专利名称：一种与水稻抗逆性相关的OsGRAS1基因、其启动子及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种与水稻抗逆性相关的基因，具体地说，涉及一种新的水稻抗逆相关基因OsGRASI、其启动子GRASlP及其应用，属于基因工程领域。
背景技术：
水稻是我国的主要粮食作物之一，提高水稻的抗逆性对保障我国粮食产量稳定具有重要意义。利用基因工程这一分子育种技术，将抗逆基因转入当前广泛应用的优良水稻品种中，从而改良其抗逆性，培育既抗逆又高产优质的农作物新品种是水稻抗逆育种的有效途径之一。利用转录因子来调节植物对逆境的响应是提高作物抗逆性的一个研究热点。在环境胁迫下，植物体通过信号传导，启动或关闭某些相关基因，以达到抵抗逆境的目的。植物感受干旱，干旱胁迫信号经过一系列传递过程，最后诱导特定功能基因的表达。至今，已克隆出一些与植物抗逆相关的转录因子。拟南芥中，已发现的转录因子有DREBlA C和 DREB2A B，CBFl 3、Hs、AtGluR2、ATHB6、SCOF-U Atmyb2 等，水稻中的 OsSNACl (Hu et al.，2006，)，烟草中的Tsil等也为重要的转录因子。通过确定与植物抗逆性有关的信号传导中起关键作用的调控因子，从这些关键的调控因子着手，就有可能通过转基因方法有效地综合提高作物抗逆性。GRAS 转录因子家族为植物所特有，包括 GAI(gibberellic acid insensitive), RGA(repressor of GA1-3), SCL(scarecrow like)三大类，具有多变的 N-端和保守的 C-端(Di Laurenzio et al. 1996 ；Peng et al. 1997 ；Silverstone et al. 1998 ；Pysh et al. 1999 ；Bolle 2004)。GRAS基因家族产物在C-端有显著的相似性，在大约110氨基酸残余N-端有高度保守的VHllD序列。保守的C端的结构域特点是含两个富含亮氨酸区域 (LHRI及LHRII)及3个不同的氨基酸标签VHIID、PFYRE及SAW。VHllD序列在家族的成员中已被广泛认识，尽管它不是绝对的保守缬氨酸的替换，异亮氨酸和亮氨酸在1，3，4位置上发生置换，在VHllD模体的较大的区域内，P-N-H-D-Q-L残基是绝对保守的。PFYRE模体没有VHllD和SAW模体那么高度保守，但在此结构域中，序列表现较大的共线性，表明在家族成员间序列相似性水平较高。SAW模体主要有三对保守位点R_E，W-G和W-W，其中W-W 是绝对保守的，W-G和W-W之间的间隔则不是保守的。到目前为止，已经分别从水稻和拟南芥中发现了 57和33个GRAS基因，作为转录因子。GRAS蛋白参与植物根及腋芽的发育，根辐射方向结构分布，光信号转导，植物激素赤霉素信号转导和植物高度控制等多种重要的生理和发育过程。番茄的Lateral Suppressor (Ls)基因是GRAS家族成员，该基因控制着番茄的侧枝形成(Schumacher et al.，1999)。我国科学家克隆的控制水稻分蘖的基因MOCl也属GRAS家族，MOCl主要在腋芽中表达，功能是促进分蘖和促进腋芽的生长(Li et al.，2003)。本发明中的OsGRASI序列与该家族的其它成员比对结果表明，该基因具有该家族典型的结构域，属SCL类型。本发明OsGRASI基因克隆自水稻第4染色体的抗旱QTL区段， 在干旱、盐、外源ABA处理下的基因表达谱分析表明，该基因可响应逆境胁迫，该基因启动子OsGRASIP可调节基因对逆境的响应程度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的水稻抗逆相关基因OsGRASl，具有该家族典型的结构域，属SCL类型，可响应逆境胁迫。本发明的另一目的在于提供所述水稻抗逆相关基因OsGRASl的启动子GRAS1P，该基因启动子OsGRASIP可调节基因对逆境的响应程度。本发明的再一目的是提供含有水稻基因OsGRASl在提高水稻抗逆性中的应用。本发明从水稻中分离克隆的一段完整编码区段的DNA片段，对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明，它具有植物特有GRAS转录因子家族的保守结构域，因此命名为 OsGRASl。本发明分离和应用一种包含OsGRASl基因的DNA片段，该基因能响应冷、盐、外源 ABA和PEG胁迫处理，发生表达变化。本发明所述OsGRASl基因DNA序列为序列表SEQ ID NO. 1所示，或者与SEQID NO. 1 至少90%同源的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO. 1所示序列的亚片段。优选为，本发明与水稻抗逆性相关的OsGRASl基因，是SEQ ID NO. 1中第16_1拟6 位所示的DNA序列和相似性达90 %的DNA序列。