专利名称：一种重组人胰激肽原酶的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种重组人胰激肽原酶及其新的制备方法。更具体地说，本发明涉及 利用分子生物学技术获得表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞，用大规模细胞培养或发酵方 法生产宿主细胞，从细胞中或细胞外分泌物中使用亲和层析方法提取重组人胰激肽原酶， 该重组人胰激肽原酶的糖链结构组成比人尿中提取的天然蛋白更为复杂，在临床上具有多 种用途，具有更小的副作用。
背景技术：
人激肽原酶基因是一类大的多基因家族，至少由15个基因(KLK1-KLK15)组成。但 只有胰/肾激肽原酶基因(KLK1基因)编码的蛋白具有激肽原酶活性，其它家族成员几乎 都没有激肽原酶活性。人胰激肽原酶能作用于激肽原底物，使之释放出具有生物活性的激 肽，激肽与靶器官上特定受体结合能产生一系列生物效应，如扩张血管增加血流量、改善血 液循环的作用，并且还有增加红细胞的变形性和抑制血小板聚集、延长再钙化时间改善血 液粘稠的作用。目前已上市的人尿来源的激肽原酶产品，即人尿激肽原酶，是从人尿中提取的糖 蛋白。其氨基酸组成与人胰激肽原酶的氨基酸序列相同，但是，从人尿中提取的激肽原酶蛋 白的162位点上存在Glu/Lys两种氨基酸，这种氨基酸的多态性对酶活性的影响未知。临 床上使用人尿激肽原酶发现静脉滴注过快会导致患者血压急剧下降等不良副作用，给病人 带来了一定风险。另外，人尿收集困难，人尿蛋白资源十分有限。其来源范围越广，成分越 复杂，可能含有病毒等成分。同时欧美等高端市场普遍不接受人尿来源产品。分子生物学技术的发展使得利用宿主细胞表达并大规模生产重组蛋白成为可 能，目前利用基因表达方法生产重组蛋白已代替了传统的从自然资源中提取天然蛋白方 法。对于糖蛋白，一般是将编码糖蛋白的基因转入哺乳动物细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞 (Chinese Hamster Ovary，CH0)，以生产与天然蛋白接近并具有生物活性的重组蛋白。KLKl基因位于染色体19ql3. 4，其大小为6. 55kb，编码区为874bp。KLKl全长基因 编码262个氨基酸组成的激肽酶原(即前体蛋白)，包括17个氨基酸信号蛋白，7个氨基酸 酶原片段和238个氨基酸成熟蛋白。激肽酶原在体内进一步被蛋白酶切割和加工成为具有 生物活性的成熟人胰激肽原酶。KLKl基因在胰腺、肾脏和唾液腺表达最高。人胰激肽原酶是一种糖蛋白，分子中含有14. 4%的糖，其结构中包括三个N糖基 化位点，分别位于Asn78，Asn84及Asnl41。研究表明，人胰激肽原酶在CHO细胞中表达时， CHO大规模培养条件影响其糖基化程度，进而也影响到其体内的活性。因此，选择适当的 CHO培养条件，制备活性相似、副作用小的人胰激肽原酶成为科研者的最新攻克难题。
发明内容
本发明通过分子生物学技术克隆KLKl基因，将该基因转入宿主细胞进行表达，并 用细胞培养或发酵方法大量生产含有重组蛋白的细胞，从细胞或胞外分泌液中提取重组人胰激肽原酶。优选，利用大规模培养CHO细胞制备重组人胰激肽原酶。该重组人胰激肽原 酶在临床上有多种用途，与人尿来源的激肽原酶相比活性相似、副作用小，尤其是对血压下 降影响更小的特点。本发明的一个目的是通过细胞培养或发酵方法获得一种重组人胰激肽原酶。具体 说，本发明是利用分子生物学技术克隆KLKl基因并获得表达重组人胰激肽原酶的宿主细 胞；利用大规模细胞培养或发酵方法进行表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞的大量生产， 采用亲和层析方法纯化获得重组人胰激肽原酶。本发明的另一个目的是重组人胰激肽原酶用于制备治疗脑梗塞的药物的用途。优选，表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞是哺乳动物细胞，特别是CHO细胞，该宿 主细胞的大规模培养采用灌注反应器进行灌注培养。通过优化培养条件提高了细胞生长密 度和表达产物的糖基化程度。本发明提供了一种重组人胰激肽原酶，其中所述重组人胰激肽原酶是由238个氨 基酸残基组成一条单链，N-末端和C-末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸，分子中含 有5对S-S键，通过SDS-PAGE电泳测定，其分子量为35. 0-44. OKDa，其一级结构为
