专利名称：一种从木糖母液得到木糖醇与d-半乳糖醇的方法
技术领域：
本发明涉及到生物技术领域制备糖醇的方法，具体涉及通过构建木糖异构酶基因 破坏的工程菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis BSxyl (CGMCC No. 3692)净化木糖母液得 到木糖与D-半乳糖，提供了一种方便有效的从木糖母液中净化木糖以及D-半乳糖，进一步 生成木糖醇与D-半乳糖醇方法。
背景技术：
蔗渣和玉米芯酸水解液经过中和、脱色、离子交换以及浓缩等净化工艺后得到富 含木糖的糖膏，梯度降温结晶分离木糖后留下的茶褐色粘稠液体即为木糖母液。平均每结 晶分离一吨的木糖即得到一吨的木糖母液。我国目前有十余家木糖制造企业，年产木糖约 5万吨，即有约5万吨的木糖母液。木糖母液含有丰富的木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖以及 D-半乳糖，其含量依木糖母液来源以及批次不同而异。其中木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖以及 D-半乳糖的含量分别在40% -50%、15% -25%、10-20%以及7% -15%左右。由于其高糖 浓度使得其粘度很大，而且其成分较为复杂，除了含有上述单糖外，还含有大量的色素以及 胶体(应用化工，38(1) :8-10. 2009)，无法再通过现行结晶技术分离其中的木糖。因此，目 前各大制造商均以低廉的价格出售，大大降低了企业的利润。木糖母液中还含有10%左右 的D-半乳糖，D-半乳糖可以加氢合成D-半乳糖醇(也称卫矛醇)，用来制备二去水卫矛 醇、二溴二去水卫矛醇以及二乙酰去水卫矛醇，它们除了对治疗慢性粒细胞白血病具有显 著的效果外，对肺癌、骨髓瘤以及肝癌细胞也具有显著的抑制作用(中国癌症杂志，14(4) 309-312. 2004)。Bacillus subtilis 168具有代谢木糖以及半乳糖的酶系统，但是其不能在含有 木糖或者半乳糖为唯一碳源的培养基上生长，需要在含有木糖或者半乳糖的培养基中加 入L-阿拉伯糖才能进一步利用木糖或者半乳糖，进一步研究发现，加入L-阿拉伯糖后能 够诱导araE蛋白的表达，该蛋白除了能够运输L-阿拉伯糖外还能够运输木糖以及半乳糖 进入细胞(J Bacteriol. 180(12) :3250_3252· 1998)。B. subtilis 168 利用木糖、L-阿拉 伯糖以及D-半乳糖的代谢途径研究的也非常深入。枯草芽孢杆菌代谢木糖的基因组成 一个操纵子，包含三个基因，分别为木糖阻遏蛋白基因(xylose repressor, xylR)、木糖异 构酶基因(xylose isomerase, xylA)以及木酮糖激酶基因(xylulose kinase, xylB) (J Bacteriol. 171(7) :3840_3845· 1989 ;J Bacteriol. 170(7) :3102_3109· 1988)。破坏木糖 异构酶基因后，将使其不能代谢利用木糖，但仍能代谢利用葡萄糖、L-阿拉伯糖以及D-半 乳糖。由于B. subtilis 168本身利用D-半乳糖的能力较弱，因此工程菌BSxyl发酵净 化木糖母液后富集了木糖和D-半乳糖，然后进一步净化发酵液(通过离子交换、脱色)，将 净化液加氢，分别得到木糖醇以及D-半乳糖醇。再根据木糖醇与D-半乳糖醇的溶解度与 熔点的巨大差异很容易将木糖醇与D-半乳糖醇分离(木糖醇在70°C时是90g，20°C时为 51g)。通过常规的分离结晶分离到木糖醇与D-半乳糖醇。
发明内容
