一种人源化抗体及其人源化改造方法

专利名称：一种人源化抗体及其人源化改造方法
技术领域：
本发明涉及一种人源化抗体及其人源化改造方法。
背景技术：
P185是由癌基因Her2/erbB-2编码的一种细胞表面的重要的受体酪氨酸激酶，属 于表皮生长因子受体家族。P185/Her2受体与该家族其他成员类似，由胞外区，跨膜区和胞 内区三个结构域组成，其中胞外区(ECD)又分为四个亚区，其中的I、III亚区为亮氨酸富含 区，II、IV 亚区为半胱氨酸富含区(Carpenter G. (1987) Receptors of epidermal growth factor and other polypeptide mitogens. Annu. Rev. Biochem. 56 :881_914)。表皮生长因 子家族受体广泛地分布于多种组织，尤其在上皮组织、间质组织以及神经发生组织中表达， 在调节细胞的增殖、分化、发育、黏附和迁移中起到了重要的作用。P185/Her2作为表皮生长 因子受体家族的信号转导网络中最重要的一员，其表达水平的异常与细胞信号转导紊乱、 肿瘤的发生和恶性发展紧密相关(Nancy EH, Heidi A, Lane N. (2005) ErbB receptors and cancer :the complexity of targeted inhibitors Nat. Rev. Cancer 5 :341_354)。近年来P185/Her2 —直作为肿瘤治疗领域中的热点被广泛研究。1985年， Greene Μ. I.研究组发现，抗P185/Her2胞外区的单克隆抗体能够使已经转化的Her2高 表达的NIH3T3表型逆转，使肿瘤细胞的表型趋于正常化，同时可以下调Her2受体的表达 7ΚΨ (Drebin JA, Link VC, Stern DF, Weinberg RA, Greene, MI. (1985)Down-modulation of an oncogene protein product and reversion of the transformed phenotype by monoclonal antibodies. Cell 41:695-706)。随后该实验室又发现，抗Her2的单克隆抗 体能抑制移植入裸鼠体内的Her2转化的OTH3T3肿瘤细胞的生长，从而第一次通过体内实 验证明了抗Her2单抗可能对Her2高表达肿瘤有临床治疗的价值(Drebin JA, Link VC, Weinberg RA,Greene MI. (1986)Inhibition of tumor growth by a monoclonal antibody reactive with an oncogene—encoded tumor antigen. Proc Natl Acad Sci USA 83 9129-9133)。这一发现大大促进了抗Her2单克隆抗体的抗肿瘤作用的研究，也揭示了抗体 在肿瘤治疗上应用的前景。但是，由于目前杂交瘤技术制备的单克隆抗体都是鼠源抗体，应 用于人体时会产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，所以不能直接用于人体内的疾病治疗。因此必 须对单克隆抗体进行人源化改造，以减少和消除鼠源蛋白的免疫原性。最早用于单克隆抗体人源化改造的方法是构建嵌合抗体(Vaughan TJ, Osbourn JK, Tempest PR. (1998)Human antibodies by design. Nat. Biotechnol 6:535-539)。该 方法是将鼠源抗体的可变区和人抗体恒定区通过基因工程技术连接起来，即将鼠源抗体的 恒定区基因替换为人抗体恒定区基因，与抗原结合的可变区部分仍然是鼠源抗体。此方法 构建出的工程化嵌合抗体最大限度的保留了识别靶抗原能力的鼠源抗体可变区，同时又 拥有了人抗体所有的恒定区的免疫学杀伤效应，而且由于这种嵌合抗体的免疫原性相比 原始的鼠源抗体降低了 2/3，所以可以应用于人体治疗(Davis ΤΑ. (1999)Final report on the safety and efficacy of retreatment with rituximab for patients with
4non-Hodgkin，s lymphoma. Blood 94:88a)。但由于其分子中还保留了 1/3的鼠源部分，用 于长期临床治疗还有可能发生人抗鼠抗体反应。 因此，为了进一步降低嵌合抗体的免疫原性，需要对嵌合抗体的鼠源可变区进行 进一步的人源化改造，获得全人源化抗体。目前应用较多的全人源化方法是将鼠源抗体可 变区内参与抗原结合的部分与选择用于做模板的人抗体可变区的框架区重新拼接，使抗体 可变区中除高度可变的互补决定区(CDR)来源于鼠抗体外，其余部分都换成人源的。由于 抗体可变区中参与抗原结合的一般是其6个互补决定区(CDR)，故此过程也被称为“CDR移 植”，然后为了克服由于“CDR移植”可能导致的亲和力下降，需通过一系列对框架区残基的 突变，逐步恢复或提高抗体的抗原结合能力，从而得到人源化程度更高的重构抗体(Jones PT，Dear PH, Foote J. (1986)Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse，Riechmann L，Clark M，Waldmann H. (1988) Reshaping human antibodies for therapy, Chothia C， Lesk AM， Tramontano. (1989)A Conformat ions of immunoglobulin hypervariable regions)。已 艮道的构建重构抗体 的方法依照其人源化改造使用的模板的选择和回复抗体结合能力的方法，主要又可以分成 两种。其一，通过序列对比，以序列相似性为标准分别选择相似性最高的抗体轻链和重链可 变区的人源抗体为模板序列，在经过CDR移植后的轻、重链序列基础上，针对可能影响结合 能力的框架残基分别构建一系列突变体，鉴别合适的突变组合。这些突变体需各自独立制 备及测试其抗原结合能力，然后将较好的突变组合起来，即需要对各个可能的残基的突变、 筛选的重复循环实验，所以步骤繁复，效率低，效果不理想。其二，也是目前抗体人源化的一 种通用方法。具体的做法是，将非人源(例如鼠源)抗体的CDR移植于通用的人源抗体可 变区模板VL κ I-VHIII的构架上，通过对一组选定的关键框架区残基进行随机诱变，构建 抗体Fab的噬菌体文库，再通过噬菌体亲和力筛选鉴别出最佳框架序列。此方法相比第一 种可以更快速地获得优化的框架序列，并可在此基础上进一步提高抗体的抗原亲和力；但 是由于其选用的是通用模板，虽有普适性，但对不同抗体来讲可能不是最优的，另外通过构 建噬菌体库筛选高亲和力抗体的方法也比较复杂，费时费力。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白及其编码基因。本发明所提供的蛋白，是如下任一所述蛋白质a)由序列表中序列3中自N末端起第1_253位氨基酸序列组成的蛋白质；(Hl_2 VL+Linker+VH)b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(Hl-2 :VL+Linker+VH+Fc)c)将a)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸经过一个或几 个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；d)将b)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸和/或第 254-489位(Fe片段)氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的 具有相同功能的蛋白质；e)由序列表中序列1中自N末端起第1-253位氨基酸序列组成的蛋白质；(H1-1 VL+Linker+VH)