Ile-Val-Gly-Cly-Trp--Glu-Cys-Glu-Gln-His-Ser-Gln-Pro-Trp-Gln-Ala-Ala--Ieu-Tyr-His-
权利要求
一种重组人胰激肽原酶，其中所述重组人胰激肽原酶是由238个氨基酸残基组成一条单链，N 末端和C 末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸，通过SDS PAGE电泳测定，其分子量为35.0 44.0KDa，其一级结构为FSA00000140692800011.tif
2.根据权利要求1所述的重组人胰激肽原酶，该分子中含有5对S-S键，分别为 Cys7-Cysl50, Cys26-Cys42，Cys29-Cysl96, Cysl61_Cysl75 以及 Cysl86_Cys211，等电点约 为4. 0，分子中含有14. 4%的糖，结合位点分别位于Asn78、Asn84及Asnl41。
3.制备根据权利要求1所述的重组人胰激肽原酶的方法，其步骤为1)根据KLKl的DNA序列设计引物，采用RT-PCR方法从人胰腺扩增KLKlDNA序列；2)将KLKlDNA克隆到表达载体，构建含有KLKl DNA的表达质粒；3)将含有KLKlDNA表达质粒转入宿主细胞；4)用发酵方法或大规模细胞培养方法大量生产表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞，其 步骤如下a)将含有表达重组蛋白的细胞株用含有5-10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，然 后在无血清培养基中采用常规的方法进行传代适应后，小规模悬浮批次培养，置温度37°C、5% CO2培养箱内孵育生长，接种于细胞培养罐中进行细胞连续培养，接种密度为1.0X105/ ml-5. 0 XlO5Ail，培养温度37°C、pH7. 2、转速50-120rpm/min，溶解氧50%空气饱和度和通 气量 0. ILpm ；b)在无血清培养基中培养24-72小时后，将无血清培养基灌注进入生物反应器进行灌 注培养，保持残糖量在0. 8-1. 2g/L ；c)收集含有表达重组人胰激肽原酶的培养基，过滤去除细胞碎片，上清液用于重组蛋 白的纯化；5)从大量培养的表达重组人胰激肽原酶的细胞中纯化重组蛋白，该蛋白的纯化包括以 下步骤a)将含有重组人胰激肽原酶的培养基超滤浓缩后，上扩张床强阴离子交换柱，冲洗柱 子至OD28tl < 0. 2 ；用缓冲液洗脱柱子；b)在上述洗脱收集液加入(NH4)2SO4，用HCl调整pH7. 0 士0. 1上苯基交联琼脂糖快速 流凝胶，洗脱液用10000MWC0膜超滤至3L，加入90g柠檬酸钠，用HCl调pH值至7. 0士0. 2， 然后60°C恒温加热10小时，加热后将溶液调pH8. 0士0. 1，上苯扎嘧啶交联琼脂糖凝胶柱， 冲洗，洗脱。c)调节上述洗脱收集液pH4.0士0. 1，上SP琼脂糖凝胶FF柱，冲洗至流出液0D280 < 0. 15，洗脱，收集0D280 > 0. 1的洗脱流出液，将洗脱收集液调pH7. 0，用10000MWC0膜进 行超滤浓缩，得到纯化的重组人胰激肽原酶蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组人胰激肽原酶的制备方法，其中步骤1)中的KLK1DNA序 列包括cDNA、基因组DNA和人工合成的DNA。
5.根据权利要求4所述的重组人胰激肽原酶的制备方法，其中步骤2)中的表达载体包 括原核表达载体、酵母表达载体或真核表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组人胰激肽原酶的制备方法，其中步骤3)中的宿主细胞包 括原核细胞、酵母或哺乳细胞。
7.根据权利要求6所述的重组人胰激肽原酶的制备方法，其中步骤4)的a)中，所述的 接种密度为3. 0 XlO5Ail，转速为90rpm/min。
8.权利要求1-2所述的重组人胰激肽原酶在制备治疗脑梗塞的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及重组人胰激肽原酶及其制备方法。本发明的重组人胰激肽原酶利用分子生物学技术和表达重组蛋白的宿主细胞生产，进一步利用亲和层析方法纯化重组蛋白获得。重组人胰激肽原酶在临床上有多种用途，副作用明显减小。
文档编号C12N15/63GK101967468SQ20101019896
公开日2011年2月9日 申请日期2007年7月2日 优先权日2007年7月2日
发明者侯永敏, 傅和亮, 吴蓉蓉, 王晓岩 申请人:广东天普生化医药股份有限公司