸秆还田 后改善了土壤的理化性质，增加了有机能量物质，为提高土壤的生物活性提供了良好的生 长环境和丰富的营养，刺激土壤中微生物的总量大幅度增加，提高土壤中微生物组成的多 样性和生物活性，进而增强了土壤微生物系统的稳定性和生物缓冲性，促进了土壤有机质 的转化和养分的有效化，使土壤肥力进一步提高。目前我国玉米秸秆的产量占到全国秸秆总产量的38%左右，大部分集中在我国黄 淮平原地区，处于小麦、玉米两熟区。尽管秸秆就地直接还田无养分损失，节省工本，减轻劳 动强度，便于推广。但由于玉米秸秆富含纤维素、半纤维素、木质素、蜡质等多种难降解物 质，在自然条件下腐解的速度相当慢。同时，大量玉米秸秆直接还田后，会影响下茬作物的 生根和成活，造成生产管理上的不便。若将大量的秸秆先堆制腐熟后施入农田，因需要较多 的劳力和较繁琐的过程，又难以推广。因此实现大量秸秆就地直接还田，加快秸秆快速腐解 速度，是生产实践中提出的急切需要解决的课题。目前，已有多种用于腐解有机废弃物、制造有机肥的腐熟菌剂产品及申报的专利， 如公告号CN1158225C、名称为“有机物快速腐熟菌剂”专利申请中崔宗均等采用外淘汰筛选 法从高温堆肥作为原料筛选构建了一组高效稳定的纤维素分解菌复合系MC1，该复合系8d 可将水稻秸秆完全降解。李为等在《新疆农业科学》2009年第46卷第1期第12-11页中发表的“一组高效 棉秆降解菌复合系的构建及其降解特性研究”中所述的从多种样品中筛选构建了一组高效 棉秆降解菌复合系zFC，在28°C静置培养条件下经过13d的液体发酵，zFC菌系对棉秆中纤 维素、半纤维素和木质素的降解率分别为21. 0%、65. 和46.3%，加速了棉秆的降解。
但是上述的复合菌系均是在常温及高温、且是液体发酵条件下具有较好的降解秸 秆能力，而关于中低温尤其是固体条件下腐解农作物秸秆的复合菌系的研究报道则较少。 又由于这些技术采用液体培养的方法，复合菌系的组成多以细菌为主体。
发明内容
近年的研究和实践证明，应用具有快速降解秸秆物料的菌剂，即腐解菌剂，是解决 秸秆还田问题的关键。玉米等秸秆通过施用腐熟菌剂，加快了秸秆物料的腐解速度，提高其 腐解率，在一定程度上达到了提高产量、提升土壤的有机质和土壤肥力的多种效果。因此， 研发和使用微生物腐熟剂，是有望实现秸秆全量还田的关键和出路。本发明的目的是为了解决现有技术中秸秆直接还田工艺上只能在常温及高温、且 是液体发酵条件下具有较好的降解秸秆能力的缺陷，发明了一种腐解玉米秸秆的复合菌系 的构建方法。本发明的技术方案如下一种腐解玉米秸秆的复合菌系的构建方法，包括以下步骤(1)、菌群的富集培养取玉米秸秆多年还田的土壤置于底层，土壤上铺新鲜玉米 秸秆后在玉米秸秆上再次铺上土壤，三者之间的厚度比为3 1 3，调节C/N值至30，室 温下培养2个月，培养期间每3-5天喷洒蒸馏水保持适当湿度；本步骤是模拟实际玉米秸秆 大田还田操作过程，即将玉米秸秆粉碎后，撒播再翻埋在土壤中，故富集培养模拟这个过程 进行腐解菌群的富集；(2)、固体培养基的制备取玉米秸秆粉100g，加入去淀粉麸皮30g，调节C/N值至 28，加入灭菌后的无机盐基础营养盐溶液，使混合物含水量为40%，在培养基表面放置两张 新华1号滤纸；所述无机盐基础营养盐溶液中含有下列物质NH4CL 1. lg/L，KH2P04 lg/L， MgS04 7H20 0. 2g/L，CaCl2 0. Olg/L, FeS04 0 . 00lg/L 和土壤 5g/L ；本步骤中选用新华 1 号 滤纸作为简单、易于识别辨认的富集度指示物，由于滤纸由纤维素组成，较秸秆易于腐烂， 若滤纸腐烂则说明其中的腐解微生物活动迅速；(3)、营养限制性诱导培养取步骤(1)中菌群富集后的土壤_秸秆混入步骤(2) 中制备的培养基中，含水量调节至40%，装于带盖的塑料盒内，30°C半开放培养16天以进 行营养限制性诱导培养；每代培养结束后按质量分数8%接种量接入下一级培养基，继续 传代培养3代以上；(4)、梯度降温诱导培养取步骤(3)中的培养物按每传一代降低1°C的梯度进行 降温诱导培养；此步骤的诱导过程中保留颜色变化明显、滤纸崩解迅速、玉米秸秆失重率大 的复合菌系继续传代，按每传代一代逐渐剔除一个变化不明显的菌系，在直至从中选出在 模拟自然条件下在16d内对玉米秸秆腐解快速、腐解效果明显的菌系组合；(5)、连续对步骤(4)中筛选出的在自然条件下16d内对玉米秸秆腐解快速、腐解 效果明显的复合菌系进行继代培养，得到腐解玉米秸秆的复合菌系css-1 ；本步骤中继代 培养所采用的培养基是步骤(2)中制备的培养基。上述技术方案中所述的复合菌系的筛选构建方法，其中所述步骤(1)中是通过添 加尿素调节C/N值至30 ；所述步骤(5)中的继代培养是指对复合菌系培养5代以上。上述技术方案中所述的复合菌系的筛选构建方法，其中步骤(2)中的无机盐基础营养盐溶液是在121°c下灭菌30分钟。本发明具有以下有益效果与现有技术相比，本发明是在固体培养基条件下筛选得到的，其复合菌系的组成 更具多样性，包括了细菌和真菌，从而具有更好的腐解效果；采用本发明的方法构建的复合 菌系CSS-1能明显加速玉米秸秆的腐解。说明书附