5
f)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(Hl-1 :VL+Linker+VH+Fc)g)将e)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸经过一个或几 个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；h)将f)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸和/或第 254-489位(Fc片段)氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的 具有相同功能的蛋白质；i)由序列表中序列5中自N末端起第1-253位氨基酸序列组成的蛋白质；(H1-V1 VL+Linker+VH)j)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(Hl-Vl :VL+Linker+VH+Fc)k)将i)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸经过一个或几 个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；1)将j)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸和/或第 254-489位(Fc片段)氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的 具有相同功能的蛋白质。所述编码基因为如下任一所述1)编码所述a)所示蛋白的编码基因为 起第1-759位核苷酸所示DNA分子；2)编码所述b)所示蛋白的编码基因为 子；3)编码所述e)所示蛋白的编码基因为 起第1-759位核苷酸所示DNA分子；4)编码所述f)所示蛋白的编码基因为 子；5)编码所述i)所示蛋白的编码基因为 起第1-759位核苷酸所示DNA分子；6)编码所述j)所示蛋白的编码基因为 子；7)在严格条件下与1)_6)任一限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；8)与1)-6)任一限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA 分子。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达 盒也属于本发明的保护范围。所述重组载体是在pSeCtag2A载体的多克隆位点插入所述编码基因得到的。本发明的另一个目的是提供一种抗体。本发明所提供的抗体，由两个相同的上述任一所述蛋白组成；所述两个相同的蛋 白通过二硫键连接。上述任一所述蛋白在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用也属于本发明的 保护范围。上述任一所述抗体在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用也属于本发明的核苷酸序列是序列表中序列4自5'末端 核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分 核苷酸序列是序列表中序列2自5'末端 核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分 核苷酸序列是序列表中序列6自5'末端 核苷酸序列是序列表中序列6所示DNA分保护范围。本发明的另一个目的是提供一种抗体的人源化改造的方法。本发明提供的抗体的人源化改造的方法包括如下步骤(1)、按照如下I或II所述方法选择得到人源化抗体模板I、选择重链可变区和轻链可变区分别与待改造抗体的重链可变区和轻链可变区 的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上的人源化抗体，将其作为预人源化抗体模 板；从所述预人源化抗体模板中选择与待改造抗体的可变区空间结构相似性值最高 的人源化抗体作为人源化抗体模板；II、选择满足如下i)和ii)所示条件的人源化抗体，将其作为预人源化抗体模 板；i)重链可变区和轻链可变区分别与待改造抗体的重链可变区和轻链可变区的氨 基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；ii)重链可变区的框架区和轻链可变区的框架区分别与待改造抗体的重链可变区 的框架区和轻链可变区的框架区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；从所述预人源化抗体模板中选择与待改造抗体的可变区空间结构相似性值最高 的人源化抗体作为人源化抗体模板；所述可变区空间结构为如下a)和/或b)所示a)重链可变区和轻链可变区一起 构成的空间结构；b)重链可变区中的框架区和轻链可变区中的框架区一起构成的空间结 构；未知空间结构的抗体，可通过软件模拟出其空间结构，包括重链可变区和轻链可 变区一起构成的空间结构，和重链可变区中的框架区和轻链可变区中的框架区一起构成的 空间结构。(2)、按照如下III或IV所示方法获得被置换后的人源化抗体模板III、用所述待改造抗体的重链可变区和轻链可变区中的至少一个⑶R氨基酸序 列置换所述人源化抗体模板中对应的CDR氨基酸序列，获得被置换后的人源化抗体模板；(未知⑶R区的抗体，可通过综合Kabat等人和Chothia等人的序列定义进行鉴 定，将两种方法鉴定结果的综合值作为最终值，即取两鉴定结果中的最小值至最大值区段 作为CDR区)。IV、用所述待改造抗体的抗原结合区氨基酸序列置换所述人源化抗体模板中对应 的抗原结合区氨基酸序列，获得被置换后的人源化抗体模板；(3)、将所述步骤(2)中的被置换后的人源化抗体模板作为改造后的目的人源化 抗体；(4)用基因工程方法表达得到所述改造后的目的人源化抗体。上述方法中，在所述步骤(2)后，所述步骤(3)前，包括如下回变步骤将所述步骤 (2)得到的抗体的框架区的至少一个氨基酸残基替换为所述待改造抗体中相应位置的氨基 酸残基，至得到的抗体空间结构稳定，将得到的抗体作为改造后的目的人源化抗体。(回变满足如下两个条件1)人源化程度高，2)使得到的抗体结构稳定；所述可变 区为重链可变区和/或轻链可变区；)