本发明所述基因的编码蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID N0. 2所示，或者SEQ ID N0. 2序列的同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体，在高或低的严谨条件下能与水稻OsGRASl相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白。可以采用已克隆的OsGRASl基因为探针，从cDNA文库和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组， mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsGRASl基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsGRASl基因和OsGRASIP启动子的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得对逆境响应的转基因植株。本发明还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。携带本发明OsGRASl基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA 转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。本发明OsGRASl基因表达载体转化宿主是包括水稻在内的多种植物。本发明从水稻中分离克隆了 OsGRASl的上游调控区，并命名为启动子OsGRASIP。本发明所述OsGRASl基因的启动子OsGRASIP序列为序列表SEQ ID N0. 3所示，或者基本上相当于SEQ ID N0. 3所示的70%同源的DNA序列。优选为，所述OsGRASl基因的启动子OsGRASIP序列是SEQ ID N0. 3所示l_1370bp 序列和相似性达70 %的DNA序列。本发明所述OsGRASIP启动子序列与120份水稻材料同源序列中的其它三种序列类型相比，缺少一个CAAT-box，多出一个TATAbox，和三个顺式作用兀件，即一 个 MYB1LEPR(regulates defence-related gene expression), 一个 NTBBF1ARR0LB(Required for tissue-specific expression and auxin induction) 和一个 0SE2R00TN0DULE(organ-specific elements (OSE) characteristic of the promotersactivated in infected cells of root nodules)。本发明所述OsGRASIP启动子能在冷、盐、外源ABA和PGE处理下调节OsGRASI基因的表达。可采用已克隆的OsGRASIP启动子为探针，从基因组文库中筛选得到本发明的启动子片段或其同源序列。也可以采用PCR技术，从基因组中扩增得到本发明的OsGRASIP启动子片段以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsGRASIP启动子的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得对逆境响应的转基因植株。本发明OsGRASIP启动子可响应逆境，调节下游基因表达。因此以本发明OsGRASIP 启动子与任何感兴趣的基因构建的植物表达载体，可使其下游基因在逆境下的表达发生变化。本发明通过对水稻基因分离克隆及其对逆境胁迫的响应，提供了一种水稻DNA片断包含一个1934bp的编码基因OsGRASI及其启动子OsGRASIP。该基因含有GRAS基因家族保守结构域，为该基因家族SCL类型成员。OsGRASI基因受干旱、盐及外源ABA诱导表达， 与水稻抗逆性相关。OsGRASIP启动子序列的差异使其下游OsGRASI基因受干旱、盐及外源 ABA处理上调表达的响应时间及表达量发生变化，该启动子可用作逆境胁迫诱导的基因调控元件。本发明可以用于研究利用此基因遗传转化获得转基因植物的分子方法，及该启动子序列差异对此基因表达的影响。本发明的水稻基因及其启动子对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种， 提高植物的抗逆性。
图1-1和图1-2分别为本发明的OsGRASI基因在苗期及幼穗分化期不同干旱条件下的表达水平；图2为本发明的OsGRASI基因在苗期冷、盐、PEG和外源ABA处理下的表达水平；图3为本发明利用ClustalW2软件将OsGRASI基因预测的蛋白序列与同源蛋白序列进行比对的结果；图4为本发明的OsGRASI基因超表达载体转化水稻植株的Southern blot检测；图5为本发明的OsGRASI基因超表达载体转化水稻植株的表达水平检测；图6为本发明的OsGRASIP启动子四种不同序列类型的比对结果；图7-1，图7-2，图7-3，图7_4分别为本发明的OsGRASIP启动子四种不同序列类型 I，II，III，IV在冷、盐、外源ABA和PEG处理下，对其下游GRASl基因表达水平的调控。
