一种幽门螺杆菌尿素酶b抗原表位多肽及其应用的利记博彩app

专利名称：一种幽门螺杆菌尿素酶b抗原表位多肽及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位(UreB)蛋白B细胞抗原表位多肽及其应用。
背景技术：
1982年澳大利亚学者Warren和Marshall首次从慢性活动性胃炎病人胃黏膜中分 离并培养出幽门螺杆菌(Helicabucter pylori，H. pylori)，该菌的发现揭开了胃微生物研 究的新时代。幽门螺杆菌分布极为广泛，世界范围内人群感染率高达50%左右。业已证实， 幽门螺杆菌感染是慢性慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡的主要病因，幽门螺杆菌的持续性 感染还与胃腺癌(gastric adenocarcinoma)和胃淋巴瘤(gastric lymphoma)的发生密切 相关。1994年，世界卫生组织将它定为I类致癌因子(Type I carcinogen)。现在针对幽门螺杆菌感染的治疗主要是采用两种抗生素联合质子泵抑制剂，然 而，这一治疗手段有着诸多缺点，如花费过高，患者依从性差和产生药物抗性菌株的高风险 性等，尤其是抗生素治疗不能防止再度感染。所以，现普遍认为疫苗是在全球范围内控制幽 门螺杆菌感染的最有效的方法。早期的幽门螺杆菌疫苗研究大多应用幽门螺杆菌全菌成 分，存在着效果差、不易标准化等缺点。目前幽门螺杆菌疫苗抗原的研究集中在幽门螺杆菌 中具有免疫保护作用的抗原上。目前在小鼠模型上已证实多种幽门螺杆菌抗原，包括空泡 毒素(VacA)、细胞毒素相关蛋白(CagA)、热休克蛋白A和B (HspA和HspB)、尿素酶和过氧化 氢酶等。其中尿素酶蛋白被视为最有前途的幽门螺杆菌疫苗候选，是研究最多的一个。尿 素酶不仅对幽门螺杆菌在胃内酸性环境下定植提供保护作用，而且是幽门螺杆菌中的一种 保守蛋白，不同菌株间的保守性达98%以上。已有大量动物实验证明了它作为疫苗抗原的 安全性和有效性。尿素酶包括尿素酶A(UreA)和B(UreB)两个结构亚单位，其中UreB是尿 素酶的主要功能单位，含有尿素酶的活性位点，其保护性优于UreA。疫苗是控制感染性疾病最为经济有效的办法，疫苗接种能够刺激机体产生不同于 自然感染导致的特异性免疫应答，可以达到预防或者治疗幽门螺杆菌感染的目的。目前尿 素酶疫苗预防幽门螺杆菌感染已在许多动物模型上获得成功，国外多个研究组报告口服幽 门螺杆菌尿素酶能防止小鼠感染猫螺杆菌。迄今为止，国内外对幽门螺杆菌疫苗的研究主 要是采用模拟自然抗原的方法进行蛋白疫苗的研制，单独表达某个抗原分子或融合表达几 个抗原分子，亦或将抗原分子与粘膜免疫佐剂融合表达，可部分获得一定时期内的免疫保 护作用。目前，表位疫苗已成为研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向，且已在HIV、疟疾、 乙肝病毒、肿瘤等方面表现出独特的优势。鉴于此，在表位水平上进行选择和重组来设计疫 苗，可能会是一种有效的预防和治疗幽门螺杆菌感染的疫苗形式。利用幽门螺杆菌保护性 抗原的表位来设计疫苗，通过单个或串连表达保护性抗原上的特异性表位，并辅以能有效 诱发黏膜免疫的佐剂来激发机本更强、更特异的、不同于自然感染时的免疫应答，有可能打 破免疫耐受，从而可以达到预防或治疗幽门螺杆菌感染的目的。已经有大量实验表明，尿素酶B亚单位(UreB)不仅对幽门螺杆菌感染具有预防作用，而且还可以在一定程度上清除体内已经感染的幽门螺杆菌。研究发现针对UreB不同表 位的单抗可以抑制尿素酶的活性，从而阻断幽门螺杆菌的感染，但用完整的尿素酶免疫动 物并不能很好的抑制尿素酶的活性，因而不能完全阻止幽门螺杆菌在胃内的定植。

发明内容
本发明的目的是提供一种幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位 (UreB)蛋白B细胞抗原表位多肽及其应用。本发明提供的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位中和性B细胞抗原表位多肽，来源于幽 门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)，名称为UP32，是如下1)或2)的多肽1)由序列表中序列31所示的氨基酸序列组成的多肽；2)将序列表中序列31的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且具有幽门螺杆菌尿素酶抗原表位功能的由1)衍生的多肽。
序列表中序列31由15个氨基酸残基组成，来源于幽门螺杆菌尿素酶B亚单位 (UreB)上第158-172位氨基酸残基。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为1-10个氨基酸残 基的取代和/或缺失和/或添加；所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加可发生在上述结构域之外。上述表位多肽的编码基因也属于本发明的保护范围，所述编码基因为1)、2)、3) 或4)1)序列表中序列22的DNA ；2)编码序列表中序列31的蛋白质序列的多核苷酸；3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因。4)与序列表中序列22同源性在80%以上并且编码幽门螺杆菌尿素酶抗原表位功 能的多肽的核苷酸。上述严格条件可为用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. SDS的溶液，在DNA或者RNA 杂交实验中65°C下杂交并洗膜。序列表中的序列22由45个核苷酸组成，自5'端第1至45位核苷酸为编码序列。本发明还提供检测、预防或治疗幽门螺杆菌感染的免疫制剂，其活性成分包括上 述表位多肽，如该免疫制剂由上述表位多肽和序列表中序列34所示的表位多肽、序列表中 序列37所示的表位多肽组成多联多聚表位疫苗制剂，该免疫制剂的活性成分也可以单独 为上述序列表中序列31所示的表位多肽。本发明还提供抑制尿素酶的活性的药物，其活性 成分包括上述表位多肽和/或其抗体。