上述方法中，所述回变步骤中，被替换的氨基酸残基为影响步骤(2)得到的抗体 的CDR区结构稳定性或影响步骤(2)得到的抗体的抗原结合区结构稳定性的氨基酸残基；上述方法中，所述回变步骤中，被替换的氨基酸残基位于所述步骤(2)得到的抗 体的游标区和/或被替换的氨基酸残基位于所述步骤(2)得到的抗体的侧链中距离所述 CDR氨基酸残基3埃以内；上述方法中，在所述回变后，所述步骤(3)前，包括如下人源突变步骤将所述回 变得到的抗体的框架区内非人源的且不同于所述待改造抗体中相应位置氨基酸的氨基酸 残基突变为人源氨基酸残基，将得到的抗体作为改造后的目的人源化抗体。由上述任一所述方法得到的人源化抗体也属于本发明的保护范围。本发明的抗体是特异识别肿瘤表面抗原Pl85H 2/ertB_2的嵌合抗体ChA21的人源化 抗体变异体。本发明所提供的ChA21的人源化抗体变异体包括原嵌合抗体ChA21中鼠源的单链 抗体被完全人源化的scFv、铰链区和人源的Fc区。其中被人源化的scFv的氨基酸序列为DIVLTQSPDSLAVSLGERVTINC KSSQTLLYSNNQKNYLA WYQQKPGQSPKLLIS ffAFTRKSG VPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYC QQYSNYPffT FGAGTKLEIKR GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKAS GYSFTGYFIN ffVKQNPGQRLEfflGHISSSYATSTYNQKFKG KATLTVDTS ASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVR SGNYEEYAMDYffGQGTLVTVS.下划线部分分别为抗体的3个轻链和3个重链顺序排列的共6个互补决定区 (⑶Rs)，黑体部分为轻重链可变区之间的连接区(Linker)。本发明改造后的抗体构架未改变的最初的嵌合抗体相比，与抗原的亲和力相近， 并已经达到了完全的人源化，具有更好的临床应用前景。本发明的人源化抗体改造方法包括如下步骤基于目标抗体的可变区序列和结构信息的人源抗体模板的选择首先，将需人源化的目标抗体(ChA21)轻、重链可变区的序列分别通过 IgBLAST(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)进行序列相似性搜索，将轻、重链均有 较高相似性(大于50% )且有晶体结构的若干个人源抗体作为候选的人源化模板；再通过 分子叠合比较候选模板抗体和目标抗体框架区的结构相似性，选择结构相似度最高的一种 作为抗体人源化的模板。如果目标抗体没有晶体结构数据，可以通过同源模拟获得模拟分 子结构再进行比较。抗原结合区的移植首先，选择目标抗体的抗原结合区段。对于没有晶体结构数据的抗体，一般是选择 其互补决定区(⑶R)；(抗体的⑶R序列可以通过综合Kabat等人和Chothia等人的序列定 义加以鉴定)对于有抗体和抗原复合物晶体结构的抗体，可以综合CDR序列和结构数据获 得其抗原结合区域。然后，将选择的区段残基替换人源模板抗体相应位置上的残基，得到最初版本的 人源化抗P185/Her2抗体序列命名为为H1，并通过计算机同源模拟得到HI的模拟的空间结 构。框架区残基回复突变位点的选择基于模拟的HI结构，采用计算生物学方法，对一些重要的框架区残基进行突变方向的筛选。这些残基包括所有游标残基(Vernier)和所有侧链距离⑶R残基3埃以内的框 架区残基，选择更符合抗体结构稳定性的位点为需要突变的方向。具体到本例中，最初人源 抗体HI的轻链可变区VL的第4和49位残基以及重链可变区VH的第71和93位残基，被 选择需突变为目标抗体上的相应残基，即VL第4残基甲硫氨酸被亮氨酸取代，第49位残基 酪氨酸被丝氨酸取代；VH的第71残基丙氨酸被缬氨酸取代，第93位残基苏氨酸被缬氨酸 取代。由此获得人源化的抗P185/Her2抗体序列H1-1。根据改造后亲和力分析结果和进一 步提高人源化程度的需要，还可对一些CDR区以外的非抗原结合残基进行人化修饰，如具 体到本例子为H1-1中VL区的残基5、21和106以及VH区的残基61、62、80和91，则选择数 据库中人源抗体相应位置上出现频率较高的残基将它们分别替换，最终获得比最初版本人 源化程度更高的抗P185/Her2抗体序列H1-2。本发明所提供的方法与现有抗体人源化改造方法相比，有如下优点和特异性首先，本方法在人源化模板抗体的选择上，不同于以往方法分别选择与轻链和重 链相似的的两个人源模板序列，而是选择轻重链均与目标抗体有较高相似度的一种人源抗 体作为模版，且候选模板抗体尽量选择有晶体结构数据的，通过比较候选模版抗体和目标 抗体的整体结构的相似性，最终决定出模板抗体。这种将抗体的轻重链作为一个整体来考 虑，所选轻重链模板来自于同一个抗体，本身就是来自天然构架，相比以往人为组合轻重链 的方法更有利于轻重链框架区结构的稳定性，而且在选择框架区残基突变时，可以不用再 考虑是否需要突变轻重链界面残基来使轻重链相互作用更稳定的问题。其次，按结构相似性选择模板相比以往单纯的通过序列相似性筛选模板更具有结 构合理性。因为抗体与抗原的结合直接取决于抗体互补决定区的构象，而互补决定区又是 搭建于框架区所构建的平台之上的，所以人源模板与目标抗体的空间结构相似性越高越利 于移植后的互补决定区构象的维持，即越利于保持抗体结合抗原的能力。序列相似性虽然 在一定程度上可以代表结构相似性，但并不很精确。例如本发明实施例一中，具有最高序列 相似性的若干模板却不是结构相似性最好的。再次，在选择框架区残基突变时，结合抗体结构数据分析，可以直观迅速的作出应 突变位点的选择。根据结构稳定的需要来选择游标残基中的那些有可能影响CDR区结构的 残基以及决定其他一些位于抗体分子表面且可以进一步人源化的残基是否突变以及突变 的方向，将以往需要多轮突变筛选或是通过噬菌体库筛选突变的方式大大简化，将所有突 变选择集中在一起进行结构分析及其可行性，直接一步获得最终的突变方案。因此相比以 往方法，本方法更加简捷明确。最后，相比于现有人源化方法，本方法的改造效果也更高一些。通过本方法得到的 ChA21抗体人源化的版本H1-2具有与原始抗体相当的抗原结合活性，相对亲和力约为原始 抗体的93%左右。而已报道的通过通用抗体人化方法改造后的抗体的亲合力有高有低，水 平很不稳定(Carter P,Presta L, Gorman CM,Ridgway JB,Henner D,ffong WL, Rowland AM, Kotts C, Carver ME, Shepard HM. (1992)Humanization of an anti_pl85HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 89 :4285_4289,Presta LG,Chen H,0 Connor SJ, Chisholm V, Meng YG,Krummen L, Winkler M, Ferrara N, (1997)Humanization of an anti-VEGFmonoc1ona1 antibody for the therapy of solid tumors and other disorders, Cancer Res. 57 =4593-4599) 为直接比较本方法和通用方法的改造效果，在本发明实施例中同时应用通用人源化方法中的通用人源模板VL k I-VHIII对ChA21进行人源 化改造，得到ChA21的另一个人源化版本H2-1，通过亲和力测定发现H2-1的亲和力相比原 始抗体下降了一倍以上，说明就本例中的抗体ChA21而言，本发明中的人化方法的改造效 果明显好于现有其他方法。