本发明以带有KpnI与SacI酶切位点的正向引物PxylA-F :5’_tg ggt acc atggct caa tct cat tcc agt tc_3，与反向弓I物 PxylA-R :5，_tg gag ctc t tat act tct aaa atg tattgg ttc-3，为引物，以 Bacillus subtilis 168 总 DNA 为模板，进行 PCR，将 PCR 产物(约1. 3kb)连接入pMD18 T-simple载体中，构成新质粒pMD-xyl，用KpnI与SacI酶 切 pMD-xyl，回收 KpnI/xyl/SacI 片段，用 KpnI 与 SacI 双酶切的 pBlueScript II SK(-) 连接，构成新质粒pBS-xyl，转化E. coli 5α，提取质粒用NdeI酶切，回收酶切后的线性 pBS-xyl DNA0 以正向弓丨物 Pcm-F :5，_tg cat atg agg aggatg atg aac ttt aat aaa att gat tta g_3，禾口反向弓I物 Pcm-R :5，_tg cat atg tt ata aaa gcc agtcat tag gcc_3，为 引物，以质粒PBCJ164. 3为模板进行PCRJf PCR产物连接入pMD18 T-simple载体中，构成 新质粒pMD-cm，用NdeI酶切质粒pMD-cm，回收Ndel/cm/Ndel片段，与 用NdeI酶切后的线 性pBS-xyl DNA连接，构成3. 9kb的新质粒pBS-Xyl-Cm。以下培养条件未特殊标志均为37°C，在LB平板上划线培养B. subtilis 168 ；挑 取长势良好的单菌落转接到含3ml LB液体的试管中培养过夜；从过夜培养的培养液中取 200μ 1至8ml SPI培养基中，培养至0D600为0. 8-1. 2 ；取200μ 1至2mlSPII培养基中 IOOrpm培养90分钟；加入20 μ 1 10mmol/L EGTA到培养基中，继续IOOrpm培养10分钟； 将上述处理的菌液分装成0. 5ml每管，每管加入5 μ IpBS-Xyl-Cm质粒DNA，250rpm培养90 分钟；将菌液涂布在含有10 μ g/ml氯霉素的LB平板中，培养直至单菌落出现。SP盐溶 液(0. 2%硫酸铵、1. 4%磷酸氢二钾、0. 6%磷酸二氢钾、0. 02%七水合硫酸镁、0. 柠檬酸 钠)；CAYE (IOOx) (2% Casamina acid, 10%酵母浸粉)；SPI培养基(SP盐溶液中加入1% 体积的50%葡萄糖与体积的IOOxCAYE) ；SPII培养基(SPI培养基中加入体积的 50mMCaCl2，体积的 250mMMgCl2)。挑取具有氯霉素抗性的B. subtilis 168转化菌株在含有10 μ g/ml氯霉素的LB 中培养，提取总DNA，以转化菌株DNA为模板，以PxylA-F与PxylA-R为引物进行PCR扩增， 扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳验证片段大小为1. 3kb。选取PCR验证阳性株在含有 木糖的LB液体试管中培养，以B. subtilis 168为对照培养24小时，8000rpm离心5分钟得 到菌体，超声破碎菌体细胞，进行SDS-PAGE电泳，选取不表达木糖异构酶的木糖异构酶基 因缺失株BSxyl。BSxyl细胞呈杆状，成链状排列，兼性好氧，单芽孢，芽孢椭圆或圆形，菌落呈乳白 色不透明，边缘整齐，表面有皱褶、隆起。能利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、果糖、麦芽糖、乳糖和 D-甘露糖产酸，但利用D-半乳糖的能力较弱，不能利用木糖。最适生长温度35-37°C，革兰 氏染色阳性，M. R试验、V. P试验、过氧化氢酶试验均为阳性，可利用丙二酸盐。该菌株的名 称枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSxyl，保藏号=CGMCC NO. 3692，保藏单位中国普 通微生物保藏中心，保藏日期是2010年3月25日。接种BSxyl到LB中培养过夜为一级种子，将一级种子转接到发酵培养基(12%木 糖母液，1. 0%酵母粉，0. 5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培养过夜得到二级种子，将二级种子 全部接种到发酵培养基中，200rpm培养60小时，制得含木糖与D-半乳糖的发酵液。将含木 糖与半乳糖的发酵液在SOOOrpm离心10分钟，取上清采用旋转蒸发(80°C，每分钟100转)，浓缩到含总糖浓度到30% (质量体积百分比)以上。然后依次通过阳离子大孔交换树脂以 及阴离子大孔交换树脂进行脱盐，加入2% (质量体积百分比)的粉末状活性炭脱色60分 钟以上，进一步旋转蒸发浓缩，使总糖浓度达到70% (质量百分比)以上。按2%比例加入 冰醋酸混勻，在4°C加入硼氢化钠反应4小时，即完成催化加氢的过程。离心分离晶体，晶体 中加入纯净水，不溶的为D-半乳糖醇，溶液进一步重复结晶可得到纯度大于98%的木糖醇 结晶。