如该由上述表位多肽和序列表中序列34所示的表 位多肽、序列表中序列37所示的表位多肽组成的药物；该药物活性成分也可以单独为上述 表位多肽和/或其抗体；该抗体为体外培养杂交瘤细胞系获得的抗体。本发明还提供上述幽门螺杆菌尿素酶B亚基中和性B细胞抗原表位多肽的筛选方 法，主要包括以下步骤(1)将幽门螺杆菌的UreB抗原采用截短法分段构建并进行目的蛋白的表达，通过 免疫印迹分析，初步确定单抗A1H10、B3D9、A3C10所针对的表位范围；(2)根据上述步骤(1)所确定的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体A1H10、B3D9、A3C10所针对的抗原表位所在区域，进行第二次和第三次的截短分段构建UreB抗原，将单抗A1H10、B3D9、A3C10所针对的抗原表位精确定位在UreB特定的位置；(3)化学合成上述步骤(2)鉴定出来的抗原表位，通过间接ELISA法，以进一步确 定抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体A1H10、B3D9、A3C10所针对的抗原表位。本发明运用分子生物学结合分子免疫学实验鉴定的方法，筛选得到了由15个氨 基酸残基构成的表位多肽，经济、有效，为抗原表位的筛选提供了参考。本发明为新型的多 联多聚表位疫苗的开发尊定了基础，也为基于蛋白表位的病原生物诊断试剂盒的开发及治 疗制剂的研制带来新的思路。获得的抗原表位对H. pylori发病机制的研究具有重要的意 义，有助于更有效的预防和控制幽门螺杆菌的感染。本发明提供的抗原表位多肽具有良好的免疫原性，在小鼠动物模型中可以诱导产 生针对此B细胞表位的特异性体液免疫应答，产生的抗血清不仅能够中和尿素酶的活性， 而且还能与H. pylori天然菌株的尿素酶发生特异性抗原抗体反应。同时采用血清学分析 方法证实临床感染幽门螺杆菌患者血清中产生了针对该UreB抗原表位的抗体。本发明提供的抗原表位多肽激发小鼠体内产生的抗体可抑制尿素酶活性，为尿素 酶抗原表位的研究奠定了良好的基础。本发明提供的抗原表位多肽能刺激机体产生抗幽门 螺杆菌保护性免疫反应，并可以避免产生构象表位特异性抗体，从而增强对幽门螺杆菌感 染的抑制和清除效果，对相应疫苗的研发、致病机理的研究以及临床诊断中起到很好的推 动作用。本发明的激发机体抗H. pylori的保护性免疫反应的抗原表位在体外检测和产生 免疫保护上的具有很有价值的应用。


图1不同截短UreB片段相对应的位置图(数字表示在UreB中所对应的位置，白 色条表示与单克隆抗体A1H10、B3D9或A3C10 western blot反应为阴性，灰色条表示与单 克隆抗体A1H10、B3D9或A3C10 western blot反应为阳性)图2幽门螺杆菌(H. pylori)尿素酶B亚单位各截短抗原PCR扩增结果；其中，A 泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2为目的基因UPl的PCR扩增 产物(400bp)；泳道3为目的基因UP2的PCR扩增产物(430bp)；泳道4为目的基因UP3的 PCR扩增产物(450bp)；泳道5为目的基因UP4的PCR扩增产物(660bp)；B 泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2为目的基因U21的PCR扩增 产物(IOObp)；泳道3为目的基因U22的PCR扩增产物(85bp)；泳道4为目的基因U23的 PCR扩增产物(IOObp)；泳道5为目的基因U24的PCR扩增产物(115bp)；泳道6为目的基 因U25的PCR扩增产物(115bp)；泳道7为目的基因U26的PCR扩增产物(IOObp)。 C 泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2为目的基因GST-UP32的PCR 扩增产物(60bp)；泳道3为目的基因GST-UP33的PCR扩增产物(60bp)；泳道4为目的基因 GST-UP34的PCR扩增产物(60bp)；泳道5为目的基因GST-UP36的PCR扩增产物(60bp)； 泳道6为目的基因GST-UP38的PCR扩增产物(60bp)；泳道7为目的基因GST-UP39的PCR 扩增产物(60bp) D 泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2为目的基因GST-UP31的PCR 扩增产物(330bp)；泳道3为目的基因GST-UP35的PCR扩增产物(330bp)；泳道4为目的基因GST-UP37的PCR扩增产物(330bp)；结果表明各目的基因的PCR克隆扩增效果良好。
图3为幽门螺杆菌(H. pylori)尿素酶B亚单位各截短抗原基因重组菌TPTG诱导 表达SDS-PAGE电泳图；其中，A 泳道1为蛋白质分子量标准(Marker)；泳道2为空载体菌诱导4h ；泳道3为表 达UPl基因的重组菌诱导4h ；泳道4为表达UP2基因重组菌诱导4h ；泳道5为表达UP3基 因重组菌诱导4h ；泳道6为表达UP4基因重组菌诱导4h ；B 泳道1为蛋白质分子量标准(Marker)；泳道2为宿主菌诱导4h ；泳道3为空载 体菌诱导4h ；泳道4为基因重组菌UP21诱导4h ；泳道5为基因重组菌UP22诱导4h ；泳道6 为基因重组菌UP23诱导4h ；泳道7为基因重组菌UP24诱导4h ；泳道8为基因重组菌UP25 诱导4h ；泳道9为基因重组菌UP26诱导4h ；C 泳道1为蛋白质分子量标准(Marker)；泳道2为宿主菌诱导4h ；泳道3为空载 体菌诱导4h ；泳道4为基因重组菌GST-UP32诱导4h ；泳道5为基因重组菌GST-UP33诱导 4h ；泳道6为基因重组菌GST-UP34诱导4h ；泳道7为基因重组菌GST-UP36诱导4h ；泳道8 为基因重组菌GST-UP38诱导4h ；泳道9、10为基因重组菌GST-UP39诱导4h ；D 泳道1为蛋白质分子量标准(Marker)；泳道2为宿主菌诱导4h ；泳道3为空载 体菌诱导4h ；泳道4为基因重组菌GST-UP31诱导4h ；泳道5为基因重组菌GST-UP35诱导 4h ；泳道6为基因重组菌GST-UP37诱导4h图4为截短的UreB片段与单克隆抗体A1H10、B3D9、A3C10免疫印迹图；其中，A第 