本领域已知有各种不同方法可用于表达和纯化人源化的抗体。如大肠杆菌表达系 统，操作简单快速，成本低，但是可溶性抗体表达量低(100ug/L)，表达产物不能正确修饰， 容易形成包含体，纯化困难，不同突变体克隆之间表达量差异很大，使下一步抗体亲和力的 测定受抗体浓度影响，不易判断；酵母表达系统，如PPIC9K载体，分泌表达，可用His-tag柱 纯化，纯化较方便，但需要构建稳定细胞株，周期长，表达量虽然比大肠杆菌系统高(一般 在mg/L级别)，但不同突变体克隆之间表达量差异也很大；而本发明中采用的293T真核瞬 时表达系统，以pSeCtag2A为载体，可分泌表达，产物可用His-tag柱或蛋白A柱纯化，因此 将设计好的人源化抗体的重组质粒DNA经脂质体瞬时转染293T细胞，表达产物能正确修 饰，纯化简单，表达量较高(3-10mg/L)，且不同突变体克隆之间表达量差异小，虽然花费相 对较高，但用此系统表达纯化的抗体性质测定结果明确、稳定。另外，应用ELISA法测定抗 体表达量和相对亲和力，结果准确，重复性好，且无需对表达上清进行纯化，便于快速鉴定 筛选出人源突变体。


图1为抗体ChA21轻链和重链的可变区氨基酸序列，序列编号依照Kabat规则排 序。下划线部分为综合Kabat和Chothia的序列定义划分出的互补决定区(⑶Rs)。图2为抗体ChA21的单链可变区(scFv，PDB号2GJJ)同选定的人源模板抗体 huCC49(PDB号1ZA6)的可变区的空间结构比对结果。图3为抗体ChA21的单链可变区与其识别抗原部分亚区的复合物结构。图4用于说明通过ChA21的抗原结合区移植获得的最初版本的人源化抗体HI的 氨基酸序列，以及同原始鼠源抗体和人源模板抗体的可变区一级序列比对。图5是通过计算机同源模拟得到的人源化抗体H1-1的分子模型。图6用于说明在人源化抗体HI序列及结构基础上进行一系列的框架区残基突变 的选择结果，以及和获得的新的人源化抗体变异体H1-1和H1-2的序列的比较。互补决定 区用方框标出。图7用于说明以基于通用模板VLK I-VHIII获得的人源化抗体hu4D5 (PDB号 1FVC)为人源模板对ChA21进行人源化改造，以及获得的人源化抗体H2-1的氨基酸序列。图8为人源化抗体H1-1和H1-2重组表达载体的构建示意图。图9为抗体ChA21和其各种人源化突变体的抗原结合曲线。将各种转染的293T 细胞的上清中的抗体的起始浓度都配制成lug/ml，再通过ELISA检测各种突变体与抗原的 结合曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
10
实施例1、嵌合抗体chA21的人源化改造嵌合抗体chA21的序列早已由L. S. Cheng等人描述(Chen L. S.，Liu A. P.，Liu. J. Construction, expression and characterization of the engineered antibody against tumor surface antigen P185c*2. Cell Res. 2003，13 :35_48)，如图 1 所示。嵌 合抗体chA21的结构两条相同的蛋白链通过在Fc区形成的二硫键结合。每条蛋白链依次 由轻链可变区(VJ、linker、重链可变区(VH)和Fc区依次连接组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO :9 所示，其中，第 1-114 位为 Vl，第 115-134 位为 linker，第 135-253 位为 VH，第 254-489 位为Fc。一、人源抗体模板的选择序列相似性比对将chA21的轻链可变区与人源化抗体的轻链可变区进行氨基酸 序列相似性比对，将chA21的重链可变区与人源化抗体的重链可变区进行氨基酸序列相似 性比对。通过 IgBLAST(http://www.ncbi. nlm.nih. gov/igblast/)在蛋白数据库(PDB, Protein Data Bank)中分别进行序列相似性搜索。具体选择搜索参数如下程序blastp ； 提交序列来源m0USe ；数据库pdb ；比对序列来源human。显示比对结果的数量可以根据 比对结果来具体选择，其他参数可选择默认参数。在搜索的结果中，选择与轻、重链均有较高序列相似性的抗体作为候选人源化抗 体模板，一般选择相似性在50%以上作为选择阈值，也可以根据具体的搜索结果选择不同 的阈值。在ChA21的比对结果中，由于序列相似性高于50%的候选模板太多，所以提高选择 阈值，选择两条链相似性均高于60%的抗体作为候选人源化抗体模板；结构相似性比对再应用PyMOL软件通过分子叠合(align)比较候选人源化抗体 模板和ChA21的可变区(scFv，PDB号2GJJ)的整体空间结构相似性(即蛋白中重链可变 区和轻链可变区一起组成的空间结构)和框架区空间结构相似性(即蛋白中重链可变区中 框架区和轻链可变区中框架区一起组成的空间结构)(由RMS表示其结构间差异的大小)， 各候选模板的序列比对和空间结构比对结果见表1 (所有表中的序列编号均采用Kabat序 列编号)。选择结构相似度最高的huCC49(PDB :1ZA6)(表中看应该是最低)作为嵌合抗体 ChA21人源化的模板，两抗体空间结构的比对见图2。其中模板1FVC是抗体4D5基于通用人源抗体模板VL k I-VHIII进行人源改造而 获得的已经人源化的抗体hu4D5，其框架区序列与VLk I-VHIII基本一致，基于此通用模板 结构对ChA21同时进行人源化改造，用以比较本发明方法和通用方法的人化改造效果。表1、ChA21可变区与各候选模板序列和结构相似性比对 二、抗原结合区的移植选择ChA21的抗原结合区段。抗体ChA21的⑶R序列可以通过结合Kabat等人和 Chothia等人的序列定义加以鉴定，CDR序列划分结果见表2。最终划定的各CDR区为图1 中带下划线的区段。表2、ChA21的互补决定区(⑶R)序列划分结果 由于抗体ChA21的单链可变区与其识别抗原部分亚区的复合物晶体结构数据已 经获得解析，其抗原结合区段可以直观地从复合物结构上获得，如图3所示。可以看出重 链CDR2的后半段位于抗体分子的表面，既不参与抗原结合，对其他CDR区结构也没有影 响，也不参与抗体轻重链之间的相互作用，所以从提高序列人源化程度的要求考虑，将其 作为非抗原结合区，而不移植ChA21的重链⑶R2上的此段序列。将其余⑶R区域的残基 替换抗体huCC49 (1ZA6)相应位置上的CDR区域的残基，得到最初版本的人源化抗体序列 HI (序列比较结果见图4)，并应用蛋白结构模拟软件MODELLER通过同源模拟得到其模拟的 空间结构。(表3中给出的H3为H95-H102，此序列编号为Kabat序号，而非序列实际顺序 编号，如图1中所标识的⑶R区H3序列为H95-H102 (SGNYEEYAMDY)，相对图4中其位置为 101-111 (SGNYEEYAMDY)这一段。)三、HI框架区残基的突变选择(回变)基于最初版本人源化抗体HI的模拟的空间结构，对一些重要的框架区残基进行 突变方向的筛选首先考虑的一类残基是可能影响互补决定区构象或结构的残基，或是可能直接影响抗原结合的残基，根据之前对于此类框架残基的研究，列出此类残基的清单 (见表3)，这些残基包括近30多种对⑶R结构有潜在贡献的游标残基(Vernier)；另外，在 模拟的HI结构中选择所有侧链距离CDR残基3埃以内的残基，从结构角度考虑这些残基也 可能直接影响CDR区残基的构象，而且它们恰好都包括在表3所列的游标残基之中。通常需 要将这些残基全部突变为原始抗体ChA21的相应位点的残基，称为“回变”，但这样做有可 能会因为添加了非人源序列的元件而导致免疫原性增大的危险，因此，在对游标残基的回 变选择过程中，可保留一些侧链位于抗体分子表面的游标残基，同时对于回变之后可能会 导致回变的残基与其周围残基发生结构冲突的残基也应选择不回变，例如H69Leu- > Phe。 通过选择回变得到人源化序列H1-1，其模拟结构如图5所示。表3、游标残基突变选择