图1、图1为复合菌系CSS-1不同继代腐解的玉米秸秆的失重率；2、图2为玉米秸秆腐解过程中纤维素(CMC)酶活性变化。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式
对本发明作进一步的说 明；以下实施例中的玉米秸秆多年还田土壤选自山西省壶关县，山东省济阳县，北京市昌平 区、海淀区等以及任何玉米秸秆连续多年还田的地块。实施例1 一种腐解玉米秸秆的复合菌系的构建方法，包括以下步骤(1)、菌群的富集培养取玉米秸秆多年还田的土壤置于容积为32L塑料桶的底 层，厚度为15cm，中间铺上5cm厚的新鲜玉米秸秆，其上再铺上15cm厚的土壤，调节C/N值 至30，室温下培养2个月，为防止表面过于干燥可定期喷洒蒸馏水；(2)、固体培养基的制备将玉米秸秆粉碎过1mm筛，称取玉米秸秆粉100g，加入 去淀粉麸皮30g，调节C/N值至28，加入在121°C下灭菌30分钟的无机盐基础营养盐溶液， 使混合物含水量为40%，在培养基表面放置两张新华1号滤纸，30°C静置培养；所述无机 盐基础营养盐溶液中含有下列物质NH4CL 1. lg/L，KH2P04 lg/L，MgS04 7H20 0. 2g/L，CaCl2 0. 01g/L，FeS040. 00lg/L 和土壤 5g/L ；(3)、营养限制性诱导培养取步骤(1)中菌群富集后的土壤_秸秆混入步骤(2) 中制备的培养基中，含水量调节至40%，装于带盖的塑料盒内，30°C半开放培养16天以进 行营养限制性诱导培养；每代培养结束后按质量分数8%接种量接入下一级培养基，继续 传代培养3代以上；(4)、梯度降温诱导培养取步骤(3)中的培养物按每传一代降低1°C的梯度进行 降温诱导培养；在诱导过程中保留颜色变化明显、滤纸崩解迅速、玉米秸秆失重率大的复合 菌系继续传代，按每传代一代逐渐剔除一个变化不明显的菌系，在直至从中选出在模拟自 然条件下在16d内对玉米秸秆腐解快速、腐解效果明显的菌系组合；(5)、连续对步骤(4)中筛选出的在自然条件下16d内对玉米秸秆腐解快速、腐解 效果明显的复合菌系进行继代培养，得到腐解玉米秸秆的复合菌系css-1。实施例2 本实施例与实施例1完全相同，区别仅在于在步骤(1)中是通过添加尿素调节C/ N值至30 ；步骤(5)中的继代培养是指对复合菌系培养5代以上。实施例3 本实施例与实施例2完全相同，区别仅在于在步骤(2)中的无机盐基础营养盐溶 液是在121°C下灭菌30分钟。
实施例4 复合菌系CSS-1中菌种组成在实施例1 4中筛选得到的经过平板分离培养，得到一系列形态特征明显的菌 落，然后对各个菌落在相应的培养件下划线分离培养，得到一系列纯菌落。提取各个菌株的 总DNA，然后以总DNA为模板进行16S/18S rDNA序列的PCR扩增，以1 %琼脂糖凝胶检验扩 增产物，测序结果通过BLAST程序与核酸数据库中的序列进行对比分析结果如下表1所示， 包括8种细菌、2株放线菌和3种真菌。表1复合系CSS-1中分离菌株的数据库检索结果 试验例以下通过试验例来具体说明用本发明所述的方法构建的复合菌系CSS-1所具有 的有益效果，本试验例中将筛选的复合菌系CSS-1和市场广泛应用的秸秆腐解菌剂A (腐秆 剂，购自佛山金葵子植物营养有限公司)分别接入本发明中所述的固体培养基中并在22°C 培养。以不接菌的培养基作空白对照(CK)，分别测定秸秆失重率、纤维素酶活、C/N等的测定。试验例1 腐解过稈中秸秆失重率的测定结果在腐解过程中秸秆中各组分不断被微生物分解利用，因此秸秆的质量会有明显的 降低。从图1中可知，经过16d的腐解复合菌系CSS-1和菌剂A处理的失重率都明显高于空白对照组处理的失重率。菌系处理的失重率在38. 5% 40%;而菌剂A处理在24. 5% 26. 5%，空白处理失重率在13% 14.5%。与空白对照和菌剂A处理相比，接种CSS-1的 平均失重率分别高出62. 62%和179. 71%。测定结果说明复合菌系CSS-1能明显加速玉米 秸秆的腐解。试验例2 腐解过稈中纤维素酶活变化从图2中可知复合菌系CSS-1和菌剂A处理呈现出基本相同的变化趋势。