一次分段表达的截短抗原(UP1、UP2、UP3和UP4)与单克隆抗体A1H10、B3D9或A3C10免疫 印迹分析；(1)UP1、UP2、UP3和UP4与单克隆抗体AlHlO的免疫印迹结果；(2)UP1、UP2、UP3 和UP4与单克隆抗体B3D9的免疫印迹结果；(3)UP1、UP2、UP3和UP4与单克隆抗体A3C10 的免疫印迹结果；B为第二次分段表达的截短抗原(UP21、UP22、UP23、UP24、UP25和UP26)与单克 隆抗体 A1H10、B3D9 或 A3C10 免疫印迹分析；(1)UP21、UP22、UP23、UP24、UP25 和 UP26 与单 克隆抗体AlHlO的免疫印迹结果；(2)UP21、UP22、UP23、UP24、UP25和UP26与单克隆抗体 B3D9的免疫印迹结果；(3)UP21、UP22、UP23、UP24、UP25* UP26与单克隆抗体A3C10的免 疫印迹结果；C 为第三次分段表达的截短抗原(GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33，GST-UP34、 GST-UP35、GST-UP36，GST-UP37、GST-UP38 和 GST-UP39)与单克隆抗体 A1H10、B3D9 或 A3C10 免疫印迹分析；(1)GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33与单克隆抗体AlHlO的免疫印迹结果； (2)GST-UP34、GST-UP35、GST-UP36 与单克隆抗体 B3D9 的免疫印迹结果；(3)GST-UP37、 GST-UP38、GST-UP39与单克隆抗体A3C10的免疫印迹结果图 5 为融合表位月太 GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38 分别与 AlHlO、B3D9、A3C10 间 接ELISA分析。图6为单克隆抗体A1H10、B3D9、A3C10对合成表位肽的识别的间接ILISA分析图7为表位肽对H. pylori病人血清的识别。A :H. pylori 病人血清与融合表位 GST_UP32、GST_UP35 和 GST-UP38 的 ELISA 反应； B :H. pylori病人血清与合成表位肽UP32、UP35和UP38的ELISA反应。图8为鼠抗融合表位肽血清对融合表位肽、合成肽、不同天然H. pylori菌株尿素酶B亚单位蛋白的识别；A抗表位血清与对应融合肽的Western blot分析；B抗表位血清与 对应合成肽的ELISA反应；C抗表位血清与天然H. pylori菌株尿素酶B亚单位蛋白ELISA 反应。图9为单克隆抗体A1H10、B3D9、A3C10及抗融合表位多抗抑制幽门螺杆菌尿素酶
活性实验。
具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1、抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体A1H10、B3D9、A3C10抗原识别 表位的鉴定通过多次截短分段表达尿素酶B片段筛选抗原表位，各次截断片段在幽门螺杆菌 尿素酶B亚单位的位置关系如图1所示。一、UreB截短蛋白的第一次分段表达及抗原表位的初步鉴定1、截短的幽门螺杆菌UreB分段抗原UPl (序列5)、UP2 (序列6)、UP3 (序列7)、 UP4(序列8)的重组表达1)幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的培养幽门螺杆菌(Helicobacter pylori) 26695 (ATCC No. 700392)采用固体培养，培养 基为空肠弯曲菌琼脂基质(中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心)43g/L、脱纤维羊血 (由市场采购活羊经颈动脉取血后用玻璃珠脱纤维处理后即得)50ml/L、抗菌素多粘菌素 B (购自Merck) 0. 38mg/L、万古霉素(购自Amresco) 10mg/L和两性霉素B (购自Sigma) 5mg/ L。37°C微需氧环境(5% O2,10% CO2,85% N2)中培养48_72hr，改良布氏肉汤收集菌体。2)幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)基因组DNA的制备幽门螺杆菌(Helicobacter pylori) 26695基因组DNA提取按照promega公司细 菌基因组提取试剂盒说明书进行。3)引物序列设计根据Genbank已公布的H. pylori国际标准株26695的基因组序列找到UreB的基 因序列(gi :21637177)，利用Primerf. 0软件设计设计4对特异性引物，在上游和下游引物 中分别加入SacI和Hind III酶切位点(下划线示酶切位点)，它们的序列如下所示扩增UPl的编码基因(序列表中序列1)的引物UP1-F CGAGCTCAAAAAGATTAGCAGAAAAG ；UPl-R CCCAAGCTTTTAAGCAGTTACGATC。扩增UP2的编码基因(序列表中序列2)的引物UP2-F CGAGCTCAATCTTAGCGTAGGTCC ；UP2-R CCCAAGCTTTTAGTCTGTGTGGATAG。扩增UP3的编码基因(序列表中序列3)的引物UP3-F CGAGCTCATCAATCATGCGTTAG ；UP3-R CCCAAGCTTTTACCAAGTTCTAGTGATA。扩增UP4的编码基因(序列表中序列4)的引物UP4-F :GAGCTCATTTTCTCAATCACCAG ；UP4-R CCCAAGCTTGAAAATGCTAAAGAGTT。4) PCR扩增目的基因以幽门螺杆菌(Helicobacter pylori) 26695株基因组DNA为模板，加入相应引物，经过30个PCR循环扩增得到UreB分段片段UPl (编码基因具有序列表中序列1的核苷 酸序列)、UP2 (编码基因有序列表中序列2的核苷酸序列)、UP3 (编码基因具有序列表中 序列3的核苷酸序列)、UP4(编码基因具有序列表中序列4的核苷酸序列)的编码基因，经 1.0%琼脂糖电泳显示，各目的片段与扩增基因的理论大小一致。