游标残基人源模板残基鼠源ChA21残基人源化Hl-1序列L2lielielieL4MetLeuLeuL35TrpTrpTrpL36TyrTyrTyrL46LeuLeuLeuL47LeuLeuLeuL48lielielieL49TyrSerSerL64GlyGlyGlyL66GlyGlyGlyL68GlyGlyGlyL69ThrThrThrL71PhePhePheL98PhePhePheH2ValValValH47TrpTrpTrp
13H48lielielieH49GlyGlyGlyH67AlaAlaAlaH69LeuPheLeuH71AlaValValH73ThrThrThrH78AlaAlaAlaH93ThrValValH94ArgArgArgH103TrpTrpTrp四、人源突变再对一些非抗原结合残基进行人化修饰。因为所选人源模板抗体huCC49为已经 人源化的抗体，其框架序列上也存在一些其人源化过程中回变为亲代鼠源抗体的残基，这 些残基包含一些鼠源抗体共有的残基和一些huCC49亲代鼠源抗体mCC49特有的残基，而后 者对于其他鼠源抗体来讲不是必要的，因此从提高人源化程度的角度看，在不影响结构稳 定的基础上，需要将这些残基突变为相应的人源残基。具体到H1-1的序列中，通过序列比 对，找到框架序列中既不同于ChA21也不同于人源化抗体huCC49的人源模板序列(huCC49 轻链模板序列LEN和huCC49重链模板序列21/28’CL)的位点，它们是VL中的残基5、21和 106以及VH中的残基61、62、80和91，选择突变为人源模板序列LEN和21/28，CL相应位置 上的残基(见表4)。最终获得人源化序列H1-2，所有序列的比对结果见图6。表4、非抗原结合序列人化改造
序列轻链VL重链Vh名称L5L21L106H61H62H80H91Hl-1SerLeuLeuGluArgValPheChA21ThrMetlieGinLysMetTyrLEN 21/28， CLThrlielieGinLysMetTyrHl-2ThrlielieGinLysMetTyr 另外，以人源化抗体hu4D5(PDB :1FVC，通常被视为通用模板)为模板，通过相同方 法获得人源化序列H2-1 (图7)，该人源化的抗体作为对照，与本发明中人源化模板选择方
14法得到的人源抗体相互比较对抗体亲和力的影响。图7中，hu4D5为人源化模板(即通用 模板)，H2为⑶R置换后得到的抗体(置换方法与上述步骤二中一致)，HumanVL-KappaI为 抗体hu4D5的轻链可变区对应的人源序列，HumanVH-III为抗体hu4D5的重链可变区对应 的人源序列，H2-1为最终人源化后的序列。实施例2、各种抗体的表达载体构建一、pSectag2A_dFc 载体构建pSectag2A载体购自Invitrogen公司。利用PCR扩增Fc片段，设计引物在Fc片 段N端和C端分别加入EcoRI和Xhol酶切位点，然后将Fc片段用EcoRI和Xhol双酶切，回 收双酶切后片段；同时将pSeCtag2A质粒用EcoRI和Xhol进行双酶切，回收双酶切后片段； 将双酶切后的Fc片段和pSectag2A载体用T4-DNA连接酶连接，将连接产物转化入ToplO 感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定和测序验证，结果，pSeCtag2A的EcoRI和Xhol酶切 位点间插入的基因序列如SEQ ID NO 2中第760-1470位核苷酸所示(即Fc片段)，表明 构建的重组载体正确，将此载体记作pSectag2A-dFc，作为人源化抗体的表达载体。以scFv-Fc/pEE14(中国专利CN1613873)为模板，用如下引物，PCR扩增，得到Fc 片段。或者人工合成SEQ ID NO 2中第760-1470位核苷酸所示的Fc片段。dFc-EcoRI 5，-AATGAATTCGCGGCCGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAA-3‘(下划线为 EcoRI 和 NotI 位点)dFc-XhoI :5，-TTTCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3'(下划线为 Xhol 位点)二、人源化抗体H1-1重组表达载体的构建人工合成SEQ ID NO 2中第1-759位核苷酸所示基因(即VL+Linker+VH)，导入 载体pMD-19T(由大连宝生物合成)，命名为PMD-19T-H1-1。以pMD_19T-Hl_l为模板，在 引物 PO(PHl-Sfil) :5，-ATATGGCCCAGCCGGCCGACATCGTTTTGTCTCAATCTCCAGACTCTTTG-3，和 P7 (Hl-Rv-Notl) 5，-ATATGCGGCCGCAGAAACAGTAACCAAAGTACC-3，的引导下进行 PCR 扩增，对 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的条带，命名为“H1-1”。用限制性内切 酶Sfil和Not I对获得的H1-1基因片段分别进行单酶切，再将酶切片段分别与经相同酶 酶切的质粒pSectag2A-dFc用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌ToplO或 DH5 a感受态细胞，筛选阳性重组子，抽提质粒DNA，测序，结果在pSectag2A-dFc的Sfil和 Not I位点间插入的基因序列如SEQ IDN0 2中第1-759位核苷酸所示。将阳性重组质粒命 名为pSectag2A-dFc-Hl-l。该重组载体中含有SEQ ID NO :2所示基因，该基因中第1-342 位是\，第343-402位是Linker，第403-759位是VH，第760-1470位是Fc ；该基因编码的蛋 白如SEQ ID NO :1所示，该蛋白中第1-114位是Vl，第115-134位是Linker，第135-253位 是乂11，第 254-489 位是 Fc。三、人源化抗体H1-2重组表达载体的构建(一)表达H1-V1的重组载体构建在得到的H1-1的基因序列基础上通过点突变的方法获得H1-2的编码序列。具体 方法如图8所示，分两轮点突变进行，先对H1-1进行第一轮点突变获得H1-V1中间突变体， 再对H1-V1进行第二轮点突变获得H1-2的序列。