具体实施例方式下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1水稻基因OsGRASI在胁迫条件下的表达分析1.干旱胁迫处理苗期IRAT109种子催芽后，在发芽盒内水培生长。三叶期后施加营养液(国际水稻所标准营养液)。待幼苗长至4叶后开始干旱处理。共设4种旱处理和对照。旱处理的方法是将幼苗从营养液中取出，用吸水纸吸干根表面水分后，置于干净滤纸上，在生长箱内 (T = ^°C，RH = 70%，遮光)放置30min，3h，8h和20h，然后快速剪取叶片和根，投入液氮中冷冻后于_80°C保存用于RNA提取。幼穗分化期采用PVC根管法。根管内径20cm，高100cm，内装入细沙。将IRAT109 种植在根管内，根管置于抗旱大棚内。分别设有水对照和干旱胁迫两种处理。有水对照保持根管表土湿润。干旱处理于植株开始进入幼穗分化时断水，同时去除根管管壁上小孔处的胶塞，以便排除根管内水分。分别于断水后2周(土壤含水量25% )、4周(土壤含水量 13% )剪取剑叶、未抽出的幼穗及根，经液氮冷冻后于_80°C保存备用。2.冷、盐、外源ABA和盐胁迫处理种子催芽后，在发芽盒内水培生长。三叶期后施加营养液(国际水稻所标准营养液)。在^°C，Wh/8h的光照培养室中培养一个月，当水稻苗长到三叶一心时做如下不同处理冷胁迫，4°C 处理 0h，0. 5h，6h，12h ；盐胁迫，200mmol/LNaCl 处理 lh, 6h, 12h, 24h ；ABA 处理，100umol/L ABA (脱落酸)溶液均勻地喷晒到水稻叶片上处理0h，0. 5h，3h，12h,24h, 20% PEG 模拟干旱处理 Oh，0. 5h，3h，12h，24h，48h。3. RNA提取与第一链cDNA合成采用植物叶RNA小量抽提试剂盒(离心柱法，上海华舜生物技术有限公司)分别提取苗期与生长后期各处理和对照的叶片、穗和根的总RNA，并测定各样品的RNA浓度 (Beckman Coulter DU 640)。每个样品取 15ug进行DNAase I (Invitrogen 公司和 Takara 公司)消化，除去RNA中残留的DNA。用反转录试剂盒(Promega公司)将去除了 DNA的RNA 样品反转录合成cDNA第一链，于_20°C保存备用。4.半定量与定量PCR分析苗期与幼穗分化期的旱胁迫处量样品采用半定量PCR法分析以水稻持家基因Actin(GenBank accession No. AY212324)为参照基因，根据其cDNA序列设计上游引物 Acf :5，-CTTCCTCATGCCATCCTGC-3，(SEQ ID N0. 4)和下游引物 Acr 5，-GCAAGCTTCTCCTTGATGTCC-3，(SEQ ID N0. 5)。分别设置 25、27、29、31 四个 PCR 循环数进行RT-PCR，从每个样品中扩增持家基因。严格控制PCR反应体系的配制，确保各PCR管内体系的一致性。各取IOuIPCR产物，在3%的TAE凝胶中电泳。DNA扩增带成像后，分析各条带的强度(Intensity)，确定各样品的最佳扩增循环数。然后，分别以各样品cDNA为模板，扩增 OsGRAS 1 基因片段，扩增前引物 Gf 1 为5 ‘ TGAACGCATCCAAGGGTATGACAAGGT3 ‘ (SEQ ID NO. 6)，扩增后引物 Grl 为5' AGGGCGGAATCCCGGCTGTGGTAAGTC3 ‘ (SEQ ID NO. 7)。 同时扩增参照基因Actin，取IOuIPCR产物，在3%的TAE凝胶中电泳。DNA扩增带成像后， 分析各条带的强度antensity)，以抗旱EST对参照基因的相对强度作为该基因的表达量。 结果表明，OsGRASI基因在苗期和幼穗分化期干旱处理后，表达量均有明显提高。对苗期的IRAT109进行干旱处理0. 5h，;3h，8h，20h，分别对OsGRASI在叶中及根中的表达进行分析 (图1-1)。发现OsGRASI基因在叶中的表达量在0. 5h时有所下降，其后呈上升趋势，并且在干旱胁迫处理20h时达到最大。在根中的表达量呈上升趋势，并且在干旱胁迫处理他时达到最大，在20h又有所下降。对幼穗分化期进行干旱处理2周和4周，分别对OsGRASI在叶、根及穗中的表达进行分析(图1-2)，发现干旱处理后在叶、根、幼穗中表达量均有明显提高，表达量最高时都能达到水处理的5-7倍。在干旱处理2周时，叶中OsGRASI基因的表达呈现上升趋势，并且在干旱4周的时候达到最大，是同时期水处理的7倍。根中OsGRASI 基因的表达也呈现上升趋势，并且响应时间比叶中更短，在干旱2周的时候即达到最大值。