各段目的基因的PCR扩增结果如图2中A所示，表明目的基因UP1、UP2、UP3、UP4 编码基因的PCR克隆扩增效果较好，分别扩增出了约400bp、430bp、450bp、660bp大小的目 的片段，经测序表明序列正确。2、分段抗原UP1、UP2、UP3、UP4表达质粒的构建及表达将步骤1扩增得到的PCR产物UP1、UP2、UP3、UP4编码基因纯化后分别用SacI 和Hind III双酶切与经同样酶双酶切的质粒pET-28a(+)(购自Merck)连接后转化E. coli DH5 α (购自天根生化)，在终浓度为50 μ g/ml卡那霉素抗性的培养基筛选后进行酶切和测序鉴定，将酶切和测序鉴定表明正确的重组载体命名为pET-UPl、pET-UP2、pET_UP3、 PET-UP4。提取重组质粒pET-UPl、pET-UP2、pET-UP3、pET-UP4并转化大肠杆菌BL21 (购自 天根生化)株，在终浓度为50 μ g/ml卡那霉素抗性的培养基筛选后，质粒进行酶切鉴定，得 到鉴定无误的表达UP1、UP2、UP3或UP4的重组菌。取鉴定无误的重组菌接种于5ml含卡 那霉素的LB培养液中，37°C摇床培养过夜。次日，将过夜培养的重组菌按1 100的比例 转种于5ml含卡那霉素的新鲜LB培养液中，37°C，200rpm培养至OD6tltl值约为0. 6时加入 IPTG至终浓度1. OmM,诱导培养4h，取Iml培养物，离心收集菌体，用80 μ 1 PBS (0. 01mol/L, pH7. 4)重悬，加入20 μ 1 5倍SDS-PAGE上样缓冲液(1L溶液中含15. Ig Tris碱，94g甘氨 酸，5gSDS)，混均后沸水中煮5分钟，离心收上清进行SDS-PAGE分析。同时，以转pET_28a (+) 的大肠杆菌BL21重组菌为对照。SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况，筛选高效表达菌株。诱导表达鉴定结果如图3中A所示，结果显示UPl在相对分子质量约18kD、UP2在 相对分子质量约20kD、UP3在相对分子质量约21kD、UP4在相对分子质量约28kD处有的特 异蛋白表达条带，与预期的融合蛋白大小一致。3, Western blot鉴定A1H10、B3D9、A3C10单克隆抗体识别的表位所在区域Western blot具体操作步骤如下按照步骤2的方法，分别培养表达UP1、UP2、UP3或UP4的重组菌，制备蛋白电泳样 品，进行15%的SDS-PAGE电泳。电泳完毕，50V电压湿转4h至NC膜上。加入含5%脱脂奶 粉的PBST室温封闭2h，PBST洗3次，每次5min。分别加入1 5000稀释的三株小鼠抗UreB 单抗B3D9(生物技术通讯，2007 ；18(2) :246_8，中国人民解放军军事医学科学院生物工程 研究所在专利保护期限内提供)、A1H10 (生物技术通讯，2007 ；18(2) :246_8，中国人民解放 军军事医学科学院生物工程研究所在专利保护期限内提供)、A3C10 (生物技术通讯，2007 ； 18(2) :246-8，中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所在专利保护期限内提供)， 室温放置lh，PBST洗3次。加入1 50000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG(Sigma)，室温 放置Ih，PBST洗3次。DAB显色。Western blot结果见图4中A，免疫印迹结果显示重组UP2蛋白与小鼠抗UreB单 抗AlHlO和B3D9发生了抗原抗体特异性结合反应，重组UP3和UP4蛋白与小鼠抗UreB单 抗A3C10发生了抗原抗体特异性结合反应，说明了单克隆抗体AlHlO和B3D9所针对的抗原 表位位于UreB蛋白UP2内，单克隆抗体A3C10所针对的抗原表位位于UP3和UP4叠加的位置。为了将三株单抗识别UreB各段的抗原表位限定到比校小的范围内，我们又将第一次表达能被这三株单抗识别的段进行第二次的表达及鉴定。二、UreB截短蛋白的第二次分段表达及抗原表位的进一步鉴定UreB截短蛋白的第二次分段表达及抗原表位的进一步鉴定所用的方法与第一次 分段表达鉴定的方法类似，所用的表达载体为PGEX-4T-2 (购自Amersham)。第二次分段分成六段UreB截短蛋白UP21 (序列表中序列15)、UP22 (序列表中 序列16)、UP23 (序列表中序列17)、UP24 (序列表中序列18)、UP25 (序列表中序列19)禾口 UP26 (序列表中序列20)，表达UP21、UP22、UP23、UP24、UP25、UP26的各编码基因引物表如 下，在上游和下游引物中分别加入EcoR I和Xho I酶切位点，下划线示酶切位点。扩增UP21编码基因(序列表中序列9)的引物对UP21F CCGGAATTCTAGATGGCGTTAAAAA ；UP21R CCGCTCGAGTCATGTGTCAATACCA。扩增UP22编码基因(序列表中序列10)的引物对UP22F CCGGAATTCTCGGTGGTATTGACA ；UP22R CCGCTCGAGTTAGGTTGTTACACCGCTT。扩增UP23编码基因(序列表中序列11)的引物对UP23F CCGGAATTCTAAGCGGTGTAACAAC ；UP23R CCGCTCGAGTTATTTTAAATTTCTTCTG。扩增UP24编码基因(序列表中序列12)的引物对UP24F CCGGAATTCTAACTATCACTCCAGGCA ；UP24R CCGCTCGAGTTACGCGTCGTTAGAAG。扩增UP25编码基因(序列表中序列13)的引物对UP25F CCGGAATTCTAGCTTCTAACGACGCG ；UP25R CCGCTCGAGTTATAACGCATGATTGATT。扩增UP26编码基因(序列表中序列14)的引物对UP26F CGGAATTCTACCTCAAACCATTGCGGC ；UP26R CCGCTCGAGTTAACCCACACGACCCATAG。PCR扩增结果如图2B所示，分别扩增出UP21、UP22、UP23、UP24、UP25、UP26编码 基因，它们的大小约1 OObp、85bp、1 OObp、115bp、115bp、1 OObp大小的目的片段。