对人源化抗体H1-1的突变位点如表5所示表5、人源化抗体H1-V1基因的突变位点表位点L5L21L106H80H91H1-1S(TCT)L (TTG)L (TTG)V (GTT)F (TTC)H1-V1T (ACT)I (ATT)I (ATT)M(ATG)Y (TAC)采用定点突变法分三段扩增带有上述突变位点的序列，然后用搭桥PCR法，扩增 得到人源化抗体H1-V1编码基因序列，具体方法包括以下步骤1)人源化抗体H1-V1编码基因的5’端序列的扩增以 pMD-19T-Hl-l 为模板，在引物 P2 (P5T_21I_Fw) 5，-ACTCAATCTCCAGACTCTTTGGC TGTTTCTTTGGGTGAAAGAGTTACTATTAACTGT-3’和P3 (P112I-Rv) :5，-CTAAGTTGGAAATTAAGAGAGG TGGTGG-3’的引导下进行PCR扩增，回收目的条带，命名为“H1-V1-5’ ”。2)人源化抗体H1-V1编码基因的中间段序列的扩增以 pMD-19T-Hl 为模板，在引物 P4 (P112I_Fw) 5，-CTAAGTTGGAAATTAAGAGAGGTGGTG G-3，和 P5(P215M-RV) :5，-GTCTTCCGATCTCAAAGAAGACAATTCCATGTAAGCAG-3，的引导下进行 PCR扩增，回收目的条带，命名为“Hl-Vl-m”。3)人源化抗体H1-V1编码基因的3’端序列的扩增以 pMD-19T-Hl 为模板，在引物 P6 (P229Y_Fw) 5，-GTCTTCTTTGAGATCGGAAGACACTGC TGTTTACTACTGTG-3，和 P7(Hl-Rv-Notl) :5， -ATATGCGGCCGCAGAAACAGTAACCAAAGTACC-3，的 引导下进行PCR扩增，回收目的条带，命名为“H1-V1-3’ ”。4)人源化抗体H1-V1编码基因的获得以步骤1)扩增的H1-V1-5’、步骤2)扩增的Hl-Vl-m和步骤3)扩增的H1_V1_3’ 基因这三个片断为模板在引物PI (P5T-Sfil) :ATATGGCCCAGCCGGCCGACATCGTTTTGACTCAATCTCCAGACTCTTTG和P7的引导下进行搭桥PCR扩增，回收目的条 带，命名为“H1-V1”5)人源化抗体H1-V1编码基因的表达载体的获得用限制性内切酶Sfil和NotI对步骤4)获得的H1-V1基因片段分别进行单酶切， 再将酶切片段分别与经相同酶双酶切的质粒pSectag2A-dFc连接，将连接产物转化大肠杆 菌ToplO感受态细胞，筛选阳性重组子，抽提质粒DNA，测序，结果在pSectag2A-dFc的Sfil 和NotI位点间插入的基因序列如SEQ ID NO 6中第1-759位核苷酸所示。将阳性重组质 粒命名为pSeCtag2A-dFC-Hl-Vl。该重组载体中含有SEQ ID NO :6所示基因，该基因中第 1-342位是\，第343-402位是Linker，第403-759位是VH，第760-1470位是Fc ；该基因 编码的蛋白如SEQ ID NO :5所示，该蛋白中第1-114位是八，第115-134位是Linker，第 135-253 位是 VH，第 254-489 位是 Fc。(二)表达H1-2的重组表达载体的构建对人源化抗体H1-V1的以下位点进行突变得到H1-2，突变位点如(表6)所示表6人源化抗体H1-2的突变位点位点H61H62H1-V1E(GAA)R(AGA)H1-2Q(CAA)K(AAA)采用定点突变法扩增带有上述突变位点的人源化抗体H1-2编码基因，具体方法 包括以下步骤1)人源化抗体H1-2编码基因的5’端序列的扩增以 pSectag2A-dFc-Hl-Vl 为模板，在引物 PI 和 P8(Hl_2_Rv) 5，-GCCTTACCCTTGAA TTTTTGGTTGTAAGTAGAAG-3，的引导下进行PCR扩增，回收目的条带，命名为“H1-2-5，，，。2)人源化抗体H1-2编码基因的3’端序列的扩增以 pSectag2A-dFc-Hl-Vl 为模板，在引物 P9 (Hl-2-Fw) 5，-CTTCTACTTACAACCAAAA ATTCAAGGGTAAGGC-3’和P7 的引导下进行PCR扩增，回收目的条带，命名为“H1-2-3’ ”。3)人源化抗体H1-2编码基因的获得以步骤1)扩增的H1-2-5’和步骤2)扩增的H1-2-3’基因片断为模板在引物P1 和P7的引导下进行PCR扩增，回收目的条带，命名为“H1-2 ”。4)人源化抗体H1-2编码基因的表达载体的获得用限制性内切酶Sfil和NotI对步骤3)获得的H1-2基因片段分别进行单酶切，再 将酶切片段分别与经相同酶双酶切的质粒pSectag2A-dFc连接，将连接产物转化大肠杆菌 ToplO感受态细胞，筛选阳性重组子，抽提质粒DNA，测序，结果在pSectag2A-dFc的Sfil和 NotI位点间插入的基因序列如SEQ ID NO 4中第1-759位核苷酸所示。将阳性重组质粒命 名为pSectag2A-dFc-Hl-2。该重组载体中含有SEQ ID NO :4所示基因，该基因中第1-342 位是\，第343-402位是Linker，第403-759位是VH，第760-1470位是Fc ；该基因编码的蛋 白如SEQ ID NO :3所示，该蛋白中第1-114位是八，第115-134位是Linker，第135-253位 是乂11，第 254-489 位是 Fc。四、人源化抗体H2-1重组表达载体的构建合成SEQ ID N0:8中自5'末端起第1_759位核苷酸所示基因，并导入载体 PMD-19T，测序验证，将阳性重组子命名为pMD-19T-H2-l。以pMD_19T-H2_l为模板，在引 物 P10(PH2-Sfil) :5’ -ATAT GGCC CAGCC GGCC GACATCCAATTGACTCAATCTCCATCTTCTTTG-3’ 和 P7 (Hl-Rv-Notl) :5，-ATATGCGGCCGCAGAAACAGTAACCAAAGTACC-3，的引导下进行 PCR 扩 增，回收目的条带，命名为“H2-1”。用限制性内切酶Sfil和NotI对获得的H2-1基因片 段分别进行单酶切，再将酶切片段分别与经相同酶双酶切的质粒pSeCtag2A-dFC连接，得 到的阳性重组质粒，测序验证，结果在pSectag2A-dFc的Sfil和NotI位点间插入的基 因序列如SEQ ID NO :8中自5'末端起第1-759位核苷酸所示，将阳性重组质粒命名为 pSectag2A-dFc-H2-l。该重组载体中含有SEQ ID NO :8所示基因，该基因中第1-342位是 \，第343-402位是Linker，第403-759位是VH，第760-1470位是Fc ；该基因编码的蛋白如 SEQ ID NO :7所示，该蛋白中第1-114位是八，第115-134位是Linker，第135-253位是VH， 第 254-489 位是 Fc。
17
