一种利用rna恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒的利记博彩app

专利名称：一种利用rna恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及核分枝杆菌TB体外分子生物法检测领域，特别是涉及一种利用RNA恒 温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒。
背景技术：
结核分枝杆菌(M. Tuberculosis, TB)是人及动物结核病(tuberculosis)的病原 菌，属于放射菌目分枝杆菌科分枝杆菌属。可以分为人型、牛型、鸟型、鼠型、冷血动物型和 近年来发现的非洲型。对人类致病的主要为人型，牛型杆菌较少见，鸟类杆菌更少见，非典 型分枝杆菌也可引起类似结核样病变，但少见。前三型由于发现的较早，已经在1901年伦 敦国际结核病会议以后得到完全确认，被称为经典结核杆菌。对人畜威胁最大的正式经典 结核杆菌。结核杆菌为细长或微弯曲的杆菌，长1 4 μ m，宽0. 2 0. 5 μ m，呈单个或分枝 状排列，无荚膜、无鞭毛、无芽胞。在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状、串 球状、短棒状、长丝型。牛型菌比人型菌较短而粗。禽型菌具有多型性，有时呈杆状或链球 状等。结核杆菌为专性需氧菌。营养要求高，在含有蛋黄、马铃薯、甘油和天门冬素等的固 体培养基上才能生长。生长条件以37 37. 5度、pH为6. 5 6. 8最适合，生长缓慢，在固 体培养基上需要2 8周才出现肉眼可以看见的菌落。目前对结核病诊断主要依靠实验室诊断与临床体症相结合。实验室诊断主要包括 涂片检查、培养法、抗原抗体检测、PCR和TMA等。1.细菌学方法涂片镜检法将待检测或者预处理的标本涂于玻片上，固定后进行染色，待干后进 行镜检。抗酸杆菌阴性(一)连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。抗酸杆菌阳性——报告抗酸杆菌菌数1 8条/300视野——抗酸杆菌阳性⑴3 9条/100视野—抗酸杆菌阳性(++):1 9条/10视野——抗酸杆菌阳性(+++) :1 9条/每视野——抗酸杆菌阳性(++++)彡10条/每视野痰涂片直接镜检是检测抗酸杆菌(AFB)最普遍的实验室诊断方法，特异性较高， 但灵敏性较低，涂片中分枝杆菌要达到103 104CFU/ml才可检测出阳性结果，且仅能检出 1/2-3/4的活动性结核患者，漏检率相当高。培养法取消化后的痰液混勻，用无菌吸管接种在培养基斜面，接种后斜面向上于 37°C恒温培养箱内，每周观察细菌生长情况，阳性生长者经涂片萋一尼氏染色法验证后随 时报告结果，培养至8周仍未见细菌生长者，报告分枝杆菌阴性。罗氏(L0wenstein Jensen)培养法是目前检测MTB的“金标准”，但其检测周期长 (8周)，导致无法及时确诊结核患者，并无法及时治疗。
3
2.免疫学方法结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST)结核菌素通常是指旧结核菌素 (OT)和结核菌纯蛋白衍生物(PPD)，常用于结核病流行病学调查、结核菌感染情况监测、卡 介苗接种前试验、结核病辅助诊断。MTB在体内感染主要引起细胞介导的免疫反应，一直是 筛选结核分枝杆菌潜伏感染的重要方法，已被应用多年，并得到广泛的承认，虽然此方法在 世界范围内应用的非常广泛，但是从灵敏度和特异性来说，它不是一个理想的检测方法。为 预防结核而接种卡介苗的人群，将会对PPD产生假阳反应。结核病的免疫学机制主要是机体对结核分枝杆菌所引起的细胞免疫反应。人体初 次感染结核分枝杆菌后使T淋巴细胞致敏转化为记忆T淋巴细胞，当人体再次接触结核分 枝杆菌后，机体会迅速产生效应T淋巴细胞并产生多种细胞因子发挥免疫效应，其中干扰 素(IFNl)是最为关键的细胞因子。因此，检测IFN-y水平或分泌IFN-I的效应T细胞的水 平就可以判断是否存在结核感染。ELISA方法近年来血清学方法检测结核抗体倍受国内外学者关注。结核诊断尤 其是菌阴性结核病诊断仍是结核病防治中亟待研究和解决的问题。目前结核抗体仍是活动 性结核病，特别是菌阴性结核病和肺外结核病诊断中的重要辅助诊断手段。由于结核患者 免疫功能、遗传背景和接受的治疗不同而导致对MTB抗原识别的差异以及结核患者对抗原 的识别存在阶段特异性，目前任何一个单一的抗原或商品化的组合抗原检测试剂盒都无法 检测出所有结核患者血清中的抗结核抗体，筛选MTB特异性抗原，组成联合抗原是目前血 清学诊断的研究方向。目前结核杆菌抗体的检测大部分采用ELISA方法，ELISA方法具有简单、低廉的特 点，但目前许多方法还不太成熟，在特异性和灵敏度方面有待提高。随着结核分枝杆菌几种 特异性抗原的发现与纯化，实验技术的不断改进，ELISA检测血清结核抗体已在国内临床实 验应用，检测结核抗体有助于结核病的诊断和鉴别诊断。用ELISA检测结核分枝杆菌抗体 操作简单、经济，是活动性肺结核的有效诊断方法。3.分子生物学法在分枝杆菌菌种鉴定、流行病学研究、基因组比较分析、耐药性监测等方面，分子 生物学方法对结核病诊断和治疗起重要辅助作用，主要技术包括PCR、测序、指纹图谱、生物 芯片、TMA等。