按照步骤一中的步骤2的方法分别构建表达UP21、UP22、UP23、UP24、UP25或UP26 的重组载体，只是将出发载体由PGEX-4T-2替换pET-28a(+)。鉴定表明正确的重组载体命 名为 PGEX-UP21、PGEX-UP22、PGEX-UP23、PGEX-UP24、PGEX-UP25、PGEX-UP26。按照步骤一 的步骤2所述的方法诱导表达UP21、UP22、UP23、UP24、UP25或UP26蛋白，并进行SDS-PAGE 检测重组蛋白的表达情况，筛选高效表达菌株。蛋白诱导表达鉴定结果如图3中B所示，表明基因重组菌经过诱导后，在约 28KDa 29KDa处有增加的蛋白表达条带，与目的蛋白分子量大小一致。参照步骤一的步骤3的方法进行UP21、UP22、UP23、UP24、UP25或UP26蛋白 Western blot检测，Western blot结果如图4中B所示，重组UP23蛋白能被小鼠抗UreB 单抗AlHlO识别，UP24蛋白能被小鼠抗UreB单抗B3D9识别，UP26蛋白能被小鼠抗UreB单 抗A3C10识别，出现特异性的反应条带，表明单克隆抗体AlHlO所针对的抗原表位位于UreB 蛋白UP23内，单克隆抗体B3D9所针对的抗原表位位于UP24内，单克隆抗体A3C10所针对 的抗原表位位于UP26内。为了将三株单抗识别UreB各段的抗原表位精确定位到更小的范围，同样将第二次鉴定为阳性的片段进行更小的分段鉴定。三、UreB截短蛋白的第三次分段表达及抗原表位的精确定位第三次分段分成九段UreB截短蛋白，表达引物表如下，在GST-UP32 (UP32序列为 序列表中序列31)、GST-UP33 (UP33序列为序列表中序列32)、GST-UP34 (UP34序列为序列 表中序列33)、GST-UP36 (UP36序列为序列表中序列35)、GST-UP38 (UP38序列为序列表中 序列37)、GST-UP39 (UP39序列为序列表中序列38)上游和下游引物中分别加入EcoR I和 Xho I酶切位点，在GST-UP31 (UP31序列为序列表中序列30)、GST_UP35 (UP35序列为序列表 中序列34)、GST-UP37 (UP37序列为序列表中序列36)上游和下游引物中分别加入BstB I 和Xho I酶切位点(下划线示酶切位点)扩增GST-UP31编码基因(UP31编码基因序列为序列表中序列21)的引物 对 GST-UP31F GAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCA ；GST-UP31R CCGCTCGAGATCAGCAGGACCAGTTCCGCCACCAATCATGGTTGTTACACCGCTACGCGGAACCAGATC。扩增GST-UP32编码基因(UP32编码基因序列为序列表中序列22)的引物对 GST-UP32F CGGAATTCTAGGTGGCGGAACTGGTCCTGCTGATGGC ；GST-UP32R CCGCTCGAGTCAGATAGTAGTCGCATTAGTGCCATCAGCAGGAC。扩增GST-UP33编码基因(UP33编码基因序列为序列表中序列23)的引物对 GST-UP33F CCGGAATTCTCGGCACTAATGCGACTACTATCACTCCAGGC ；GST-UP33R CCGCTCGAGCTATTTTAAATTTCTTCTGCCTGGAGTGAT。扩增GST-UP34编码基因(Up34编码基因序列为序列表中序列24)的引物对 GST-UP34F CCGGAATTCTGACTATCACTCCAGGCAGAAGAAATTTAAAA ；GST-UP34R CCGCTCGAGTTACGCTCTGAGCATCCATTTTAAATTTCT。扩增GST-UP35编码基因(UP35编码基因序列为序列表中序列25)的引物对 GST-UP35F GAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCA ；GST-UP35R CCGCTCGAGGAAACCTAAGTTCATAGAATATTCTTCAGCCGCTCTGAGCATCCAACGCGGAACCAGATC。扩增GST-UP36编码基因(UP36编码基因序列为序列表中序列26)的引物对 GST-UP36F CGGAATTCTAATGAACTTAGGTTTCTTGGCTAAAGGTAACGC ；GST-UP36R CCGCTCGAGTTACGCGTCGTTAGAAGCGTTACCTTTA。扩增GST-UP37编码基因(UP37编码基因序列为序列表中序列27)的引物对 GST-UP37F GAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCA ；GST-UP37R CCGCTCGAGCCCCATGTCATGCAAAGTGTCTTCAGCCGCAATGGTTTGAGGACGCGGAA
CCAGATC。扩增GST-UP38编码基因(UP38编码基因序列为序列表中序列28)的引物对 GST-UP38F CGGAATTCTAACTTTGCATGACATGGGGATTTTCTCAATCAC ；GST-UP38R CCGCTCGAGTTAAGAGTCAGAGCTGGTGATTGAGAAAATCC。扩增GST-UP39编码基因(UP39编码基因序列为序列表中序列29)的引物对 GST-UP39F GGAATTCTAATTTTCTCAATCACCAGCTCTGACTCTCAAGCTATGGG ；GST-UP39R CCGCTCGAGTTAACCCACACGACCCATAGCTTGA。GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、GST-UP36、GST-UP38、GST-UP39 以两个长引物直接退火合成，GST-UP31、GST-UP35、GST-UP37以PGEX-4T-2为模板，用常规PCR方法扩增得 到。PCR 扩增结果如图 2C、2D 所示，扩增出了 GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、 GST-UP36、GST-UP38、GST-UP39的编码基因约60bp大小的特异性目的片段，扩增得到 GST-UP31、GST-UP35、GST-UP37的编码基因为约330bp大小的特异性目的片段。