具体实施方式
实施例1接种工程菌株BSxyl到IOml LB中培养过夜为一级种子，将一级种子5ml转接到 50ml发酵培养基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培养过夜 得到二级种子，将二级种子50ml全部接种到450ml相同的发酵培养基中，200rpm培养48小 时，取样检测木糖的含量与纯度。将木糖与D-半乳糖合并计算，经过48小时的净化，L-阿 拉伯糖以及葡萄糖代谢不完全，发酵液中木糖与半乳糖的总纯度达到70. 6%。实施例2接种工程菌株BSxyl到IOml LB中培养过夜为一级种子，将一级种子5ml转接到 50ml发酵培养基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培养过夜 得到二级种子，将二级种子50ml全部接种到450ml相同的发酵培养基中，200rpm培养60小 时，取样检测木糖的含量与纯度。将木糖与D-半乳糖合并计算，经过60小时的净化，L-阿 拉伯糖以及葡萄糖均代谢完全，发酵液中木糖与半乳糖的总纯度达到88. 8%。实施例3接种工程菌株BSxyl到IOml LB中培养过夜为一级种子，将一级种子5ml转接到 50ml发酵培养基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培养过夜 得到二级种子，将二级种子50ml全部接种到450ml相同的发酵培养基中，200rpm培养72小 时，取样检测木糖的含量与纯度。将木糖与D-半乳糖合并计算，经过72小时的净化，L-阿 拉伯糖以及葡萄糖均代谢完全，发酵液中木糖与半乳糖的总纯度达到89. 2%。实施例4接种工程菌株BSxyl到IOml LB中培养过夜为一级种子，将一级种子5ml转接到 50ml发酵培养基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培养过夜 得到二级种子，将二级种子50ml全部接种到450ml发酵培养基(20%木糖母液，1. 0%酵母 粉，0.5%蛋白胨，pH6.5)中，200rpm培养60小时，取样检测木糖的含量与纯度。将木糖与 D-半乳糖合并计算，经过60小时的净化，L-阿拉伯糖以及葡萄糖均代谢完全，发酵液中木 糖与半乳糖的总纯度达到87. 5%。实施例5接种工程菌株BSxyl到IOml LB中培养过夜为一级种子，将一级种子5ml转接到 50ml发酵培养基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培养过夜 得到二级种子，将二级种子50ml全部接种到450ml发酵培养基(30%木糖母液，1. 0%酵母 粉，0.5%蛋白胨，pH6.5)中，200rpm培养60小时，取样检测木糖的含量与纯度。将木糖与 D-半乳糖合并计算，经过60小时的净化，L-阿拉伯糖以及葡萄糖均代谢完全，发酵液中木糖与半乳糖的总纯度达到86. 2%。实施例6接种工程菌株BSxyl到IOml LB中培养过夜为一级种子，将一级种子5ml转接到50ml发酵培养基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培养过夜 得到二级种子，将二级种子50ml全部接种到450ml发酵培养基(40%木糖母液，1. 0%酵母 粉，0.5%蛋白胨，pH6.5)中，200rpm培养60小时，取样检测木糖的含量与纯度。将木糖与 D-半乳糖合并计算，经过60小时的净化，L-阿拉伯糖以及葡萄糖均代谢完全，发酵液中木 糖与半乳糖的总纯度达到56. 2%。