PCR:是一种根据核酸复制原理采用分子技术模拟细胞内核酸复制过程的体外扩 增技术，目前已发展出了巢式或套式PCR、多重PCR、逆转录PCR、嵌合荧光PCR等多种PCR技 术，PCR技术与其它分子技术相结合产生的新兴技术更是层出不穷。1989年，Hance等最先 报道将PCR技术应用于TB的检测，其突出特点是灵敏度高，可以检测出1 IOOfg纯化的 分枝杆菌DNA，相当于1 20个MTB，与传统的痰涂片抗酸染色和培养方法相比，其敏感性 得到了大大提高。此外，与传统检测方法相比，PCR检测的报告周期短，1 2天即可发出报 告，因此对于TB的早期诊断具有独到的优势，但同时该方法存在的假阳性、标本中PCR抑制 物质导致的假阴性等问题还有待进一步改进。TMA:采用转录介导的扩增技术对靶核酸进行扩增，采用化学发光物丫啶酯标记的 DNA探针与扩增的靶基因进行杂交，探针与扩增产物杂交后利用杂交保护试验去除未杂交 的标记探针，最后利用化学发光仪检测化学发光信号。由于采用了转录介导扩增技术、杂交保护检测技术和化学发光等多种敏感的分子技术，具有高度的敏感性和特异性。研究表明 TMA对涂阳TB诊断的敏感性达到92 100%，对涂阴TB诊断的敏感性也可达40 93%， 对所有临床标本检测的特异性均在95%以上，因此具有极大的应用潜力。Gen-Probe公司 的TMA检测试剂盒已获得美国FDA的批准应用于临床TB的诊断，不足之处在于操作较为复 杂，技术不易掌握，且需要配套的化学发光检测仪，因而在临床的推广应用较为困难。本公司已申请了专利核酸恒温同步放大检测方法(Simultaneous Amplification andTestiTB, SAT)(申请号200810111479. 0)；在此项技术的基础上，本发明结核分枝杆菌 (TB)核酸检测试剂盒采用的是SAT技术，核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶来 同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从DNA拷贝上 产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生 荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。该试剂盒能够检测痰液中的TBrRNA，具有特异性高、 灵敏度高和污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)的特点。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术特异性、灵敏性不高，实验污染不易 控制的缺点，提供一种超声破碎细菌菌体释放出菌体核酸RNA及恒温核酸同步放大检测技 术(SAT)对结核分枝杆菌(TB)进行检测的试剂盒。本发明的一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，包括(1) TB稀释液含0. 1 1 % RNAse抑制剂的灭菌DEPC水溶液；(2)TB反应液为dNTPs和NTPs扩增所需组份，主要包含Tris 10 50mM， MgCl2IO 40mM，dNTP 0. 5 5mM，NTP 1 10mM，PVP40 1 10%，KCl 5 40mM ；(3)TB检测液为恒温扩增时必需的引物和荧光探针溶解在TE溶液(IOmM Tris和 ImM EDTA的混合液)中配制而成，引物探针序列均选自长516bp TB 16SrRNA基因保守区， 序列见序列表SEQ. ID. N014 ； (4) SAT酶液为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含T7RNA聚合酶200 2000U/ 反应、M-MLV 反转录酶 400 4000U/ 反应、2 IOmM HEPES pH7. 5、10 100mMN-acetyl-L-cysteine>0. 04 ~ 0. 4mM zinc acetate、10 IOOmM trehalose、40 200mM Tris-HCl pH 8. 0、40 200mM KClU IOmM EDTA、2 20% (v/v)TritonX-100、 10 — 40% (v/v) glycerol ；(5) TB阳性对照；为IO2 105CFU/ml结核分枝杆菌的菌液；(6)TB阴性对照为不含有SEQ. ID. N014核酸序列或不含有结核分枝杆菌的的溶液。稀释液主要含RNase抑制剂浓度为0. 1 1 %，RNase抑制剂能够使RNase迅速失 活，有效保存RNA，超声破碎菌体使靶标RNA得到了释放，样本放在该稀释液中，延长了样本 的保存时间，稀释液组分为灭菌DEPC水和0. 1 RNase抑制剂。SAT酶液中所含的T7RNA聚合酶、M-MLV反转录酶，其稳定性直接决定了扩增反应 的扩增效率和试剂盒的使用有效期。该SAT酶液中加有稳定剂，经长期稳定性试验，稳定性 可达10个月，保证了试剂盒有效期达6个月。TB检测液中TB荧光探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子 信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相 比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。