冷、盐、外源ABA和PEG胁迫处理样品采用定量PCR法分析PCR反应使用美国 ABI PRISM 7000定量PCR仪，使用Takara公司的定量PCR试剂盒。每一个PCR反应重复三次。反应体系包含STOR Premix Ex TaqT、2X) 12. 5 μ 1，正反向引物各0. 5 μ 1，各种处理的cDNA模板1 μ 1，加水补足体积至20μ 1。反应条件如下反应条件如下95°C lmin，然后在95°C 15s，62°C lmin，循环40次，在每个循环中62°C Imin读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其他具体操作按仪器使用说明书。定量分析结果显示(图2)，在盐、外源ABA及PEG处理下，OsGRAS 1基因的表达量总体上呈现上升表达的趋势。盐胁迫下，OsGRASI基因的表达量随时间延长，表达量上升。 外源ABA处理，OsGRASI基因的表达在30min内就达到对照的2倍，并持续到处理池。在此之后表达量有所下降，但仍高于对照。在PEG处理的早期(30min)，OsGRASl基因表达有所下降，随后明显增加，在处理4 时达到最高，是对照的3倍。OsGRASl基因受到冷胁迫呈下降表达，表达量随处理时间的延长而减少。实施例2水稻OsGRAS 1基因的克隆1.幼苗培育水稻(品种为“IRAT109”，国外引进的旱稻品种)为上海市农业生物基因中心种质资源库收集保存，将水稻置于35°C萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。2. RNA的分离按照实施例1中的方法提取RNA。3.基因的全长克隆通过PlantQTL-GE查询获得水稻第4染色体抗旱QTL区间(R1C41-RM349)内的抗旱相关EST。根据其中一条EST(Geneband accesionNo :CB096362)的序列信息，对水稻基因组及全长基因数据库进行BLAST搜索，获得其对应的全长cDNA(AK100784)和预测基因 Loc_0s04g50060。根据预测信息设计上下游引物 Gf2 (5，GAAGATTCAAGAGTCATGTT3，) (SEQ ID N0. 8)和 Gr2(5，ACAGTTTGCTAGTTTGGTTCC3，)(SEQ ID NO. 9)，从 cDNA 中直接克隆获得了 OsGRASl基因(1934bp)，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在 ABI3730 测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果经BLAST比对确认。4.水稻OsGRASI蛋白的序列信息与同源性分析本发明新的水稻OsGRASI全长cDNA的长度为1911bp，详细序列见SEQ IDN0. 1第 16-1926bp。根据全长cDNA推导出水稻OsGRASI的氨基酸序列，共636个氨基酸残基，分子量为71655. 98道尔顿，等电点(pi)为5. 51。详细序列见SEQID NO. 2。将OsGRASl蛋白序列与已克隆的植物GRAS基因氨基酸序列进行比对(ClustalW2，在线比对http://WWW. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index. html)，结果见图3，GRAS家族高度保守的区域主要包括5个可识别的模体，在VHIID和SAW模体中绝对保守的碱基已用粗体标示，PFYRE模体中的P-F-Y-R-E也用粗体标示。本发明OsGRASl具有GRAS家族特有的模体保守位点，聚类分析显示，OsGRASl为SCL类型的GRAS基因。实施例3水稻基因OsGRASl超量表达转化水稻1.利用GATEWAY重组克隆技术构建含OsGRASl基因的超量表达载体以实施例1中已获得含有旱稻IRAT109的OsGRASl基因的pGEMT-Easy载体为模板，用前引物 Gf3 :5' AAAAAGCAGGCTATGTTGGATTCTGGTT 3' (SEQ ID N0. 10)，后引物 Gr3 5' AGAAAGCTGGGTCTAGTTTGGTTCCCAT 3' (SEQ ID N0. 11)进行第一轮 PCR 扩增。再利用通用引物 attBl adapter :5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3，(SEQ ID N0. 12)。 attB2adapter :5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3(SEQ ID NO. 13)进行第二轮PCR扩增，扩增产物经回收纯化后，通过BP反应，将扩增产物片断克隆到入门载体PD0NR207，筛选阳性克隆，通过LR反应，将目的基因重组克隆到GATEWAY超表达载体pCB4004 (该载体是在中国科技大学向征斌研究员赠送的PCB2004基础上，将BASTA抗性基因(除草剂抗性基因) 替换为潮霉素抗性基因改造而来，命名为PCB4004)。具体过程如下(1)第--轮PCR扩增