按照步骤一中的步骤2的方法分别构建表达GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33、 GST-UP34、GST-UP35、GST-UP36、GST-UP37、GST-UP38、GST-UP39 的重组载体，只是将出发载 体由PGEX-4T-2替换pET-28a (+)。鉴定表明正确的重组载体命名为PGEX-UP31、PGEX-UP32、 PGEX-UP33、PGEX-UP34、PGEX-UP35、PGEX-UP36、PGEX-UP37、PGEX-UP38、PGEX-UP39。按 照步骤一的步骤2所述的方法构建表达GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、 GST-UP35、GST-UP36、GST-UP37、GST-UP38、GST-UP39目的蛋白的大肠杆菌工程菌，并诱导 表达 GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、GST-UP35、GST-UP36、GST-UP37、GST-UP38、 GST-UP39并进行SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况，筛选高效表达菌株。蛋白诱导表达鉴定结果如图3中C、图3中D所示，表明基因重组菌经过诱导后，在 约27KDa 28KDa处有增加的蛋白表达条带，与目的蛋白分子量大小一致。参照步骤一的步骤3 的方法对 GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、 GST-UP35、GST-UP36、GST-UP37、GST-UP38、GST-UP39进行Western blot检测，Western blot 结果如图4中C所示，结果显示重组GST-UP32蛋白与单抗AlHlO发生了特异性结合反应， GST-UP35蛋白与单抗B3D9发生了特异性结合反应，GST-UP38蛋白与单抗A3C10发生了特 异性结合反应，表明单克隆抗体AlHlO说明单抗所对应表位为GST-UP32，单克隆抗体B3D9 所对应表位为GST-UP35，单克隆抗体A3C10所对应表位为GST-UP38。四、酶联免疫吸附试验(ELISA)方法确定单抗A1H10、B3D9、A3C10的表位同时，用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法确定单抗A1H10、B3D9、A3C10的表位，将 通过GSTrap 4B亲和柱纯化的融合表位蛋白GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38分别包被ELISA 板，以检测单抗A1H10、B3D9、A3C10所针对的表位。具体操作步骤如下1、重组蛋白样品准备将上述构建的表达GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38目的蛋白的大肠杆菌工程菌于 含有相应抗生素的LB平板上划线，37°C活化16-20h ；挑单克隆接种于5ml LB培养基中， 37°C摇菌过夜；次日，以1 100(重量比)接种量转接到新鲜LB培养基中，37°C摇菌至0D600 1. 0，加入IPTG (终浓度ImM)诱导培养3_4h ；收集菌体，每升菌液约以50mL预冷 的 STE(10mM Tris HCl pH8.0、150m M NaClUmM EDTA, pH 8.0)的溶液重悬；超声破碎菌 体，15000g, IOmin离心收集上清，通过GSTrap 4B亲和柱纯化融合表位蛋白，具体是在上清 中加入适量Triton x-100至终浓度为l%，h) 0.45 μ m滤膜注射器过滤，上清4°C保存备用； 在8mL上清中加入 ImL用预冷 IX PBS(140mM NaCl, 2. 7mM KCl，10mMNa2HP04，1. 8mM KH2P04, PH 7.3)洗涤过的GST树脂，轻轻晃动令其吸附蛋白0.5h。将含有GST融合蛋白的溶液注 入已平衡好的层析柱中，当含有融合蛋白的溶液全部进入柱中时，以30倍体积的预冷PBS 洗涤，加入ImL新鲜配制的15mM的谷胱甘肽洗脱液(IOmM的谷胱甘肽、50mM的Tris-HCl中 PH8. 0)，轻轻悬起后静置lOmin，收集洗脱液，重复洗脱两次；分别取等量的含有GST融合蛋 白(PGEX-4T-2表达蛋白纯化)的流出液，洗涤液和洗脱的目的蛋白进行SDS-PAGE以分析 目的蛋白；收集含有目的蛋白的洗脱部分；然后通过PBS透析或去除游离的谷胱甘肽，样品 进行SDS-PAGE后采集凝胶照片，用BandScan5. 0软件进行分析，检测表面纯化得到的融合 蛋白纯度为90%以上。
2、用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法确定单抗A1H10、B3D9、A3C10的表位1)抗原包被用包被液分别将抗原(步骤1获得的蛋白)稀释为3 μ g/mL的混悬 液，加入ELISA板，IOOul/孔，同时设定阴性对照(即纯化的GST融合蛋白)，4°C包被过夜；2)洗涤用洗涤液PBST洗涤ELISA板各孔3次，每次5分钟，浙干；3)封闭每孔加入含5%脱脂奶粉的PBST溶液各200 μ L，置37°C孵育2h ；4)加入用保温液(含0.5%脱脂奶粉的PBST溶液)适当稀释(1 400-1 1000 倍)的单克隆抗体々1!110、830943(10，10(^1/孔，每个稀释度各加两孔。置37°C孵育2h， 洗涤同步骤2)；5)加入酶结合物(二抗)用保温液将辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗适当稀 释(1 50000)加入反应孔，每孔100 μ L。置37°C孵育lh，洗涤同步骤(2)；6)显色加入显色底物溶液，每孔100 μ L，室温避光显色5-lOmin ；7)终止反应加入终止液2M/L H2SO4,每孔50 μ L ；8)测定OD值用酶联检测仪于492nm波长测定各反应孔的OD值，记录结果；9)结果判断以纯化的GST OD492平均值作为阴性对照，融合表位蛋白OD492彡2. 