五、嵌合抗体ChA21重组表达载体的构建嵌合抗体ChA21的表达载体的构建方法与中国专利CN1613873中所述一致。实施例3、瞬转293T细胞表达人源化抗体及表达产物的纯化(一)抗体111-1、111-2、112-1、11141、0^21 的表达和纯化293T细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-11268。DMEM培养基购自GIBC0，产品目录号为11960。提前培养足够量的293T细胞(DMEM/10%血清双抗)(双抗为青霉素和链霉 素，购自上海生工，货号BS732)，当细胞达到80%左右满度，处于对数生长期时被用于转染 重组抗体质粒DNA。转染步骤如下(1)在lml DMEM中加入20ul Lipofectamine 2000，用手指弹勻或 枪头混勻，室温静置5分钟。(2)然后在lml DMEM中加入10ug准备好转染用的质粒DNA，混 勻。(3)将(1)和(2)混合(需要转到一个4ml离心管)，混勻，室温静置20-30分钟(混 合物需要在1小时内做完转染)；(4)在20-30分钟等待时间，将293T细胞培养基吸掉，加 入5-8ml PBS洗涤细胞一遍(尽量除去残余PBS)，然后加入8ml DMEM，备用；(5)将(3)的 混合液加入(4)中，轻轻晃动培养瓶混勻，并置于培养箱中培养过夜。转染时间一般为8-16 小时。转染16小时后换新鲜的DMEM培养基(加入双抗防止染菌)。每两天收集 一次培养上清，上清用3000rpm离心10分钟，收集上清，置于4°C ( 一星期内使用)或 者-80°C (长期)保存。上清中含有抗体111-1、111-2、112-1、11141或0^21。(二)CH0表达并纯化的ChA21嵌合抗体(ChA21_CH0)的方法CH0表达并纯化的ChA21嵌合抗体(ChA21_CH0)的方法与中国专利CN1613873中
所述一致。抗体ChA21与抗体ChA21-CH0的序列无差别，不同的是抗体ChA21是由293T细胞 表达出来的，抗体ChA21-CH0是由CH0-GS工程细胞株表达出来的。实施例4、ChA21抗体的人源化突变体的亲和活性的测定一、相对亲和活性测定选择ELISA法测抗体相对亲和活性。ELISA法测抗体相对亲和活性步骤如下兔抗人Fc多抗购自Sigma，产品目录号为A9544。抗原GST-EPI的制备方法如下I. GST-EPI 质粒构建人工合成Her2胞外I-II区基因(SEQ ID N0:10)。将合成基因使用EcoR 1(购 自Promega，货号R6011)和Xho I (购自Promega，货号R6161)进行双酶切，连接到经同样 酶切的PGEX/4T-1 (购自GE Healthcare，货号27-4580-01)载体后，挑克隆双酶切鉴定后和 测序鉴定，结果在PGEX/4T-1的EcoR I和Xho I酶切位点间插入的基因序列如SEQ ID NO 10中第1-603位核苷酸所示，测序正确的克隆命名为PGEX/4T-1-EPI。II. GST-EP I的原核表达与纯化将pGEX/4T-l-EPI 转化至 Origami B 感受态(购自 novagen，货号 71408-3)，挑选 阳性表达克隆。将阳性克隆进行扩大培养，待培养瓶中的菌液0D600值达到约0. 6左右后，加入IPTG (购自Merch，货号420291-5GM)至终浓度为ImM进行诱导表达，16°C，220rpm继 续培养20h ；5000g, 10min，4°C离心收菌，液压破碎后以16000g，20min，4°C离心收集裂解液 上清；用GSTrap FF(购自GE Healthcare，货号17-5131-02)纯化裂解上清中GST-EP I，脱 盐后放于-80°C冻存备用。1)确定瞬时转染的抗体突变体的表达量兔抗人Fc多抗稀释于NaHC03水溶液中 (终浓度约lug/ml)铺ELISA板，4°C冰箱过夜或者37°C烘箱2_3小时；5%脱脂奶粉溶于 TPBS，37°C封闭1小时；加入不同浓度稀释的标准抗体和各293T表达上清，室温震荡温育1 小时。对标准抗体(ChA21-CH0)将CH0表达并纯化的ChA21嵌合抗体(ChA21_CH0)，先用 DMEM培养基稀释到lug/ml，然后用封闭剂依次稀释到100，50，25，12. 5,6. 25，3. 13，1. 56， 0. 78ng/ml，总共8个浓度，用作标准曲线；对表达上清直接用封闭剂稀释10，40，160，640 倍。加入1 2000稀释的羊抗人/HRP 二抗，室温震荡温育1小时，0PD底物显色，硫酸终 止。根据标准曲线，计算每个突变体抗体表达量。2)测定人源化抗体突变体的相对亲和力这里使用的抗原为GST-EPI，EPI即膜 抗原ErbB2胞外I/II区，它包含了 ChA21及其人源化突变体的识别表位，以GST融合蛋白 形式表达的EPI可代替全抗原ErbB2用于抗体变异体的亲和力测定。GST-EPI (lmg/ml储 液)，以1 4000稀释于NaHC03水溶液中(终浓度约0. 25ug/ml)铺ELISA板，4°C冰箱过 夜或者37°C烘箱2-3小时；5%脱脂奶粉溶于TPBS，37°C封闭1小时；加入不同浓度稀释 的标准抗体(ChA21-CH0)和突变体转染293T的表达上清，室温震荡温育1小时。标准抗 体(ChA21-CH0)和突变体表达上清用封闭剂稀释到1000，333，111，37，12. 33，4. 11，1.37， 0. 46ng/ml。加入1 2000稀释的羊抗人/HRP 二抗，室温震荡温育1小时。0PD底物显色， 硫酸终止。根据曲线计算每个突变体EC50值，原始标准抗体与突变体的EC50值的比值即 为突变体的相对亲和力。原始抗体和各人源突变体的抗原结合曲线如图9所示，以293T表达的原始ChA21 嵌合抗体(抗体ChA21)活性作为对照，计算出人源化突变体Hl-1、Hl-Vl、H1-2和H2-1的 相对亲和力分别为0. 95,0. 92、0. 93、0. 4。结果表明以抗体huCC49为模板进行人源化改造 获得的人源化突变体H1-1、H1-V1、H1_2基本维持了 ChA21的抗原结合能力，而基于通用人 化模板进行人源化改造获得的人源化突变体H2-1的抗原结合能力降低了一倍以上。该实 验也表明在293T细胞表达的ChA21嵌合抗体(抗体ChA21)与在CH0-GS工程细胞株表达 的抗体(抗体ChA21-CH0)具有相当的亲和力。二、表面胞质团共振法测突变体H1-2的结合常数KdHer2 % Recombinant Human ErbB2/Fc Chimera，_ 自 R and D Systems,^ 号 1129-ER禾lj 用 Biacore 3000 (Malmqvist M. (1999) BIACORE :an affinity biosensor system for characterization of biomolecular interactions. Biochem Soc Trans. Feb ；27 (2) 335-40)测人源化抗体Hl_2与抗原的绝对亲和力。选用CM_5传感片，表面吸附 羧甲基葡聚糖。两个流通池(pathway)均以15iil/min的流速活化6min，将2 y g抗原Her2 溶于50iU pH7.0的磷酸溶液，以lOiU/min的流速注入芯片流通池1，其表面密度约为10K Ru，抗原标记后再用1M乙醇胺将芯片表面封闭。结合条件各检测抗体原液浓度为10mg/ ml，依次稀释成 200 u g/ml，100 u g/ml，50 u g/ml，25 u g/ml ,12u g/ml，0 u g/ml，以 10 yl/min的速度注入芯片的两个流通池，上样3min ；解离条件流速10 yl/min，解离3min。芯片 再生条件10mM NaOH, 1M NaCl。用Biacore evaluation软件分析抗体亲和常数KD。
经计算，H1-2抗体亲和常数KD = 10_8M。
权利要求
