一种检测mlh1基因突变的方法及其试剂盒的利记博彩app

文档序号:584399阅读:299来源:国知局
专利名称:一种检测mlh1基因突变的方法及其试剂盒的利记博彩app
技术领域
本发明属于分子生物学和医学领域。涉及人MLHl基因的突变及其用途。具体涉及人MLHl基因(MLHlgene)的突变(Mutations)及其与遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC) 相关性的检测。
背景技术
“结直肠癌"(CRC)在肿瘤中向来有"富贵病"之称,表明其与人们的生活习惯有着密切的联系。在上海,随着生活水平的提高,结直肠癌的发病率已跃居常见恶性肿瘤的第二位,仅次于肺癌。据复旦大学附属肿瘤医院资料统计,近几年结直肠癌手术量连年攀升,2007年该院结直肠癌手术量近900例,2008年已突破千例,达到了 1027例。遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC),又称为林奇综合症,是一种常染色体显性遗传性疾病,约占结直肠癌的 5% [Umar A, Risinger JI, Hawk ET, Barrett JC. Testing guidelines for hereditary non-polyposis colorectal cancer[J]. Nat Rev Cancer 2004;4 :153-8], 外显率高达80%-90%。HNPCC是由DNA错配修复基因(MMR)突变引起的,主要发生在 MLHl, MSH2 和 MSH6,比较少的发生在 PMSl 和 PMS2 中[Peltomaki P, Vasen HF. Mutations predisposing to hereditary nonpolyposis colorectal cancer :Database and results of a collaborative study—The International Collaborative Group on Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer [J]. Gastroenterology 113:1146-1158,1997]。目前, 用于筛选HNPCC的方法尽管较多,但只有检测出胚系(germline)的MMR基因病理性突变才能确诊为 HNPCC 患者[Cai Q, Sun MH, Fu G, et al. Mutation investigation of h MLHl and hMSH2 genes in hereditary nonpolyposis colon cancer families from China[J]. J Chin Pathol,2003,32 :323-328.]。HNPCC无论是在治疗措施上还是在随访方案上均与散发性结直肠癌者不同, Syngal S等研究发现,HNPCC肿瘤对常用化疗药如5-氟尿嘧啶(5-FU)等有耐药反应[De Vos Tot NederveenCappel WH, Meulenbeld HJ, Kleibeuker JH et al. Survival after adjuvant 5-FU treatment for stage III colon cancer in hereditary nonpolyposis colorectal cancer [J], Internal J Cancer 2004:109:468-471·]。因此 HNPCC 患者的确诊对于选择合适的治疗方案、确定随访时间及间隔、判断预后,以及对家族成员进行二级预防等具有重要意义[Liu SR, Zhao B, Wang Z J, et al. Cl inical features and mismatch repair gene mutation screening in Chinese patients with hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma. World J Gastroenterol,2004,10 :2647-2651.]。对于已发现存在遗传性错配修复基因突变的患者,可以密切监测异时多原发癌和其他HNPCC相关肿瘤的发生,并对其家族中的其他成员,特别是尚未出现肿瘤的年轻成员进行相应检测,确认突变基因携带者,不但有助于对癌症易感个体重点进行临床监测和临床症状出现前的早期诊断, 也可为遗传咨询和基因治疗提供依据,并可使非突变携带者免除不必要的精神和经济负担,对基因突变携带者,可以进行密切随访,以做到早期诊断,早期治疗。
与HNPCC致病密切相关的错配修复基因中,MLHl基因位于3p21_23,其突变率是所有相关基因中最高的。全球范围内对于MMR突变的研究很多,可是中国对此的研究很少。 在所有的突变研究中,迄今为止,尚没有与本发明内容相似的报道。

发明内容