步骤时间温度循环次数
预变性2分钟98 0C1
变性10秒98 0C
退火10秒60 0C10
延伸1分钟/xkb 68/72 0C
(2)第二二轮PCR扩增
取上述PCR产物IOul作为模板
步骤时间温度循环次数
预变性1分钟95 0C1
变性15秒94 0C
退火30秒45 0C5
延伸1分钟/xkb 68/72 0C
然后设置下一步的PCR程序。
步骤时间温度循环次I
变性15秒94 0C
退火30秒55 0C15-20X
延伸1 分钟/kb68/72 "C最后取5ul电泳检测PCR质量。(3) PCR产物的纯化采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行纯化。(4) BP重组反应BP反应的目的在于将含有线性attB表达克隆或attB接头的PCR产物克隆到含有attP的供体载体上以产生入门克隆。重组反应可在0. 5ml的离心管中进行，室温配制混勻。组分用量attB-PCR 产物(> IOng)l_7ulpD0NR207 载体(150ng/ul)Iul5X BP重组反应液2ulTE 缓冲液(pH 8.0)至 IOul25°C温浴l_16h。随后，在混合液中加Iul蛋白酶K 37°C温浴IOmin终止反应。最后取l-5ul BP反应液转化大肠杆菌。重组大肠杆菌需在含庆大霉素平板上生长。挑取阳性克隆，进行PCR验证，然后抽提质粒。(5) LR重组反应重组反应可在0. 5ml的离心管中进行，室温配制混勻。组分用量入门克隆(50_150ng)l_7ul目的载体(150ng/ul)Iul5X LR重组反应液2ulTE 缓冲液(pH 8. 0)至 IOul25°C温浴l_16h。随后，在混合液中加Iul蛋白酶K 37°C温浴IOmin终止反应。最后取l-5ul LR反应液转化大肠杆菌。重组大肠杆菌需在含卡那平板上生长。挑取阳性克隆，进行PCR验证，然后抽提质粒。2.农杆菌转化根癌农杆菌(EHA105)感受态细胞的制备根癌农杆菌菌液于培养至0D600 = 0. 5时，4°C离心收集菌体，用500 μ 1、 0. lmol/L冰浴CaC12重悬，冰浴30min后离心，去上清，用IOOul, 0. lmol/L冰CaC12重悬后，于4°C保存。农杆菌转化(冻融法)(1)向感受态农杆菌(IOOul)中加入5ul植物表达载体质粒DNA，轻轻混勻，冰水浴30min后，于液氮中速冻冷激aiiin ；(2)取出，加入400 800ul YEP培养液(含卡那霉素，Kan) ，200r/min振荡培养3-5h ；(3)室温离心(5000r/min，5min)，保留IOOul上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含Kan)上，28°C倒置培养2天直至长出合适大小的菌落。
(4)挑取单克隆进行PCR检测，得到阳性菌株。3.愈伤诱导种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70%的乙醇消毒1分钟，然后用次氯酸钠(1.5%有效浓度)溶液振荡消毒20min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25°C暗培养2周。愈伤诱导培养基采用表5的诱导培养基，加入0. 3g脯氨酸、0. 6g水解酪蛋白酶、 30g蔗糖和2. 5ml 2，4-D (浓度lmg/ml)，配成IL溶液，调pH至5. 9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。4.继代培养把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，250C暗培养2周。继代培养基采用表5的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g 蔗糖和anl 2，4-D (浓度lmg/ml)，配成IL溶液，调pH至5. 9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。5.农杆菌浸染和愈伤组织共培养培养农杆菌挑，取阳性单菌落，在Iml农杆菌培养液(含抗生素)中，28°C培养过夜；取以上培养物，加入50ml农杆菌培养液(含抗生素) 中，28°C培养至0D600 = 0. 6-1. 0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30min至0D600 = 0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中， 25°C暗培养5d。悬浮培养液采用表5的悬浮培养液，加入0. 08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0. 2ml 2，4-D (浓度lmg/ml)，配成IOOml溶液，调pH至5. 4，分成两瓶(每瓶50ml)，高温高压灭菌。 