实施例7接种工程菌株BSxyl到IOml LB中培养过夜为一级种子，将一级种子5ml转接到 50ml发酵培养基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培养过夜 得到二级种子，将二级种子50ml全部接种到450ml发酵培养基(40%木糖母液，1. 0%酵母 粉，0.5%蛋白胨，pH6.5)中，200rpm培养60小时，取样检测木糖的含量与纯度。将木糖与 D-半乳糖合并计算，经过72小时的净化，L-阿拉伯糖以及葡萄糖均代谢完全，发酵液中木 糖与半乳糖的总纯度达到60. 3%。实施例8接种工程菌株BSxyl到IOml LB中培养过夜为一级种子，将一级种子5ml转接到 50ml发酵培养基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培养过夜 得到二级种子，将二级种子50ml全部接种到450ml发酵培养基(30%木糖母液，1. 0%酵母 粉，0.5%蛋白胨，pH6.5)中，200rpm培养60小时，取样检测木糖的含量与纯度。将木糖与 D-半乳糖合并计算，经过72小时的净化，L-阿拉伯糖以及葡萄糖均代谢完全，发酵液中木 糖与半乳糖的总纯度达到88.2%。将含木糖与半乳糖的发酵液在SOOOrpm离心10分钟，取 上清采用旋转蒸发(80°C，每分钟100转)，浓缩到含总糖浓度到30% (质量体积百分比) 以上。然后依次通过阳离子大孔交换树脂以及阴离子大孔交换树脂进行脱盐，加入2% (质 量体积百分比)的粉末状活性炭脱色60分钟以上，进一步旋转蒸发浓缩，使总糖浓度达到 70% (质量百分比)以上。按2%比例加入冰醋酸混勻，在4°C加入硼氢化钠反应4小时，即 完成催化加氢的过程。离心分离晶体，晶体中按2被体积加入纯净水，不溶的为半乳糖醇， 反复两次，溶液进一步重复结晶可得到纯度大于98%的木糖醇与D-半乳糖醇。
权利要求
一种基于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168基因工程菌株Bsxyl，该菌株已经于2010年03月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保存编号为CGMCC No.3692。
2.如权利1要求所述出发菌株为Bacillussubtilis。
3.如权利1要求所述破坏Bacillussubtilis的木糖异构酶基因，将使其不能代谢利 用木糖，但仍能代谢利用葡萄糖、L-阿拉伯糖以及D-半乳糖，从而达到净化木糖母液得到 木糖和D-半乳糖的目的。
4.如权利1要求所述工程菌株为Bsxyl。
5.如权利3要求所述采用Bsxyl净化木糖母液得到木糖和D-半乳糖，进一步生产木糖 醇和D-半乳糖醇的目的。
6.如权利5要求所述最终净化发酵培养基中木糖母液浓度为30%以下，其他培养基成 分为1. 0%酵母粉，0. 5%蛋白胨；发酵液pH值为6. 0-7. 0 ；200rpm以上摇瓶培养或给与相 应的通气量。培养时间为60-72小时。
全文摘要
一种从木糖母液得到木糖醇与D-半乳糖醇的方法本发明公开了一种采用同源交换的方法构建枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168木糖异构酶基因(xylA)缺失株Bsxyl，利用工程菌株Bsxyl来净化木糖母液得到木糖和D-半乳糖，进一步催化加氢并结晶分离得到木糖醇与半乳糖醇的方法。Bsxyl菌株已经于2010年03月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保存编号为CGMCC No.3692，该菌种可以净化木糖母液得到木糖和D-半乳糖。该菌种可以净化含木糖母液的发酵培养液，使木糖与半乳糖的总纯度达到88.8％以上，进一步催化加氢并结晶分离得到纯度为98％以上的木糖醇与D-半乳糖醇。
文档编号C12R1/125GK101870961SQ201010198199
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者姜明国, 杨立芳, 王犇 申请人:广西民族大学