1 倍阴性对照值(P/N ^ 2. 1)视为单抗所针对的抗原表位。上述反应结果与Western blot结果一致，如图5所示，表明单克隆抗体A1H10、 B3D9、A3C10与融合表位蛋白GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38发生了特异性结合反应，说明 单克隆抗体 A1H10、B3D9、A3C10 所对应的表位分别为 GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38。实施例2、合成表位多肽以进一步确证单克隆抗体A1H10、B3D9、A3C10所针对的抗 原表位1、表位肽的合成针对实施例1中所确定的单抗识别表位，采用化学合成法合成表位多肽(送北京 中科亚光生物有限公司合成)，分别命名为UP32(氨基酸序列为序列表中序列31)、UP35(氨 基酸序列为序列表中序列34)、UP38(氨基酸序列为序列表中序列37)纯度为90%以上，合 成量为4mg。2、ELISA方法确定单抗A1H10、B3D9、A3C10所针对的抗原表位
将合成的3条表位多肽UP32、UP35、UP38 (10 μ g/ml)分别包被ELISA板(IOOul/ 孔)，以检测A1H10、B3D9、A3C10单抗所针对的表位。具体操作步骤同实施例1的步骤四。反应结果如图6所示，表明单克隆抗体A1H10、B3D9、A3C10与融合表位蛋白 GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38发生了特异性结合反应，说明单克隆抗体A1H10、B3D9、 A3C10所对应的表位分别为UP32、UP35、UP38。实施例3、融合表位肽和合成表位肽与病人血清的识别实验为了检测临床感染H. pylori病人血清中是否产生针对本发明鉴定出的抗原 表位的特异性抗体，我们将实施例1制备的融合表位肽(3yg/ml)GST-UP32、GST-UP35、 GST-UP38及实施例2合成的表位肽(10μ g/ml)UP32、UP35、UP38分别包被ELISA板(IOOul/ 孔)，以本实验室收集并用S001幽门螺杆菌尿素酶检测试剂盒(胶体金法，北京康美天鸿生 物技术有限公司)鉴定为UreB阳性的病人血清3份和2份正常人血清作为一抗(1 100) 进行ELISA分析，具体操作步骤同实施例1的步骤四。 反应结果如图7所示，融合表位蛋白和合成表位肽均与3份幽门螺杆菌感染患者 血清发生了阳性反应，与2份正常人血清均不发生反应，说明幽门螺杆菌感染病人中产生 了针对本发明表位肽的抗体，这为多价表位疫苗和诊断试剂的研制提供了新的思路。实施例4、表位抗原的多克隆抗血清对合成肽和天然UreB蛋白的识别1、鼠抗血清的制备1)动物免疫选取6-8周龄的SPF级雌性BALB/C小鼠，于背部皮下多点注射实施例1中所 纯化的融合表位蛋白GST-UP32、GST-UP35及GST-UP38进行免疫，3次免疫抗原剂量均为 100μ g/只。首次免疫时将抗原加等量完全弗氏佐剂(CFA)充分混合乳化后皮下多点注射， 每隔2周再以抗原加等量不完全弗氏佐剂(IFA)乳化后加强免疫两次。同时设立只注射 PBS缓冲液(pH7. 0，50mmol/L)和GST蛋白免疫组作为对照免疫组，免疫程序相同，每组5只 小鼠。3次免疫后10天耳缘静脉采血，检测抗血清效价，达到较理想的滴度后，于免疫程序 结束后14天，取血并收集免疫后多克隆抗血清。2)间接ELISA法检测抗体效价对抗体效价的检测采用间接ELISA法进行。用纯化的GST-UP32、GST-UP35、 GST-UP38融合蛋白以包被液稀释至3 μ g/ml，包被于酶标板中，每孔100μ 1，4°C包被过 夜。次日加入不同稀释度待检抗血清，以1 100稀释的正常小鼠血清为对照，二抗为 1 50000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，显色底物为邻苯二胺(OPD)，显色结果用酶标仪在波 长490nm处进行测定，P/N大于2. 1为阳性。结果显示，三次免疫后，各实验组的抗体效价可达1 25600-1 51200，而PBS对 照组基本不与任何一个融合表位反应，说明本发明构建融合表位蛋白能够很好地激发机体 的体液免疫应答。2、ELISA法检测多克隆抗血清与不同表位合成肽和天然UreB蛋白的识别1)蛋白样品的准备(1)幽门螺杆菌的培养幽门螺杆菌国际标准菌株NCTC I 1637(购自英国的国立标准菌种收藏所 (NCTC))、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori) 26695的培养同实施例1的步骤1中的步骤1)。(2)幽门螺杆菌NCTC I 1637、26695全菌蛋白样品的制备用肉汤从幽门螺杆菌固体培养板上刮下幽门螺杆菌国际标准菌株NCTC I 1637或幽门螺杆菌(Helicobacter pylori) 26695菌体，4°C，5000g离心IOmin收集菌体，用预冷 的低盐PBS缓冲液(ρΗ7· 0，50mmol/L)洗3次，每次均为4°C，5000g离心IOmin,最后用低 盐PBS(pH7.0，50mmol/L)重悬。冰浴超声lOmin，使细胞彻底破碎。然后将溶液室温放置 0.5h，充分溶解蛋白质，SOOOg离心20min去掉不溶物。收集上清，即为全菌蛋白溶液。2)酶联免疫吸附实验检测多克隆抗血清与不同表位合成肽天然UreB蛋白的识别将实施例2合成的表位肽UP32、UP35、UP38及幽门螺杆菌NCTC I 1637,26695 全菌蛋白样品以lOOOng/lOOul/孔的量包被ELISA板。一抗为融合蛋白免疫的鼠抗血清 (1 100)，具体实验步骤同实施例1。反应结果如图8A、8B所示，结果发现，免疫的鼠抗血清能够很好地识别相应的表 位合成肽，同时也能与天然的UreB发生反应。