从曲线 的变化形状来看，复合菌系的处理在前4d稍有下降，从第4d开始迅速上升在第10d达到 最高峰而后迅速下降在12天以后变化趋于平缓；而菌剂A处理在前6d稍有下降，从第6d 开始迅速上升在第8d达到最高峰而后下降在10天以后变化趋于平缓。从酶活大小来看 复合菌系处理的最高酶活为0. 281U/ml，平均酶活为0. 187U/ml ；菌剂A处理的最高酶活为 0. 154U/ml ；平均酶活为0. 1045U/mlo与菌剂A处理相比复合菌系最高酶活提高82% ；平均 酶活提高79%。表明复合菌系处理在启动速度和强度上均优于目前广泛应用的菌剂A。试验例3 腐解过稈中C/N的测定结果玉米秸秆腐解过程中微生物将有机物不断分解并释放出二氧化碳，木质素、纤维 素、可溶性糖等不断降解，全碳含量缓缓下降，最终导致C/N逐渐降低。C/N比是最常用的评 价腐熟度的参数，一般认为堆肥原料的C/N下降到20以下时堆肥发酵成熟。根据MoreL等 建议采用T值来评价堆肥腐熟度，T=(终点C/N)/(初始C/N)，并认为当T值小于0.6时 堆肥腐熟。因此，本试验例中对CSS-1和菌剂A腐解玉米秸秆的终点C/N比，即T值进行了 测定，结果列于表2，并依此作为评价腐解程度的指标之一。结果表明相同处理的不同平行 间T值表现出一定的稳定性，且与评价堆肥腐熟程度的数值标准相近似。因此，可用T值来 作为秸秆腐解程度的指标。表2 CSS-1和菌剂A腐解样品测定T值 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限 制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技 术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依 据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本 发明的技术方案的范围内。
权利要求
一种腐解玉米秸秆的复合菌系的构建方法，包括以下步骤(1)、腐解菌群的富集培养取玉米秸秆多年还田的土壤置于底层，土壤上铺新鲜玉米秸秆后在玉米秸秆上再次铺上土壤，三者之间的厚度比为3∶1∶3，调节C/N值至30，室温下保持湿度培养2个月；(2)、固体培养基的制备取玉米秸秆粉100g，加入去淀粉麸皮30g，调节C/N值至28，加入灭菌后的无机盐基础营养盐溶液，使混合物含水量为40％，在培养基表面放置两张新华1号滤纸；所述无机盐基础营养盐溶液中含有下列物质NH4CL 1.1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4 0.001g/L和耕层土壤5g/L；(3)、营养限制性诱导培养取步骤(1)中菌群富集后的土壤-秸秆混入步骤(2)中制备的培养基中，含水量调节至40％，装于带盖的塑料盒内，30℃半开放培养16天以进行营养限制性诱导培养；每代培养结束后按质量分数8％接种量接入下一级培养基，继续传代培养3代以上；(4)、梯度降温诱导培养取步骤(3)中的培养物按每传一代降低1℃的梯度进行降温诱导培养；(5)、连续对步骤(4)中筛选出的在自然条件下16d内对玉米秸秆腐解快速、腐解效果明显的复合菌系用步骤(2)中制备的培养基进行继代培养，得到腐解玉米秸秆的复合菌系CSS-1。
2.根据权利要求1所述的复合菌系的筛选构建方法，其特征在于所述步骤(1)中是通过添加尿素调节C/N值至30 ；所述步骤(5)中的继代培养是指对 复合菌系培养5代以上。
3.根据权利要求1或2所述的复合菌系的筛选构建方法，其特征在于所述步骤(2)中 的无机盐基础营养盐溶液是在121°C下灭菌30分钟。
全文摘要
本发明一种常温腐解玉米秸秆的复合菌系的构建方法，属于微生物筛选方法技术领域。包括以下步骤(1)菌群的富集培养，(2)固体培养基的制备，(3)营养限制性诱导培养，(4)梯度降温诱导培养，和(5)继代培养后得到腐解玉米秸秆的复合菌系CSS-1。该方法筛选的复合菌系包括细菌、真菌和放线菌。本发明具有以下优点是在固体培养基条件下筛选得到的，其复合菌系包括了细菌、真菌和放线菌，具有更好的腐解效果。
文档编号C12N1/00GK101886042SQ201010212119
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者关大伟, 冯瑞华, 刘尧, 姜昕, 曹凤明, 李俊, 李力, 杜秉海, 杨小红, 沈德龙, 陈慧君 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所