本发明的目的是提供检测HNPCC易感基因突变情况的方法、试剂盒及其用途。尤其是人 MLHl 基因(c. -64G > T, c. 157_160delGAGG, c. 2159insG)在检测 HNPCC 及早期诊断 HNPCC家系中的用途。本发明中,MLHl基因c. 157_160delGAGG(蛋白质氨基酸位置52Glu/Ala并在一个氨基酸之后终止),c. 2159insG (蛋白质氨基酸位置720Vla/Gly并在两个氨基酸之后终止) 均为移码突变,为病理性突变可导致HNPCC的发生。c. -64G > T处于MLHl基因的启动区域,为HNPCC易感位点。本发明所述的MLHl基因的详细信息可参见OMIM号为*120436的基因(可参见网址http://www. ncbi. nlm. nih. gov/),该基因的详细序列可参见GenBank号为27805154的基因(可参见网址 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/),全长是 60250bp。本发明对MLHl基因中的全19个外显子及其接合位点,还有部分启动区域进行了测序。图1显示了 MLHlc. -64G > T的测序结果,图2显示MLHlc. 157_160delGAGG的测序结果,图3显示MLHlc. 2159insG的测序结果。本发明提供了检测样品中是否存在MLHl基因突变方法,其思路为(a)用MLHl基因特异性引物扩增样品的MLH119个外显子及其接合位点,还有部分启动区域;(b)检测扩增产物中是否存在突变,包括碱基改变,插入及缺失。以及突变的类型和致病性分析。本发明提出了一种检测MLHl基因突变的方法,首先,获得样品中MLHl基因的启动区或者编码区的DNA序列或者氨基酸序列,然后与正常MLHl基因的相应序列对比确定样品中MLHl基因是否存在基因突变情况。所述的编码区包括MLHl基因的第1号、第2号或者第19号外显子。所述的突变即样品MLHl基因与正常MLHl基因的相应序列不同。所述的突变包括 MLHlc. -64G > T、c. 157_160delGAGG 或者 c. 2159insG。所述的突变可以是 MLHlc. -64G > T、c. 157_160delGAGG 或者 c. 2159insG。所述的突变可以是 p. Glu53AlafsXl 或者 p.Val720GlyfsX2o本发明中,所述的c. -64G > T是指MLHl基因64位G — T,所述的 c. 157_160delGAGG 是指 157_160 位的 GAGG 缺失 4bp,所述的 c. 2159insG 是指 2159 位插入1个G ;所述的p. Glu53AlafsXl是指蛋白质氨基酸位置52Glu/Ala并在一个氨基酸之后终止,所述的P. Val720GlyfsX2是指蛋白质氨基酸位置720/VdGly并在两个氨基酸之后终止。检测时通常需要先获得样品的DNA。例如抽取待检测者的血样,提取DNA,然后,通过PCR (聚合酶链反应)大量扩增,再进行相应检测。相应的,本发明还提供了一种检测MLHl基因突变的试剂盒,该试剂盒含有下列三对引物序列中的一对或者几对(1)扩增MLHl基因的第1号外显子区的DNA序列的引物;(2)扩增MLHl基因的第2号外显子区的DNA序列的引物;(3)扩增MLHl基因的第19号外显子区的DNA序列的引物。扩增方法可以采用PCR(聚合酶链反应)。除非特别提出,可采用常规的试剂、设备和操作方法进行扩增。通过测序可以明确扩增产物的DNA序列,即样品中MLHl基因相应位置的DNA序列。具体而言,该试剂盒含有如SEQ ID NO 1_6中任意一条或者几条的引物。其中, SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2可用于扩增含有MLHl基因的第1号外显子区的DNA序列;SEQ ID NO 3和SEQID NO 4可用于扩增含有MLHl基因的第2号外显子区的DNA序列;SEQ ID NO 5和SEQID NO 6可用于扩增含有MLHl基因的第19号外显子区的DNA序列。例如,该试剂盒含有序列如SEQ ID NO 5和6所示的引物;或者该试剂盒含有序列如SEQ ID NO 3和4所示的引物;或者该试剂盒含有序列如SEQ ID NO 1和2所示的引物。除了上述引物外,试剂盒中通常还可以含有缓冲液、PCR所需试剂、标准对照和说明书等。本发明还提供了上述检测MLHl基因突变的方法的应用,即将该方法用于遗传性非息肉性结直肠癌致病性分析,将该方法用于确定遗传性非息肉性结直肠癌的患病风险。本发明中,检测MLHl基因的三个突变的基因型也可用于诊断HNPCC。检测针对基因组DNA。MLHl基因的以上三种基因型可用已有的技术如DNA序列分析、PCR、变性高效液相色谱分析(DHPLC)等检测突变。本发明提供的检测样品中是否存在MLHl基因突变的方法,可用于对个体的HNPCC 易感性进行诊断,它包括步骤检测该个体的MLHl基因编码区、接合位点和部分启动区域是否与普通人群存有差异,以此判断该个体患HNPCC的风险是否高于普通人群,发生突变基因型的个体患HNPCC的风险显著高于普通人群,应当进一步对其真个家族进行检测以及保持随访监测。本发明MLHl基因的突变可用于结直肠癌的个性化治疗时的参考。使用本发明发现的携带基因突变患者,即被判定为HNPCC患者,治疗方案及用药均与散发性结直肠癌患者不同。在使用本发明MLHl基因突变位点的同时,还可参考使用其他治疗结直肠癌症的药剂。本发明的检测方法简便易行,成本低廉,高效快速,结果明了。可以大大减轻患者的负担,尽早排除非HNPCC患者,为结直肠癌患者的用药方案提供了参考。


图1显示了 MLHl基因启动区域_64为G/T基因型的检测结果。图2显示了 MLHl基因第2号外显子157_160为缺失GAGG基因型的检测结果。图3显示了 MLHl基因第19号外显子2159插入1个G的基因型的检测结果。
具体实施例方式实施例IMLHl基因突变检测一、实验材料