使用之前加入Iml 50%的葡萄糖和100 μ 1 AS(IOOmM)。共培养培养基采用表5的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和 3. Oml 2，4-D (浓度lmg/ml)，配成IL溶液，调pH至5. 6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20ml 50%的葡萄糖和Iml AS (IOOmM)。6.筛选培养共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25°C暗培养2 周，筛选两次。筛选培养基采用表6的筛选培养基，加入0. 6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2. 5ml 2，4-D (浓度lmg/ml)，配成IL溶液，调pH至6. 0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入 Iml Hn 和 Iml Cn(IOOppm)。7.分化培养挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24°C，1 / 光暗培养诱导分化芽周)。分化培养基采用表6的分化培养基，加入2. Omg/L 6_ΒΑ、2· Omg/L KT,0. 2mg/ LNAA、0· 2mg/L IAA、1. Og水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成IL溶液，调pH至6. 0，加入7g琼
脂粉，高温高压灭菌。8.生根培养待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25°C左右， 16h/ i光暗培养，诱导生根。生根培养基采用表6的生根培养基，加入30g蔗糖，配成IL溶液，调pH至5. 8， 加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。9.转化植株培养；待根系发达后，打开试管口，加入无菌水练苗2-3天后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。
表5基本培养基成分权利要求
1.一种与水稻抗逆性相关的OsGRASI基因，其特征在于，其为SEQ ID NO. 1中所示的 DNA序列，或者与SEQ ID NO. 1至少90%同源的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO. 1 所示序列的亚片段。
2.根据权利要求1所述的OsGRASI基因，其特征在于，其为SEQID NO. 1中第16_1拟6 位所示的DNA序列和相似性达90 %的DNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的OSGRASI基因，其特征在于，其氨基酸序列为序列表SEQ ID NO. 2所示，或者SEQ ID N0. 2序列的同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、 诱导突变体。
4.一种水稻启动子，它是权利要求1-3任意一项所示编码基因的启动子，其特征在于， 其DNA序列是序列表SEQ ID N0. 3所示，或者基本上相当于SEQ IDN0. 3所示的70%同源的 DNA序列。
5.根据权利要求4所述的水稻启动子，其DNA序列是SEQID N0. 3所示l_1370bp序列和相似性达70 %的DNA序列。
6.一种含有权利要求4或5所述水稻启动子的植物表达载体。
7.一种由权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.根据权利要求7所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为包括水稻在内的多种植物。
9.权利要求1-3任意一项所述基因在用于提高水稻抗逆性中的应用。
全文摘要
本发明提供一种与水稻抗逆性相关的OsGRAS1基因、其启动子及其应用。该基因含有GRAS基因家族保守结构域，为该基因家族SCL类型成员。OsGRAS1基因受干旱、盐及外源ABA诱导表达，与水稻抗逆性相关。OsGRAS1P启动子序列的差异使其下游OsGRAS1基因受干旱、盐及外源ABA处理上调表达的响应时间及表达量发生变化，该启动子可用作逆境胁迫诱导的基因调控元件。本发明的水稻基因及其启动子对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。
文档编号C12N15/82GK102277358SQ20101019780
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者丁雪峰, 刘鸿艳, 罗利军 申请人:上海市农业生物基因中心