3、多克隆抗血清与天然UreB蛋白的western blot分析将上述准备好的幽门螺杆菌26695全菌蛋白样品行SDS-PAGE电泳，转膜，然后与 实施例1中所纯化的融合表位蛋白GST-UP32、GST-UP35及GST-UP38免疫小鼠后抗血清 进行免疫印迹分析，以纯化的融合表位蛋白及截短的UreB蛋白UreBM(是UreB蛋白上第 106-377位的多肽，按照实施例1的方法表达纯化，其编码基因的扩增引物为F CGAGCTCAATCTTAGCGTAGGTCC(SacI) ；R CCCAAGCTTCCAAGTTCTAGTGATAA(Hind HL)；利用该引物，以幽门螺杆菌(Helicobacter pylori) 26695基因组为模板，扩出目标基 因片段，再插入pET28a (+)载体的SacI和Hind III酶切位点之间构建得到重组载体，将重组 载体转化BL21后表达，纯化就可以得到用于阳性对照的UreBM)作为阳性对照，同时以BSA 作为阴性对照，抗血清按1 200倍稀释其余具体操作步骤同实施例1。结果如图8C所示，抗血清与纯化的融合表位蛋白及截短的UreB蛋白UreBM发生 了阳性反应，并且与天然幽门螺杆菌26695的UreaB也发生了特异性抗原抗体反应，而与 BSA未见阳性反应发生，说明由融合表位蛋白免疫BALB/e小鼠制备的抗血清能够识别天 然的UreB蛋白，进一步说明我们鉴定出来的表位是有效的表位，可作为表位疫苗的候选分 子。实施例5、单抗及多抗血清抑制尿素酶活性试验含有尿素酶活性的提取物来自于上述制备的幽门螺杆菌NCTC 11637全菌破碎物 的离心上清。取含有尿素酶的提取物稀释于25μ 1 PBS (ρΗ7. 0)中，分别与同样稀释于25 μ 1 PBS(ρΗ7. 0)的实施例4中制备的GST-UP32、GST-UP35及GST-UP38多克隆抗血清、单克隆 抗体Α1Η10、B3D9、A3C10共孵育于酶联板中，4°C过夜。取含有500mM尿素，0. 02%酚红和 0. ImM DTT的50mM磷酸盐缓冲液(pH6. 8) 50 μ 1加于酶联孔中，室温孵育5h后测量560nm 处的OD值。同时以抗GST的多抗鼠血清、用实施例4中PBS免疫的小鼠血清作为对照。抑 制率(％)=(无抗体的OD值-加抗体后的OD值)/(无抗体的OD值)X100。试验结果如图9所示，与对照组相比，单克隆抗体A1H10、B3D9、A3C10对尿素酶 有显著的抑制作用，当剂量达到25yg时，抑制率均可达70%，GST-UP32、GST-UP35及 GST-UP38多克隆抗血清对尿素酶也有一定的抑制作用，当加入的抗体剂量为30μ g时，抑制率均可达50%，而且这种抑制具有剂量依赖性，随着加入抗体剂量的增加，抑制率呈上升 趋势。
根据以上试验可证明，本发明利用分段截短法构建分段抗原并用western blot方 法确定了各单抗所针对的抗原表位。本发明鉴定出来的表位免疫动物后，能够有效地激发 机体的特异性体液免疫应答，证实了它们具有良好免疫原性，并且产生的抗血清具有一定 的尿素酶活性抑制作用，并可以避免产生构象表位特异性抗体，增强对幽门螺杆菌感染的 抑制和清除效果，对相应疫苗的研发、致病机理的研究以及临床诊断中起到很好的推动作 用。同时，本发明的表位产生的抗血清能够和天然幽门螺杆菌菌株的尿素酶发生反应，表明 本发明的表位可以应用于蛋白表位的病原生物诊断。
权利要求
一种多肽，是如下1)或2)的多肽1)由序列表中序列31所示的氨基酸序列组成的多肽；2)将序列表中序列31的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有幽门螺杆菌尿素酶抗原表位功能的由1)衍生的多肽。
2.权利要求1所述的多肽的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为1)、2)、3)或4)1)序列表中序列22的DNA；2)编码序列表中序列31的蛋白质序列的多核苷酸；3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因。4)与序列表中序列22同源性在80%以上并且编码幽门螺杆菌尿素酶抗原表位功能的 多肽的核苷酸。
4.权利要求1所述的多肽或其编码基因在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的免疫制 剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述免疫制剂为表位疫苗制剂，优选为多 联多聚表位疫苗制剂。
6.权利要求1所述的多肽或其编码基因在制备抑制尿素酶的活性的药物中的应用。
7.权利要求1所述的多肽或其编码基因在制备幽门螺杆菌体外检测试剂中的应用
8.检测、预防或治疗幽门螺杆菌感染的免疫制剂，其活性成分包括权利要求1所述的 多肽。
9.抑制尿素酶的活性的药物，其活性成分包括权利要求1所述的多肽和/或其抗体。
10.一种筛选权利要求1所述幽门螺杆菌尿素酶B亚基中和性B细胞抗原表位多肽的 方法，主要包括以下步骤(1)将幽门螺杆菌的UreB抗原采用截短法分段构建并进行目的蛋白的表达，通过免疫 印迹分析，初步确定单抗A1H10、B3D9、A3C10所针对的表位范围；(2)根据上述步骤(1)所确定的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体A1H10、B3D9、 A3C10所针对的抗原表位所在区域，进行第二次和第三次的截短分段构建UreB抗原，将单 抗A1H10、B3D9、A3C10所针对的抗原表位精确定位在UreB特定的位置；(3)化学合成上述步骤(2)鉴定出来的抗原表位，通过间接ELISA法，以进一步确定抗 幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体A1H10、B3D9、A3C10所针对的抗原表位。
全文摘要
本发明公开了一种幽门螺杆菌尿素酶B抗原表位多肽及其应用。该抗原表位多肽，其氨基酸序列为序列表中序列31。它的编码基因序列为序列表中序列22。本发明提供的抗原表位多肽能刺激机体产生抗幽门螺杆菌保护性免疫反应，从而增强对幽门螺杆菌感染的抑制作用，提高机体清除病菌的能力，对相应疫苗的研发、致病机理的研究以及临床诊断中起到很好的推动作用。
文档编号C12Q1/68GK101863964SQ20101018224
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者刘纯杰, 王艳春, 邱炎, 陶好霞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所