TB检测液中TB引物， 依照SAT扩增的原理设计了 5’端带有T7启动子序列尾巴的下游引物和特异的上游引物， 下游引物特异序列与靶标完全互补，上游引物与靶标完全一致，保证了本试剂盒可准确进 行TB检测的SAT反应。TB检测液中的引物包含有以下一对或几对序列TB T7 序列见序列表 SEQ. ID. NO1-5 ；TB nT7 序列见序列表 SEQ. ID. N06-10。TB检测液中的探针包含有以下一种或几种序列TB probe 序列见序列表 SEQ. ID. NOl 1-13。由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出 错误的结论，本发明的试剂盒中的TB阳性对照和TB阴性对照，均含有本试剂盒已述及TB 稀释液，其中TB阳性对照还含有一定浓度的TB菌，浓度约为IO2 105CFU/ml。使用本试 剂盒时，每次应同时做平行对照的质量控制，且结果应同时满足阳性对照dt ^ 35，阴性对 照dt无数值或为40，否则此次实验视为无效。(dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读 数，与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)TB阳性对照和TB临界弱阳性对照中的TB菌液，可以通过多种方法制备所得，其中 一种制备方法如下(1)将从中国医学细菌保藏中心购买的H37Ra(ATCC25177)标准菌株扩大培养；(2)采用细菌计数法对培养的菌液进行计数；(3)将计数的培养物用TB稀释液稀释成阳性对照，所含菌液浓度为IO2 IO5CFU/ ml ο(4)将阳性对照用TB稀释液稀释100倍成临界弱阳性对照，所含菌液浓度为1 103CFU/mL·本发明的检测试剂盒检测TB菌液的分析灵敏度为10CFU/ml，该灵敏度已完全满 足临床检验要求，故本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境 下易于降解而污染低。本发明试剂盒可用于痰液标本的检测。


图1为实施例4本发明试剂盒检测病人痰液标本的扩增图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1TB核酸RNA的提取，具体步骤为
1.取痰液1.5ml，视痰标本性状加入1 2倍体积的4%NaOH于无菌样品管中，涡 旋振荡lmin，使痰液充分勻化，室温放置15min 20min。2.样品处理管(1.5ml离心管，数量为待测样本数+2)，分别标记待处理样品编号 及阳性、阴性对照；3.取液化好的痰液标本Iml于样品处理管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入 Iml生理盐水重悬洗涤，13000rpm离心5min，弃上清，加入50 μ L TB稀释液重悬。4.将处理好的50 μ 1样本及50 μ 1阳性对照，50 μ 1阴性对照放入超声处理器中 进行超声处理15min，超声功率为300W。5.超声结束后，取2μ 1处理物加入含扩增检测液的洁净微量反应管中，此扩增检 测液包含30 μ ITB反应液和2 μ 1 TB检测液，检测液中包含的引物和探针序列分别为TB Τ7 序列见序列表 SEQ. ID. NO1-5 ；TB nT7 序列见序列表 SEQ. ID. N06-10 ；TB Probe 序列见序列表 SEQ. ID. NOl 1-13。实施例2SAT核酸扩增检测1.将含有扩增检测液的洁净微量反应管放入恒温预热装置中，60°C保温10分钟， 42°C保温5分钟；同时将SAT酶液也预热到42°C ；2.向微量反应管中加入10 μ 1已预热的酶液(加样tip头不要接触微量反应管， 如有接触请务必更换tip头)，加酶后盖上管盖1200rpm震荡15秒钟混勻；3.将微量反应管快速转至合适的恒温荧光检测仪器，42°C反应40分钟，设定每1 分钟检测一次荧光，共检测40次；4.反应结束后，直接将微量反应管取出浸泡于10% 84消毒液中，取微量反应管应 小心操作，严禁打开反应管(防止污染反应区)！实验结束后用10% 84消毒液清洁工作区 及用具，最后用清水擦拭干净。5.参考值1.阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。2. dt彡35的样本为阳性；3. 35 < dt < 40的样本建议重新检测，检测结果dt < 40的样本为阳性；4. dt无数值或为40的样本为阴性。注dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果 的Ct值类似)6.质量控制每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照 dt ( 35，阴性对照dt无数值或为40，否则此次实验视为无效。实施例3TB试剂盒各组份的配制和组装试剂盒组分TB稀释液含0. 1 1 % RNAse抑制剂的灭菌DEPC水溶液；TB 反应液含 dNTPs 和 NTPs,主要包含 Tris 10 50mM, MgCl2 10 40mM, dNTP 0. 5 5mM，NTP 1 10mM，PVP40 1 10%，KCl 5 40mM ；