(一)·主要试剂PCR相关试剂=TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司高效,包括PCR扩增用 Taq DNA Polymerase, TaKaRa Code :DRR001A, TaKaRa Ex Taq(5U/μ 1),10XEx Taq Buffer (Mg2+Plus),dNTP Mixture (各2. 5mM)。引物上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Marker 天根生化科技有限公司(Marker I)。纯化试剂盒北京博大泰克生物基因技术有限责任公司,B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒(100次)。(二)·重要仪器1. PCR 仪Eppendorf AG 2233 IHamburgeppendorf Mastercycler epgradient S220-240V 50_60Hz 800W2.离心机Eppendorf AG 2233IHamburgeppendorf Centrifuge 5415D230V 0. 8A 50-60Hz 180WMax speed 13200min_1Kinetic energy :3100Nm Max density of liquid
1. 2kg/dm33.漩涡振荡混勻器其林贝尔仪器制造公司QL-901VorteX4.掌式离心机其林贝尔仪器制造公司LX-2005.微量加样器印pendorf Research (0. 1-2. 5,1-10,2-20,10-100,20-200, 50-1000 μ 1)6.电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司TE212-L Max 210g d = 0. Olg7.电泳仪上海申能博彩生物科技有限公司PowerBC 300H1A二、引物设计与合成以MLHl基因19个外显子全序列为模板,使用I^rimer Permier 5.0软件分析引物, 并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物信息见表1。表 权利要求
1.一种检测MLHl基因突变的方法,其特征在于,该方法是获得样品中MLHl基因的启动区或者第2号或者第19号外显子的DNA序列或者氨基酸序列,然后与正常MLHl基因的相应序列对比确定样品中MLHl基因是否存在基因突变情况。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的突变是样品MLHl基因与正常MLHl基因的DNA序列中64、157-160或者2159位不同。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的突变是c.15716_0delGAGG或者 c.2159insG。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的突变是样品MLHl基因与正常MLHl基因的相应氨基酸序列中53或者720位不同。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的突变是p.Glu53AlafSXl或者 p.Val720GlyfsX2o
6.一种检测检测MLHl基因突变的试剂盒,其特征在于,该试剂盒含有下列三对引物序列中的一对或者几对(1)扩增MLHl基因的第1号外显子区的DNA序列的引物;(2)扩增MLHl基因的第2号外显子区的DNA序列的引物;(3)扩增MLHl基因的第19号外显子区的DNA序列的引物。
7.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,该试剂盒含有序列如SEQID NO 5和6所示的引物。
8.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,该试剂盒含有序列如SEQID NO 3和4所示的引物。
9.权利要求1所述的方法的应用,其特征在于,将该方法用于遗传性非息肉性结直肠癌的致病性分析。
10.权利要求1所述的方法的应用,其特征在于,将该方法用于确定遗传性非息肉性结直肠癌的患病风险。
全文摘要
本发明属于分子生物学和医学领域。本发明提供了一种检测MLH1基因突变的方法首先,获得样品中MLH1基因的启动区或者编码区的DNA序列或者氨基酸序列,然后与正常MLH1基因的相应序列对比确定样品中MLH1基因是否存在基因突变情况;所述的编码区是MLH1基因的第1号、第2号或者第19号外显子。本发明还提供了相应的检测MLH1基因突变的试剂盒以及该方法在确定遗传性非息肉性结直肠癌致病患者方面的应用。本发明的检测方法简便易行,成本低廉,高效快速,结果明了。可以大大减轻患者的负担,尽早排除非HNPCC患者,为结直肠癌患者的用药方案提供了参考。
文档编号C12Q1/68GK102296105SQ201010212048
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月25日 优先权日2010年6月25日
发明者刘方奇, 刘雷, 南蓬, 徐烨, 韦雯倩 申请人:复旦大学, 复旦大学附属肿瘤医院
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