一种蛋白，是如下任一所述蛋白质a)由序列表中序列3中自N末端起第1 253位氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)将a)限定的蛋白中自其N末端起第115 134位氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；d)将b)限定的蛋白中自其N末端起第115 134位氨基酸和/或第254 489位氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；e)由序列表中序列1中自N末端起第1 253位氨基酸序列组成的蛋白质；f)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；g)将e)限定的蛋白中自其N末端起第115 134位氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；h)将f)限定的蛋白中自其N末端起第115 134位氨基酸和/或第254 489位氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；i)由序列表中序列5中自N末端起第1 253位氨基酸序列组成的蛋白质；j)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；k)将i)限定的蛋白中自其N末端起第115 134位氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；l)将j)限定的蛋白中自其N末端起第115 134位氨基酸和/或第254 489位氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下任一所述1)编码所述a)所示蛋白的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列4自5'末端起第 1-759位核苷酸所示DNA分子；2)编码所述b)所示蛋白的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分子；3)编码所述e)所示蛋白的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列2自5'末端起第 1-759位核苷酸所示DNA分子；4)编码所述f)所示蛋白的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；5)编码所述i)所示蛋白的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列6自5'末端起第 1-759位核苷酸所示DNA分子；6)编码所述j)所示蛋白的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列6所示DNA分子；7)在严格条件下与1)_6)任一限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；8)与1)_6)任一限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或 表达盒；和/或，所述重组载体是在pSectag2A载体的多克隆位点插入所述编码基因得到的。
5.一种抗体，由两个相同的权利要求1中所述蛋白组成；所述两个相同的蛋白通过二 硫键连接。
6.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述编码基因或权利要求5中所述抗体在制 备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
7.抗体的人源化改造的方法，包括如下步骤(1)、按照如下I或II所述方法选择得到人源化抗体模板I、选择重链可变区和轻链可变区分别与待改造抗体的重链可变区和轻链可变区的氨 基酸序列相似性均在50%以上或60%以上的人源化抗体，将其作为预人源化抗体模板；从所述预人源化抗体模板中选择与待改造抗体的可变区空间结构相似性值最高的人 源化抗体作为人源化抗体模板；II、选择满足如下i)和ii)所示条件的人源化抗体，将其作为预人源化抗体模板；i)重链可变区和轻链可变区分别与待改造抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸 序列相似性均在50%以上或60%以上； )重链可变区的框架区和轻链可变区的框架区分别与待改造抗体的重链可变区的框 架区和轻链可变区的框架区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；从所述预人源化抗体模板中选择与待改造抗体的可变区空间结构相似性值最高的人 源化抗体作为人源化抗体模板；所述可变区空间结构为如下a)和/或b)所示a)重链可变区和轻链可变区一起构成 的空间结构；b)重链可变区中的框架区和轻链可变区中的框架区一起构成的空间结构；(2)、按照如下III或IV所示方法获得被置换后的人源化抗体模板III、用所述待改造抗体的重链可变区和轻链可变区中的至少一个CDR氨基酸序列置 换所述人源化抗体模板中对应的CDR氨基酸序列，获得被置换后的人源化抗体模板；IV、用所述待改造抗体的抗原结合区氨基酸序列置换所述人源化抗体模板中对应的抗 原结合区氨基酸序列，获得被置换后的人源化抗体模板；(3)、将所述步骤(2)中的被置换后的人源化抗体模板作为改造后的目的人源化抗体；(4)用基因工程方法表达得到所述改造后的目的人源化抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述步骤(2)后，所述步 骤(3)前，包括如下回变步骤将所述步骤(2)得到的抗体的框架区的至少一个氨基酸残基 替换为所述待改造抗体中相应位置的氨基酸残基，至得到的抗体空间结构稳定，将得到的 抗体作为改造后的目的人源化抗体。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述回变步骤中，被替换的氨基酸残 基为影响步骤⑵得到的抗体的CDR区结构稳定性或影响步骤⑵得到的抗体的抗原结合 区结构稳定性的氨基酸残基；和/或，所述回变步骤中，被替换的氨基酸残基位于所述步骤(2)得到的抗体的游标区 和/或被替换的氨基酸残基位于所述步骤(2)得到的抗体的侧链中距离所述CDR氨基酸残 基3埃以内；和/或，所述方法中，在所述回变后，所述步骤(3)前，包括如下人源突变步骤将所述 回变得到的抗体的框架区内非人源的且不同于所述待改造抗体中相应位置氨基酸的氨基 酸残基突变为人源氨基酸残基，将得到的抗体作为改造后的目的人源化抗体。
10.由权利要求7-9中任一所述方法得到的人源化抗体。
全文摘要
本发明公开了一种人源化抗体及其人源化改造方法。该抗体是如下任一所述蛋白质a)由序列表中序列3中自N末端起第1-253位氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明改造后的抗体构架未改变的最初的嵌合抗体相比，与抗原的亲和力相近，并已经达到了完全的人源化，具有更好的临床应用前景。
文档编号C12N1/21GK101928345SQ20101021155
公开日2010年12月29日 申请日期2010年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者刘兢, 常亮, 肖卫华, 胡思怡, 郭雨刚 申请人:中国科学技术大学