SAT酶液含T7RNA聚合酶200 2000U/反应、M-MLV反转录酶400 4000U/反应、 2 IOmMHEPES pH7. 5、10 IOOmM N-acetyl-L-cysteine、0. 04 0. 4mM zinc acetate、 10 IOOmM trehalose,40 200mM Tris-HCl pH 8. 0、40 200mM KC1、1 IOmM EDTA, 2 20% (v/v) Triton X_100、10 40% (v/v) glycerol ；TB检测液含TB特异引物、特异荧光探针，引物和探针均溶解于TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)；TB阳性对照含102CFU/ml 105CFU/ml TB菌的溶液；TB阴性对照为不含有SEQ. ID. N014核酸序列或不含有结核分枝杆菌的的溶液， 用于检验操作过程及试剂的有效性。实施例4应用模式之临床样本痰液的检测本检测模式为本发明的最佳体现试剂的制备同实施例3，试剂的生产在GMP车间 进行，结核分枝杆菌痰液临床样本为常州市第三人民医院提供的临床实验样品，编号为TB 痰液标本1 8，另设阴性对照、阳性对照各一个。标本的核酸提取同实施例1，SAT扩增检 测及判定同实施例2，所使用的荧光PCR仪为MX-3005P。结果见附图1，与金标准培养法检 测结果完全相同。
权利要求
一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，包括(1)TB稀释液为含RNase抑制剂的灭菌DEPC水溶液；(2)TB反应液为含dNTPs和NTPs扩增所需组份，具体包含Tris 10～50mM，MgCl210～40mM，dNTP 0.5～5mM，NTP 1～10mM，PVP40 1～10％，KCl 5～40mM；(3)TB检测液为恒温扩增时必需的TB引物和TB荧光探针溶解在TE溶液中配制而成，引物探针序列均选自长516bp TB 16S rRNA基因保守区，序列见序列表SEQ.ID.NO14；(4)SAT酶液为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含T7RNA聚合酶200～2000U/反应、M-MLV反转录酶400～4000U/反应、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH8.0、40～200mM KCl、1～10mM EDTA、2～20％(v/v)TritonX-100、10～40％(v/v)glycerol；(5)TB阳性对照；为含102～105CFU/ml结核分枝杆菌的菌液；(6)TB阴性对照为不含有SEQ.ID.NO14核酸序列或不含有结核分枝杆菌的的溶液。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于所述(1)中的 稀释液液中RNase抑制剂的浓度为0. 1 1%，其余成分为灭菌DEPC水。
3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于所述(3)中的 TB检测液中TB荧光探针为分子信标。
4.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于所述的TB检测 液中的探针包含有以下一种或几种序列TB Probe 序列见序列表SEQ. ID.N011-13。
5.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于所述的TB检测 液中，至少一条TB引物的5’端带有T7启动子序列。
6.根据权利要求5所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于所述的引物序 列含有以下一对或几对序列TB T7 序列见序列表SEQ. ID. NO 1-5 ；TB nT7 序列见序列表 SEQ. ID. N06-10。
7.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于所述的TB阳性 对照和TB临界弱阳性对照中结核分枝杆菌菌液，制备方法包括下列步骤(1)将H37Ra标准菌株扩大培养；(2)采用细菌计数法对培养的菌液进行计数；(3)将计数的培养物用TB稀释液稀释成阳性对照，所含菌液浓度为102 105CFU/ml；(4)TB阳性对照用TB稀释液稀释100倍即为TB临界弱阳性对照，所含菌液浓度为1 103CFU/mlo
全文摘要
本发明涉及一种利用超声波破碎细菌释放出靶标RNA及恒温核酸同步放大检测技术(SAT)对结核分枝杆菌(TB)进行检测的试剂盒，包含TB稀释液、TB反应液、TB检测液、SAT酶液、TB阳性对照、TB阴性对照。本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。
文档编号C12Q1/68GK101886124SQ20101018445
公开日2010年11月17日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者于明辉, 居金良, 方亮 申请人:上海仁度生物科技有限公司